Name: Een high-throughput-methode voor zebravis sperma cryopreservatie en In Vitro Bevruchting (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-06T19:03:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Leer een high-throughput-methode voor cryopreservatie van zebravissperma met 25% gemiddelde vruchtbaarheid. Dit protocol maakt langdurige opslag van genetisch materiaal mogelijk voor onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door NIH R01 HG002995 &quot;het bewerken van de zebravis Genoom: een reverse genetics aanpak&quot; naar CBM.

Deel A: Sperma Freezing Solutions 1. Ginsberg Fish Ringers (Zorg verse elke 3 dagen, Ginsburg, 1963) LET OP: volgorde van toevoeging is belangrijk om NEERSLAG In 450 ml steriel ddH2O te ontbinden: <ul><li> NaCl 3,25 g </li><li> KCl 0,125 g </li><li> CaCl2 • 2 H2O 0,175 g Voeg vervolgens toe: </li><li> NaHCO3 0,10 g </li></ul> Breng uiteindelijke volume tot 500 ml met een steriele ddH2O en bewaar bij 4 ° C. 2. Invriezen Medium (Make dagverse) <ol style="list-style-type:lower-roman"><li> ZONDER Methanol <ul><li> Ginsburg Fish Ringers 10 ml (kamer temp.) </li><li> Poedervorm Magere Melk 1,5 gm </li></ul></li><li> Met methanol LET OP: volgorde van toevoeging is belangrijk om NEERSLAG <ul><li> Ginsburg Fish Ringers 9 ml (kamer temp.) </li><li> Methanol 1 ml </li><li> Poedervorm Magere Melk 1,5 g </li></ul> Na het monteren van het bevriezen media, goed mengen gedurende 20 minuten. op de orbitale schudder of rocker. Voordat u, aliquot in 1 ml Eppendorf buizen, het vermijden van het oppervlak bubbels. </li></ol> Deel B: Materialen die nodig zijn voor het sperma invriezen Materialen die nodig zijn voor het sperma invriezen <ol><li> 10 ul wegwerp pipetten (Fisherbrand cat # 22 tot 358.697) </li><li> 250ml bekers voor vissen water dat MESAB / tricaïne </li><li> glazen voor horloges (Pyrex cat # 9985-75) </li><li> P20 Pipetman (of gelijkwaardig) en tips </li><li> Sponge vis houder (de mannelijke vast te houden terwijl knijpen) </li><li> Dissectiemicroscoop met bovenstaande podium belichting </li><li> Platte pincet (bijv. Millipore type) </li><li> 2,0 ml cryogene flacons (Corning cat # 430488) </li><li> 10X10 cryoboxes (Nalgene cat # 03-337-7AA) </li><li> Piepschuim container gevuld met ~ 15 cm uit fijngemalen droge ICE1 </li><li> 15 ml conische buizen (Falcon # 352099) </li><li> Dewarvat met vloeibare stikstof </li><li> Lange tang (bijv. CMS Fisher Health Care cat # 10-316B) </li><li> Cryogloves </li><li> Vuilwatertank voor mannen </li><li> Een Eppendorf buis gevuld met bevriezing media zonder methanol </li><li> Een Eppendorf buis gevuld met bevriezing media met methanol </li><li> Cryofreezer (bijv. Taylor-Warton K-serie) </li></ol> 1 Een eenvoudige methode voor het maken van fijngemalen droog ijs is om het te wikkelen in een handdoek en verpulveren met een hamer. Een meer efficiënte methode is het gebruik van een droog ijs slijpmachine, bijvoorbeeld Clawson model RE-2. Deel C: Sperma vriesmethode <ol><li> MARK capillairen: Voorafgaand aan het begin, de 10μl capillairen markeren met een lab pen op het niveau van 3,33 ui (dat wil zeggen 16,7 mm van de onderkant, zie figuur 1.1.). </li><li> Verdoven MALE: Plaats mannelijke (s) in bekerglas met MESAB / tricaïne verdund in water vissen (recept in &quot;de zebravis Book&quot;) </li><li> DRY FISH: Eenmaal onder narcose, lift vis uit de verdoving met een plastic lepel en voorzichtig dep droog vis op een papieren handdoek, met bijzondere aandacht voor het drogen van de buikzijde. Water activeert sperma dus is het belangrijk om goed droog rond de cloaca. Positie van vis op spons houder, ventrale zijde naar boven (afb. 1.2). Als regio rond anale vin is nog vochtig is, voorzichtig droog met een kimwipe. Zorg ervoor dat niet knijpen sperma voortijdig! </li><li> Plaats gemarkeerd capillair in rubber mond pipet adapter die wordt meegeleverd met capillaire buizen. De adapter is een rubberen slang die een mondstuk aan het ene uiteinde en een capillaire de houder aan de andere kant heeft. Als alternatief kan de capillaire buis worden aangesloten op een 50μl Hamilton spuit via een klein stukje van Tygon slang van de juiste diameter. </li><li> Plaats mannen onder de reikwijdte en bloot de urogenitale opening door voorzichtig het verspreiden van de buikvinnen elkaar met behulp van het einde van het capillair. </li><li> COLLECT SPERMA: Verdrijf sperma door voorzichtig aaien de zijkanten van de vis met gladde tang (bijv. Millipore), of door zachtjes knijpen de zijkanten van de vissen tussen je wijsvinger en duim. Verzamel sperma in capillair als het is uitgezet met behulp van zachte zuigkracht (afb. 1.2). Voorkomen dat uitwerpselen die kunnen worden uitgezet met sperma. </li><li> NORMALIZE spermavolume tot 3,3 pl: Als het volume van het sperma bereikt of overschrijdt pen markering op capillair (dat wil zeggen 16,7 mm of meer), ga dan naar stap 8. Als sperma volume niet bereikt doelvolume, daarna normaliseren volume tot pen markeren met behulp van Freeze medium zonder Methanol (Fig. 1.3). Minimale hoeveelheid sperma die aanvaardbaar is afhankelijk van de kwaliteit van sperma. Goed sperma is wit en ondoorzichtig. Slechte spermakwaliteit ziet er waterig. In het algemeen accepteren we als minima: 1 ui goed sperma (of 1 / 3 doel) en 2 pl slechte spermakwaliteit (of 2 / 3 doelstelling). Volume is nu genormaliseerd tot 3,3 pl. </li><li> ADD cryoprotectant om sperma: Zuig Freezing medium met Methanol op de oranje markering (ca. totaal volume is nu 20 pl;. figuur 1.4). Verdrijven sperma en cryoprotectant mengsel op schone ruimte van een horlogeglas, met speciale aandacht voor niet te introduceren bubbels. Voorzichtig mengen door en neer te pipetteren ~ 4 keer (voorkomen dat er bubbels). </li><li> PLAATS 10μl SPERMA in elk van de twee CRYOVIALS: Pipetteer 10 ul van het sperma: cryoprotectant oplossing in de bodem van twee afzonderlijke cryovials die zijn voorzien van relevante informatie (Fig. 1.5). Snel bewegen, cap flesjes en laat ze in de bodem van de kamertemperatuur 15 ml Falcon buizen-een cryovial / buis. Cap Falcon buis en steek het paar cryovial-bevattende Falcon buizen in gemalen droog ijs. </li><li> FREEZE sperma voor 20 MIN. Op droog ijs: Droog ijs moet worden in fijne poedervorm, niet pellets. De buizen moeten worden opgenomen in het droge ijs diep genoeg dat alleen hun caps show (Fig. 1.6). Om de sporen van de buizen in droog ijs te houden, geef elk paar van Falcon buizen een nummer uit 1-20 (geschreven op de caps) en noteer de tijd dat ze gaan in de droog ijs. </li><li> PLAATS CRYOVIALS in vloeibare stikstof:. Nadat het sperma ingevroren is geweest op droog ijs gedurende 20 min., over te dragen naar een vloeibare stikstof bevattende dewarvat. Sperma wordt hier opgeslagen totdat de tijd om te plaatsen in vloeibare stikstof vriezer. Bij het plaatsen in de diepvries dozen, plaats diepvries doos in een bad van vloeibare stikstof, zodat dat de monsters niet opwarmen. Gebruik lange metalen tang om flesjes te herstellen van dewarvat en met cryogloves handvat. Als alternatief kan cryovials rechtstreeks worden vervoerd van droog ijs in de vriezer in als de vriezer box wordt gehouden ondergedompeld in vloeibare stikstof in een piepschuim container. </li><li> Store cryovials lange termijn in een cryogene vloeibare stikstof vriezer. Voor een duurzaam behoud levensvatbaarheid van sperma, is het belangrijk dat flacons zijn opgeslagen ondergedompeld in vloeibare stikstof. In onze ervaring, flesjes opgeslagen in de dampfase te verliezen levensvatbaarheid in de tijd. Snelheid is belangrijk! De tijd tussen het toevoegen van de cryoprotectant en het plaatsen van sperma flacons in droog ijs (dat wil zeggen de stappen 6-10) mag niet meer dan 30 sec. </li></ol> Deel D: In Vitro Fertilisatie methode met gecryopreserveerd sperma Wij vinden dat dit het beste werkt met twee personen. Een persoon perst de eieren van de vrouwtjes, terwijl de andere persoon ontdooit het sperma. <ol><li> Stel een waterbad tot 33 ° C. </li><li> Verwijderen cryovial van vloeibare stikstof vriezer en over te dragen aan vloeibare stikstof bevattende dewarvat pas klaar om te ontdooien. </li><li> Knijp de eieren van de vrouwtjes in de 35 mm plastic petrischaal. Indien mogelijk, probeer om 3 klauwen van eieren te verkrijgen en in een gerecht te combineren. Als je niet kan krijgen drie goede koppelingen binnen 1 minuut van uw eerste koppeling, ga dan naar stap 4 (een goede koppeling is voldoende). Definitie van een goede koppeling:&gt; 150 gelijkmatig mooie eieren (dat wil zeggen geelachtig, met geen witte puin indicatief van degradatie). Houd de schaal bedekt terwijl het sperma is ontdooid. </li><li> Verwijder de flacon van vloeibare stikstof en verwijder de dop. Snel onder te dompelen flacon ~ half weg naar 33 ° C waterbad voor 8-10 sec. </li><li> Voeg snel 70 pl kamertemperatuur Hanks om flesje en meng door en neer te pipetteren. Onmiddellijk toevoegen aan de eieren en meng voorzichtig met pipetpunt. </li><li> Onverwijld te activeren sperma en eieren door de toevoeging van 750 ul vis water. Swirl te mengen. Incubeer 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Na 5 minuten, vaatwasser vullen met vis water en incubeer schotel op 28 ° C. Na 2-3 uur, tellen en overdracht vruchtbare embryo&#39;s tot 100mm gerechten (50/dish). Tel onbevruchte eieren, zodat de bevruchting frequentie kan worden bepaald. </li><li> Zorg goed voor de larven! Voor de eerste 5 dagen, dagelijks te wijzigen water en verwijder dode embryo&#39;s. Zet alleen larven die zwemblazen hebben in kwekerij op dag 5. </li></ol> Deel E: representatieve resultaten We gebruikten deze crypreservation methodologie om een ​​bibliotheek van 8600 ingevroren sperma monsters te maken voor grondbewerking tussen de jaren 2001 en 2003. We hebben ontdooid 106 van deze monsters en vastberaden hun vruchtbaarheid. Vruchtbaarheid is de verhouding van levensvatbare embryo&#39;s geproduceerd in een in vitro bevruchting gedeeld door het totaal aantal eieren die werden bevrucht met het ingevroren sperma. Verse (niet cryporeserved) sperma heeft meestal&gt; 95% vruchtbaarheid; gecryopreserveerd sperma heeft veel lagere vruchtbaarheid: een gemiddelde van 29% (n = 106 flesjes). De flacon-to-flacon variabiliteit van de vruchtbaarheid is groot, variërend van minder dan 1% tot zo hoog als 62%. Deze variabiliteit is vertegenwoordigd door de grote fout bars vertegenwoordigt standaarddeviatie in Fig. 2. Maar in 106 sperma monsters ontdooid tot nu toe hebben we slechts een keer 0% vruchtbaarheid ervaring in zowel sperma monsters en niet de bijbehorende bewerken mutatie terug te krijgen. Door het ontdooien sperma flacons uit onze bibliotheek in de loop van meerdere jaren (2001-2008) hebben we gevonden dat de gemiddelde vruchtbaarheid van sperma ingevroren monsters door deze methode blijftstabiel in de tijd (afb. 2). De gemiddelde vruchtbaarheid van ingevroren sperma monsters ontdooid in 2001 was 23,5% (gebaseerd op 11 sperma monsters) en in 2008 was 25% (gebaseerd op 21 sperma monsters). Een aantal andere onderzoekers zijn nu met dit sperma invriezen protocol in hun laboratoria. Sommigen hebben gemeld een goede succes met vruchtbaarheidscijfers en sample-to-sample variabiliteit vergelijkbaar met wat we hebben waargenomen. Anderen hebben naar verluidt niet om dit protocol te werken in hun handen. Wij zijn van mening dat de mogelijke bronnen van problemen zijn: <ol><li> Niet de exacte cryovials of conisch we hebben voorgesteld in het protocol te gebruiken, wat leidt tot een ander niveau van koeling bij in droog ijs; </li><li> Gebrek aan poeder droog ijs te gebruiken, wat leidt tot een sub-optimale koeling tarief; </li><li> Met behulp van mannelijke vissen met een slechte vruchtbaarheid: je moet minstens 1 ul van sperma te krijgen van een enkele man. U kunt ook de mannelijke vruchtbaarheid testen door het doen van een in vitro fertilisatie met vers sperma, maar dit kan misleidend zijn, omdat er is weinig vers sperma te krijgen in de buurt van 100% vruchtbaarheid. </li><li> Met behulp van sub-standaard kwaliteit van eieren in de in vitro fertilisatie. Met behulp van alles maar perfect koppelingen altijd leidt tot bijna 0% vruchtbaarheid, zelfs van sperma monsters die daadwerkelijk hebben een goede vruchtbaarheid (gebaseerd op de vruchtbaarheid van de dubbele flacon). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1395/1395fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1. Schema van sperma invriezen methodologie. <img src="/files/ftp_upload/1395/1395fig2.jpg" alt="Figuur 2" /> Figuur 2. Gecryopreserveerd sperma vruchtbaarheid blijft stabiel in de tijd. Procent vruchtbaarheid is het aantal levensvatbare embryo&#39;s geproduceerd in een in vitro bevruchting gedeeld door het totaal aantal eieren die werden bevrucht met het ingevroren sperma. &quot;N&quot; verwijst naar het aantal zaadcellen gecryopreserveerde flacons die vruchtbaarheid werd getest in het desbetreffende jaar. Foutbalken geven de standaarddeviatie. Aangezien elke sperma flacon is van een andere man, is flacon-to-flacon wordt waargenomen.

<ol><li>Ginsburg, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm-egg+association+and+its+relationship+to+activation+of+the+egg+in+salmonid+fishes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Embryol.+Exp.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Sperm-egg association and its relationship to activation of the egg in salmonid fishes.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 11, 13-33 (1963).</li>
<li>Harvey, B., Kelley, R. N., Ashwood-Smith, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+zebra+fish+spermatozoa+using+methanol%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Zoology%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of zebra fish spermatozoa using methanol.</a> Can. J. Zoology. 60, 1867-1870 (1982).</li>
</ol>

Een aantal andere onderzoekers zijn nu met dit sperma invriezen protocol in hun laboratoria. Sommigen hebben gemeld soortgelijke vruchtbaarheid en dezelfde sample-to-sample variabiliteit die we hebben waargenomen. Anderen hebben naar verluidt niet om dit protocol te werken in hun handen. Wij zijn van mening dat de mogelijke bronnen van problemen zijn: <ol><li> Niet de exacte cryovials of conisch we hebben voorgesteld in het protocol te gebruiken, wat leidt tot een ander niveau van koeling bij in droog ijs; </li><li> Gebrek aan poeder droog ijs te gebruiken, wat leidt tot een sub-optimale koeling tarief; </li><li> Met behulp van mannelijke vissen met een slechte vruchtbaarheid: je moet minstens 1 ul van sperma te krijgen van een enkele man. U kunt ook de mannelijke vruchtbaarheid testen door het doen van een in vitro fertilisatie met vers sperma, maar dit kan misleidend zijn, omdat er is weinig vers sperma te krijgen in de buurt van 100% vruchtbaarheid. Grotere, meer robuust gekleurde mannetjes meestal geven meer een hogere kwaliteit sperma. </li><li> Met behulp van sub-standaard kwaliteit van eieren in de in vitro fertilisatie. Met behulp van alles maar perfect koppelingen altijd leidt tot bijna 0% vruchtbaarheid, zelfs van sperma monsters die daadwerkelijk hebben een goede vruchtbaarheid (gebaseerd op de vruchtbaarheid van de dubbele flacon). </li></ol>

<table><tbody><tr><td>10 &amp;mu;l wegwerppipetten</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-358697</td><td></td></tr><tr><td>Horlogeglazen</td><td>Pyrex</td><td>9985-75</td><td></td></tr><tr><td>2 ml cryovials</td><td>Corning</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>10 x 10 cryoboxen</td><td>Nalge Nunc international</td><td>03-337-7AA</td><td></td></tr><tr><td>15 ml conische buizen</td><td>Falcon BD</td><td>352099</td><td></td></tr><tr><td>Tangen</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-316B</td><td></td></tr><tr><td>Cryovriezer</td><td>Taylor-Wharton</td><td>K-series</td><td>Bijvoorbeeld</td></tr></tbody></table>

een high-throughput-methode voor zebravis sperma cryopreservatie en in vitro bevruchting

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

Dit is een methode voor de zebravis sperma cryopreservatie, dat is een aanpassing van de Harvey methode (Harvey et al.., 1982). We hebben twee wijzigingen in het oorspronkelijke protocol dat zowel de procedure te stroomlijnen en te verhogen monster uniformiteit. Ten eerste hebben we normaliseren allemaal sperma volumes met bevriezing media dat niet bevat de cryoprotectant. Ten tweede, gecryopreserveerd zaadcellen worden opgeslagen in cryovials in plaats van capillaire buisjes. De tarieven van het sperma invriezen en ontdooien (δ ° C / tijd) zijn waarschijnlijk de twee belangrijkste variabelen om de controle in deze procedure. Om deze reden, niet vervangen door andere buizen voor de gespecificeerde. Werken in teams van twee is het mogelijk om bevriezing van de sperma van 100 mannen per team in ~ 2 uur. Sperma gecryopreserveerde gebruik van dit protocol is een gemiddelde van 25% vruchtbaarheid (gemeten als het aantal levensvatbare embryo&#39;s gegenereerd in een in vitro bevruchting gedeeld door het totale aantal bevruchte eieren) en dit percentage vruchtbaarheid is stabiel gedurende vele jaren.

Dit is een high-throughput sperma cryopreservatie protocol voor zebravis. Sperma gecryopreserveerde gebruik van dit protocol is een gemiddelde van 25% in de daaropvolgende vruchtbaarheid vitro fertilisatie en is stabiel gedurende vele jaren.

Een high-throughput-methode voor zebravis sperma cryopreservatie en In Vitro Bevruchting

Dit is een methode voor de cryopreservatie van zebravisperma die een aanpassing is van de Harvey-methode (Harvey et al., 1982). We hebben twee wijzigingen doorgevoerd in ...

Hallo, ik ben Bruce Draper van de University of California Davis, departement Molecular and Cellular Biology, en ik ben Cecilia Moans van de Division of Basic Science bij het Fred Hutchinson Cancer Research Center in Seattle. Vandaag gaan Cecilia en ik het protocol voor de cryopreservatie van zebravisperma demonstreren, wat een modificatie is van het oorspronkelijke Brian Harvey-protocol. We zullen laten zien dat het, door in teams van twee te werken, mogelijk is om sperma van 100 individuele mannetjes in minder dan twee uur te cryopreserveren.Hoewel de fertiliteit na het ontdooien sterk kan variëren, is de gemiddelde fertiliteit die we waarnemen 25%, en dit is afkomstig uit een bibliotheek die al meer dan zeven jaar is cryopreserveerd. Laten we beginnen. Maak eerst de spermiabvriesoplossingen voordat u deze procedure uitvoert.De Ginsburg Fish ringer-oplossing wordt elke drie dagen vers bereid, en het vriesmedium wordt dagelijks vers bereid, zowel met als zonder methanol. De samenstelling van deze oplossingen is te vinden in de online aanvullende informatie bij dit protocol. De materialen die bij deze procedure worden gebruikt, kunnen de snelheid van het vriezen en ontdooien beïnvloeden, wat op zijn beurt de fertiliteit van bevroren sperma kan beïnvloeden.Om deze reden wordt er ook een lijst met aanbevolen materialen verstrekt als aanvullende online informatie. Het is raadzaam om het sperma te invriezen op fijngecrusht droogijs in plaats van op droogijs-pellets. Een eenvoudige manier om droogijs te crushen is door het in een handdoek te wikkelen en het met een hamer te verbrijzelen.Een efficiëntere methode is het gebruik van een droogijs-molen, zoals een claws en model RE twee, om zebravisperma te vriezen. Markeer eerst capillaire buisjes van 10 µL met een laboratoriumstift op het niveau van 3,33 µL of ongeveer 16,7 mm vanaf de bodem. Om de mannetjes te anesthetiseren, plaatst u twee tot vier mannetjes in een bekerglas met verdunde trica in viswater. Het recept hiervoor kan worden gevonden in het zebravisboek.Zodra de vissen zijn gebenestheseerd, tilt u ze met een plastic lepel uit het anestheticum en dept u ze voorzichtig droog op een papieren handdoek. Besteed speciale aandacht aan het droogmaken van de ventrale zijde. Water activeert sperma, dus het is cruciaal om rond de ika grondig te drogen.Positioneer de vis met de ventrale zijde naar boven op de sponshouder. Als de regio rond de buikvinnen nog vochtig is, droog deze dan voorzichtig af met een Kim wipe. Plaats de gemarkeerde capillaire buis in een rubberen mondpipetadapter die bij de capillaire buizen is meegeleverd.De adapter is een rubberen slang met een mondstuk aan het ene uiteinde en een capillairhouder aan het andere uiteinde. Alternatief kan de capillaire buis worden verbonden met een Hamilton-spuit van 50 µL. Plaats het mannetje onder de microscoop met behulp van een kort stukje Tigon-slang van de juiste diameter en leg de urogenitale opening vrij door de bekkenvinnen voorzichtig uit elkaar te spreiden.Druk het sperma uit door met een gladde pincet voorzichtig langs de flanken van de vis te strijken of door de flanken van de vis voorzichtig tussen de wijsvinger en duim samen te knijpen; gebruik het uiteinde van een capillaire buis om het sperma bij het uitstoten met een lichte zuigkracht op te vangen. Vermijd feces die samen met het sperma kunnen worden uitgestoten. Het streefvolume van het sperma is 3,3 microliters.De minimale acceptabele hoeveelheid sperma varieert afhankelijk van de kwaliteit van het sperma. Goed sperma is wit en opaak, terwijl arm sperma er waterig uitziet. In het algemeen is de minimale acceptabele hoeveelheid sperma 1 µL goed sperma of een derde van het doelvolume, en 2 µL arm sperma of twee derde van het doelvolume.Als het spermavolume het doelvolume van 3,3 µL niet bereikt, moet het volume worden genormaliseerd tot de streep op de pen met behulp van vriesmedium zonder methanol. Als het spermavolume de streep op de capillaire buis al bereikt of overschrijdt, ga dan door naar de volgende stap. Voeg nu de cryoprotectant toe aan het sperma.Zuig vriesmedium met methanol op tot aan de oranje markering. Het totale volume is nu ongeveer 20 µL. Breng het mengsel van sperma en cryoprotectant voorzichtig over op een schoon gedeelte van een horlogeglas en meng dit door ongeveer vier keer op en neer te pipetteren, waarbij moet worden voorkomen dat er luchtbellen ontstaan.Verdeel het sperma over twee cryovials door 10 µL van de cryoprotectieve spermaoplossing in de bodem van elke gelabelde vial te pipetteren. Sluit de vials snel af en plaats elke cryovial in een aparte Falcon-buis van 15 mL. Sluit de Falcon-buizen bij kamertemperatuur af en plaats ze in fijngepoederd droogijs.De buisjes moeten diep genoeg worden ingebracht, zodat alleen de doppen zichtbaar zijn, om het overzicht over de falcon-buisjes te bewaren. Nummer ze en noteer het tijdstip waarop elk buisje in het droogijs wordt geplaatst. Laat het sperma 20 minuten bevriezen in het droogijs.Nadat het sperma is ingevroren, worden de twee cryovials overgebracht naar een Dewar-fles met vloeibare stikstof voor tijdelijke opslag. Plaats de vriesbox in een bad van vloeibare stikstof zodat de monsters niet opwarmen.Gebruik lange metalen tangen om de vials uit de Dewar-kolf te halen en hanteer deze met cryo-handschoenen. Als alternatief kunnen cryovials direct van het droogijs naar de vriezer worden overgebracht. Indien de vriezerbox voor langetermijnopslag in een piepschuimcontainer ondergedompeld in vloeibare stikstof wordt bewaard, plaats de cryovials dan in een cryogene vloeibare stikstofvriezer.Om de levensvatbaarheid van het sperma te behouden, is het cruciaal dat de vials ondergedompeld in vloeibare stikstof worden bewaard; vials die in de dampfase worden bewaard, kunnen na verloop van tijd hun levensvatbaarheid verliezen. Snelheid is eveneens van doorslaggevend belang voor het behoud van de levensvatbaarheid van het sperma. De tijd tussen het toevoegen van het cryoprotectivum en het plaatsen van de spermavials op droogijs mag niet meer dan 30 seconden bedragen bij in vitro fertilisatie.Het gebruik van cryobewaard sperma werkt het beste met twee personen. Eén persoon klemmet de eitjes uit de vrouwtjes, terwijl de andere persoon het sperma ontdooit. Stel een waterbad in op 33 °C.Haal een cryovial uit de vloeibare stikstofvriezer en breng deze over naar een vat of kolf met vloeibare stikstof tot het moment van ontdooien. Knijp de eitjes uit genetarte vrouwtjes in een plastic Petrischaal van 35 millimeter. Dit wordt uitgebreid beschreven in het JoVE-protocol met de titel Making Gyno Genetic deployed zebrafish by early pressure, waarin een gedetailleerde beschrijving van zebrafish wordt gegeven.Bij in vitro fertilisatie bevat een goede clutch meer dan 150 eieren die uniform en gelig zijn. Elk wit residu is indicatief voor degradatie. Probeer indien mogelijk drie clutches eieren te verkrijgen en deze in één schaal te combineren.Als er binnen één minuut na de eerste clutch geen drie goede clutches zijn verkregen, ga dan door naar de volgende stap. Houd de schaal afgedekt terwijl het sperma ontdooit. Verwijder ondertussen het vials uit de vloeibare stikstof en verwijder de dop.Dompel het vial snel gedurende acht tot 10 seconden tot de helft onder in een waterbad van 33 °C. Voeg snel 70 µL kamertemperatuur, Hank's gebufferde zoutoplossing toe aan het vial en meng door te pipetteren; voeg dit onmiddellijk toe aan de eitjes in de Petrischaal en meng voorzichtig met de pipetpunt. Activeer vervolgens onmiddellijk de sperma en eitjes door 750 µL viswater toe te voegen, draai het mengsel om en incubeer vijf minuten bij kamertemperatuur.Vul na vijf minuten de schaal met vissen en water en incubeer bij 28 °C. Tel na twee tot drie uur de levensvatbare embryo's en breng deze over naar schalen van 100 mm, met 50 embryo's per schaal. Tel daarnaast het aantal bevruchte eieren, zodat de fertiliteit van het spermaproefmonster kan worden bepaald.Spermafertiliteit is de verhouding tussen levensvatbare embryo's en het totale aantal eicellen dat is gebruikt voor de in vitro fertilisatie. Eicellen kunnen op elk moment tussen twee en zes uur na de in vitro fertilisatie worden gesorteerd. Wanneer infertiele eicellen gemakkelijk te onderscheiden zijn van levensvatbare embryo's, zijn de infertiele eicellen helder en ongedeeld.Wanneer bekeken met trans-illuminatie op een stereomicroscoop, varieert de gemiddelde fertiliteit van cryopreservated sperma sterk. Het zou echter mogelijk moeten zijn om een gemiddelde fertiliteit van 25% te bereiken die gedurende meerdere jaren stabiel blijft. Deze grafiek toont het gemiddelde fertiliteitspercentage van sperma dat is ingevroren tussen 2001 en 2003 en is ontdooid tot recent als 2008.We hebben zojuist een methode met een hoge doorvoer gedemonstreerd voor de cryopreservatie van visperma. Bij het uitvoeren van dit protocol is het belangrijk om al het aanbevolen plastic materiaal en de apparatuur te gebruiken, en om gepulveriseerd, verbrijzeld droogijs te gebruiken in plaats van droogijs-pellets. Het is essentieel om sperma en eitjes van zeer hoge kwaliteit te gebruiken; in het geval van de eitjes bij de in vitro fertilisatie na het ontdooien van het sperma, is het belangrijk om een zo groot mogelijk aantal eitjes te gebruiken om het aantal vruchtbare embryo's aan het einde van het proces te verhogen, waarvoor mogelijk drie tot vier vrouwtjes nodig zijn.Een ander essentieel onderdeel van het protocol is de snelheid. Het mag nooit langer duren dan ongeveer een minuut om van het uitdrukken van het sperma van het mannetje naar het plaatsen ervan in het droogijs te gaan. Nou, ik denk dat dit alles is.Veel succes met uw experimenten.

a-high-throughput-method-for-zebrafish-sperm-cryopreservation-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De zebravis is een krachtig modelsysteem voor ontwikkelingsbiologie en onderzoek naar menselijke ziekten vanwege hun genetische overeenkomsten met hogere gewervelde dieren. Dit protocol beschrijft een methodologie om haploïde zebravis-embryo's te creëren die kunnen worden gebruikt voor forward screen-strategieën om recessieve mutaties in genen die essentieel zijn voor vroege embryogenese te identificeren.

Productie van Haploid zebravis embryo&#39;s door<em&gt; In Vitro</em&gt; Bemesting

Dit protocol beschrijft een methode voor het isoleren van enkele cellen uit zebravis-embryo's, het verrijken van cellen van belang, het vastleggen van zebraviscellen in microfluïdische gebaseerde enkelcellige multiplexsystemen en het beoordelen van genexpressie uit enkele cellen.

Isolatie en karakterisering van enkele cellen van zebravis embryo&#39;s

Een gewijzigde protocol voor ploïdie manipulatie maakt gebruik van een heat shock naar een één-cyclus kraam in cytokinese induceren in de vroege embryo. Dit protocol wordt gedemonstreerd in de zebravis, maar kan voor andere soorten.

Ploïdie Manipulatie van zebravis embryo&#39;s met Heat Shock 2 Treatment

Het belangrijkste doel van deze studie was aan te passen de naald ondergedompeld verglazing (NIV) procedure om te cryopreserve hele zebrafish teelballen. Daarnaast is de herhaalbaarheid van de methode in vijf verschillende zebrafish stammen was getest.

Cryopreservatie van zebravis testis van hele Testes Needle ondergedompeld Ultra snelle koeling

Cilia ontwikkeling is essentieel voor goede organogenese. Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerde methode om te etiketteren en ciliated cellen van de zebravis visualiseren.

Visualiseren van Multiciliated cellen in de zebravis via een gecombineerde Protocol van hele Mount fluorescentie In Situ hybridisatie en immunofluorescentie

Zebravis onlangs gewend waren als een modelsysteem in vivo DNA replicatie timing tijdens ontwikkeling bestuderen. Hier is gedetailleerde de protocollen voor het gebruik van embryo's de zebravis profiel replicatie timing. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast om te bestuderen van replicatie timing mutanten, individuele celtypes, ziekte modellen en andere soorten.

Profilering van DNA replicatie Timing met behulp van de zebravis als een modelsysteem In Vivo

Dit protocol toont sequentiële immunofluorescentie en immunohistochemie op cryosecties van in het beginstadium zebravis-embryo's die precieze colokalisatie analyses in specifieke celpopulaties mogelijk maken.

Sequentiële immunofluorescentie en immunohistochemie op Gecryode zebravis-embryo's

Hier gepresenteerd is een protocol voor whole-mount in situ RNA hybridisatie analyse in zebravis en buisvorming test in patiënt-afgeleide geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide endotheelcellen om de rol van endoglin in vasculaire vorming te bestuderen.

Whole-Mount In Situ Hybridisatie in Zebrafish Embryo's en Tube Formation Assay in iPSC-ECs om de rol van Endoglin in vasculaire ontwikkeling te bestuderen

Hier presenteren we een protocol voor fluorescerende antilichaamgemedieerde detectie van eiwitten in hele preparaten van zebravissen embryo's en larven.

Hele mount immunohistochemie in zebravissen embryo's en larven

Dit protocol beschrijft hoe beelden kunnen worden verkregen door in situ hybridisatie en immunohistochemie van embryonale secties van zebravissen te combineren. In situ hybridisatie werd uitgevoerd voorafgaand aan cryosectie, gevolgd door antilichaamkleuring. Het is nuttig om de expressiepatronen van twee genen in zebravissen te detecteren als er een tekort aan antilichamen is.

Ter plaatse Hybridisatie gecombineerd met immunohistochemie in cryosectie zebravisembryo's

Dit protocol beschrijft een goedkope lichtmicroscopiemethode om de cardiale morfologie en functie in zebravisembryo's te beoordelen, waardoor een reproduceerbare evaluatie van ontwikkelingscardiotoxiciteit mogelijk is zonder dat er geavanceerde beeldvormingssystemen nodig zijn.

Functionele cardiale beeldvorming in zebravisembryo's met behulp van standaardmicroscopie en videoanalyse: toepassingen in milieu- en biomedisch onderzoek

Leer een high-throughput-methode voor cryopreservatie van zebravissperma met 25% gemiddelde vruchtbaarheid. Dit protocol maakt langdurige opslag van genetisch materiaal mogelijk voor onderzoek.

Een high-throughput-methode voor zebravis sperma cryopreservatie en In Vitro Bevruchting

Meer video's verkennen