Het genereren van Chimère zebravis embryo's door transplantatie

Hi, Ik ben Hillary Kemp van het laboratorium van Cecilia Owens. En ik ben Cecilia Owens. Hillary en ik zitten in de afdeling basiswetenschap bij het Fred Hutchinson Cancer Research Center in Seattle.

Vandaag laten we je een techniek zien voor het maken van chimerische zebravis-embryo's, ook bekend als genetische mozaïeken. Deze procedure stelt ons in staat om de cellulaire basis van genfunctie tijdens de ontwikkeling te beoordelen. We kunnen vragen of een bepaald gen functioneert binnen de cellen met een mutant fenotype dat bekend staat als cel-autonome functie, of binnen die cel-omgeving die bekend staat als cel-non-autonomie.

We maken deze mozaïeken door cellen te transplanteren tussen wildtype- of mutante embryo's in een blastula- of vroege gastro-stadium. Vervolgens beoordelen we de genfunctie door het fenotype en genotype van donor-afgeleide cellen in hun gastheeromgeving te observeren. Dus laten we beginnen.

In dit deel van het protocol wordt een lijnkleurstof geïnjecteerd in het donor-embryo zodat de lotgevallen van donor-afgeleide cellen kunnen worden gevolgd na transplantatie. Er kan ook een verscheidenheid aan nucleïnezuren worden geïnjecteerd met behulp van deze techniek, maar sla de decoratiestap over bij het injecteren van DNA voordat u met de embryo's werkt. Bereid een injectieschaal voor door een glazen plaatje op een hoek van 45 graden in de breedste kant van een petrischaal te steken. Driekwart vol met 1,2% aros in pen strep embryomedium.

Verwijder de plaat nadat de agro is ingesteld om een afgeschuinde trog te maken. Vul de trog met pen strep embryomedium. Ga nu verder met de enzymatische decoratie van embryo's in de encellige fase.

Incubeer de embryo's in de encellige fase gedurende één tot vijf minuten in een 0,5 milligram per milliliter. Pronase oplossing. Bewaak de decoratie nauwlettend.

Zodra het corion zichtbaar begint te instorten, dompel de embryo's onder in systeemwater En dit is het afgieten van al het corium en de embryo's blijven achter op de bodem van de kurkbuis. En het is echt belangrijk dat de embryo's niet op het wateroppervlak terechtkomen, nog een keer, en de meeste hebben hun corion eraf. Er zijn een paar die ronddraaien aan de buitenkant die dat niet doen.

Als er iets nog in zijn corion zit, dan zal het pipetten ze op deze manier eruit krijgen en vervolgens de embryo's vrijgeven zodat ze nooit op het wateroppervlak terechtkomen. Het is belangrijk om gecoate embryo's te hanteren met een pipet dat is voorzien van een vuur gepolijste punt om de randen glad te maken. Breng de kwetsbare dec-gecoate embryo's voorzichtig over in de trog van de injectieschaal met behulp van een breed borings vuur gepolijst glas pipet.

En dan laden we een enkel bestand in deze trog. Nu zijn de embryo's klaar om te worden geïnjecteerd met een lijnmarkering met behulp van een precies gekalibreerd vuur getrokken glas injectiepipet en een drukinjectie-installatie. We gaan een schaal vol embryomedium gebruiken om de naald te breken en een schaal vol olie om de naald te kalibreren.

Dit is gewoon een reguliere standaard labkwaliteit minerale olie. We nemen een paar geslepen horlogemakerstangen en terwijl we door de oogstukken kijken om te bepalen wat de juiste maat zou zijn, plaatsen we de tangen aan weerszijden van de naald en dan breken we voorzichtig de chip eraf, wat ik eigenlijk niet kan doen zonder te kijken Om het volume kleurstof of ribonucleotide te bepalen dat wordt afgegeven. Voordat je begint.

Meet de bolusgrootte in een schaal met minerale olie. De naald moet zo worden afgebroken dat een bolus van één nanoliter wordt afgegeven met één of twee pulsen van de micro-injector. Het volume van de bolus kan worden berekend uit de diameter zoals gemeten door een oogstukmicrometer.

Injecteer één nanoliter van een 1 tot 3%oplossing van fluorescerend dextran direct in de ylk van gecoate embryo's tussen de ene en vier celstadia. Wat ik ga doen, is de embryo rechts onder de naald positioneren. Ik ga de naald voorzichtig in het midden van de dooier steken en het voetpedaal indrukken.

Na het injecteren, is het belangrijk om in de dooierstromen te injecteren, zodat de kleurstof in de cellen wordt getransporteerd. Deze injectie is voldoende om cellen in chimerische embryo's door meerdere dagen ontwikkeling te volgen. Idealiter doen we dit voordat de cellen de viercellige fase bereiken, Breng de geïnjecteerde embryo's in lage dichtheid op in een gecoate petrischaal gevuld met vers pen strep embryomedium.

Merk op dat geïnjecteerde embryo's de neiging hebben om een iets langzamere ontwikkelingssnelheid te hebben, incubeer embryo's bij verschillende temperaturen, 25, 28 en 31 graden Celsius om hun ontwikkeling uit te stellen en de tijdsvenster te maximaliseren waarin transplantaties kunnen worden uitgevoerd. Het apparaat dat wordt gebruikt voor celtransplantatie in de zebravis-blastula bestaat uit een door een drive aangestuurde Hamilton-spuit die is bevestigd aan een reservoir met minerale olie en aan een micropipet-houder door een lengte flexibele buis. Verwijder alle luchtbellen uit het systeem, omdat ze uw vermogen om de zuiging en druk te beheersen zullen verpesten.

Gebruik een stereomicroscoop met hoogwaardige optica van minimaal een DX-vergroting. Om de positionering van de micropipet-houder en de naald te beheersen, raden we een NARA shige handmatige micro manipulator aan. Zorg ervoor dat deze met een magnetische basis aan de werkbank is bevestigd om trillingen te voorkomen die naar de transplantatie overgaan.

Naalden voor celtransplantatie worden gemaakt van glas capillaire pipetten die zijn getrokken tot een zachte vernauwing op een elektrodpool. Zie het JoVE-protocol van het lab van Miriam Goodman voor details over het trekken van pipetten onder een dissectiescoop, breek de punt van de getrokken naald eraf. Voor transplantaties in de blastula-fase, moet de buitendiameter van de naald ongeveer 50 tot 60 micron of 30 tot 40 micron zijn voor een gastro-fase overdracht.

Voor een gastro-fase overdracht om de penetratie te verbeteren, moet een scherpe barb op het uiteinde van de naald worden getrokken met behulp van een micro-boor, maak eerst het uite