Een high-throughput-methode voor zebravis sperma cryopreservatie en In Vitro Bevruchting
6 juli 2009
Dit is een high-throughput sperma cryopreservatie protocol voor zebravis. Sperma gecryopreserveerde gebruik van dit protocol is een gemiddelde van 25% in de daaropvolgende vruchtbaarheid vitro fertilisatie en is stabiel gedurende vele jaren.
Hallo, ik ben Bruce Draper van de University of California Davis, afdeling Moleculaire en Cellulaire Biologie, en ik ben Cecilia Moans van de Afdeling Basiswetenschappen van het Fred Hutchinson Cancer Research Center in Seattle. Vandaag gaan Cecilia en ik het protocol voor het bevriezen van zaadcellen van zebravissen demonstreren, een aanpassing van het originele Brian Harvey-protocol. We zullen je laten zien dat het mogelijk is om met teams van twee in minder dan twee uur het sperma van 100 individuele mannetjes te bevriezen.
Hoewel er een breed scala aan vruchtbaarheid is na het ontdooien, ontvangen we gemiddeld 25% vruchtbaarheid, en dit komt van een bibliotheek die al meer dan zeven jaar bevroren is. Laten we beginnen. Voordat je deze procedure uitvoert, maak eerst de oplossingen voor het bevriezen van sperma.
De Ginsburg Fish ringer-oplossing wordt elke drie dagen vers gemaakt, en het bevriezingsmedium wordt dagelijks vers gemaakt met en zonder methanol. De samenstelling van deze oplossingen is te vinden in de online aanvullende informatie bij dit protocol. De materialen die bij deze procedure worden gebruikt, kunnen de snelheid van bevriezing en ontdooien beïnvloeden, wat op zijn beurt de vruchtbaarheid van bevroren sperma kan beïnvloeden.
Om deze reden is er ook een lijst met aanbevolen materialen beschikbaar als aanvullende online informatie. Het is het beste om het sperma op fijngemalen drooggletsjer te bevriezen in plaats van drooggletsjer pellets. Een eenvoudige manier om drooggletsjer te pletten is door het in een handdoek te wikkelen en met een hamer te verpulveren.
Een efficiëntere methode is om een drooggletsjermolen zoals een klauwenmodel RE twee te gebruiken om zebravissperma te bevriezen. Markeer eerst 10 microliter capillaire buisjes met een labpen op het niveau van 3,33 microliters of ongeveer 16,7 millimeter vanaf de bodem om de mannetjes te verdoven. Plaats twee tot vier mannetjes in een beker met verdunde tringa en viswater. Het recept is te vinden in het zebravisboek.
Zodra ze verdoofd zijn, til je de vissen uit het anesthesiemiddel met een plastic lepel en dep ze voorzichtig droog op een papieren handdoek. Besteed speciale aandacht aan het tekenen van de ventrale kant. Water activeert sperma, dus het is belangrijk om rond de ika grondig te drogen.
Plaats de vis op de sponzhauder met de ventrale kant naar boven. Als het gebied rond de bekkenvinnen nog vochtig is, droog het dan voorzichtig af met een Kim-doek. Plaats de gemarkeerde capillaire buis in een rubberen mondstukadapter die bij de capillaire buisjes is inbegrepen.
De adapter is een rubberen slang met aan het ene uiteinde een mondstuk en aan het andere uiteinde een capillairhouder. Als alternatief kan de capillaire buis worden aangesloten op een Hamilton-spuit van 50 microliter. Gebruik een kort stuk tigon-buis met de juiste diameter, plaats de man onder de scope en leg de urogenitale opening bloot door voorzichtig de bekkenvinnen uit elkaar te spreiden.
Gebruik het uiteinde van de capillaire buis om het sperma te verdrijven door de zijden van de vis voorzichtig te strijken met gladde pincetten of door voorzichtig de zijden van de vis met een wijsvinger en duim samen te knijpen, verzamel het sperma in een capillaire buis terwijl het wordt uitgedreven met behulp van zachte zuiging. Vermijd uitwerpselen die mogelijk met het sperma worden uitgedreven. Het doelvolume van sperma is 3,3 microliters.
De minimale hoeveelheid sperma die acceptabel is, varieert afhankelijk van de kwaliteit van het sperma. Goed sperma is wit en ondoorzichtig, terwijl poortsperma er waterig uitziet. Over het algemeen is de minimaal acceptabele hoeveelheid sperma één microliter goed sperma of een derde van het doel, en twee microliters poortsperma of twee derde van het doel.
Als het spermavolume niet het doelvolume van 3,3 microliters bereikt, dan is het noodzakelijk om het volume te normaliseren naar de penmarkering met bevriezingsmedium zonder methanol. Als het volume van het sperma al de penmarkering op de capillaire buis bereikt of overschrijdt, ga dan door naar de volgende stap. Voeg nu het cryoprotectant toe aan het sperma.
Zuig bevriezingsmedium met methanol op tot de oranje markering. Het geschatte totale volume is nu 20 microliters. Spuit het sperma en het cryoprotectantmengsel op een schoon gebied van een uurglas, meng voorzichtig door het op en neer pipetten ongeveer vier keer en vermijd het binnendringen van luchtbelletjes.
Pipet de sperma in twee cryobuisjes door 10 microliter van de spermacryoprotectant-oplossing in de bodem van elk gelabeld buisje te pipetten. Kap snel de buisjes en laat elk cryobuisje in een aparte 15 milliliter falconbuis vallen. Bij kamertemperatuur kap de falconbuisjes en plaats ze in fijngemalen drooggletsjer.
De buisjes moeten diep genoeg worden ingebracht, zodat alleen de kapjes zichtbaar zijn om de falconbuisjes bij te houden. Nummer ze en noteer het tijdstip waarop elke buis in de drooggletsjer gaat. Laat het sperma 20 minuten in de drooggletsjer bevriezen.
Nadat het sperma is bevroren, breng je de twee cryobuisjes over in een vloeibare stikstof bevattende doerkolf. Voor tijdelijke opslag. Plaats de vriesdoos in een bad van vloeibare stikstof zodat de monsters niet opwarmen.
Gebruik lange metalen pincetten om de buisjes uit de doerkolf te halen en behandel ze met cryohandschoenen. Alternatief kunnen cryobuisjes rechtstreeks van de drooggletsjer naar de vriezer worden overgebracht. Als de vriesdoos voor langdurige opslag in vloeibare stikstof in een schuimrubberen houder wordt ondergedompeld, plaats je de cryobuisjes in een cryogene vloeibare stikstof vriezer.
Om de levensvatbaarheid van het sperma te behouden, is het van cruciaal belang dat de buisjes ondergedompeld in vloeibare stikstof worden bewaard. In de dampfase opgeslagen buisjes kunnen na verloop van tijd hun levensvatbaarheid verliezen. Snelheid is ook cruciaal bij het behoud van de levensvatbaarheid van het sperma. De
Overzicht
Dit artikel presenteert een hoog-doorvoer protocol voor sperma-cryoconservatie bij zebravissen, waarbij een gemiddelde vruchtbaarheidsgraad van 25% wordt bereikt bij volgende in vitro-bevruchting. Het protocol is stabiel over vele jaren, waardoor effectieve langdurige opslag van zebravissperma mogelijk is.
Belangrijkste onderdeel van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Reproductieve biologie
- Cryoconservatietechnieken
Achtergrond
- Zebravissen zijn een modelorganisme in biologisch onderzoek.
- Cryoconservatie is essentieel voor langdurige opslag van genetisch materiaal.
- Het behoud van sperma-levensvatbaarheid is cruciaal voor succesvolle bevruchting.
- Protocollen voor sperma-cryoconservatie kunnen variëren in effectiviteit.
Doel van het onderzoek
- Om een hoog-doorvoer methode voor zebravissperma-cryoconservatie te ontwikkelen.
- Om de vruchtbaarheid van geconserveerd sperma in de loop van de tijd te beoordelen.
- Om een betrouwbaar protocol te bieden voor onderzoekers in het veld.
Gebruikte methoden
- Bereiding van spermavriesoplossingen en cryoprotectantia.
- Verzameling van sperma van geanesthetiseerde mannelijke zebravissen.
- Vriesvullen van sperma met behulp van droog ijs en vloeibare stikstof.
- Ontdooien van sperma voor in vitro-bevruchting.
Belangrijkste resultaten
- Gemiddelde vruchtbaarheidsgraad van 25% van geconserveerd sperma.
- Protocol maakt de cryoconservatie van sperma van 100 mannetjes in minder dan twee uur mogelijk.
- Sperma-levensvatbaarheid wordt behouden gedurende een periode van meer dan zeven jaar.
- Specifieke technieken verhogen het succespercentage van cryoconservatie.
Conclusies
- Het ontwikkelde protocol is efficiënt en effectief voor zebravissperma-cryoconservatie.
- Hoge vruchtbaarheidspercentages kunnen worden bereikt met de juiste technieken.
- Deze methode kan langdurige genetische studies bij zebravissen ondersteunen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Zebrafish sperm cryopreservation enables long-term genetic resource management in preclinical discovery, supporting consistent model availability for target validation and phenotypic screening. The high-throughput protocol allows cryopreservation of 100 male samples in under two hours, improving operational efficiency in large-scale genetic repositories. Stable 25% fertility rates over multiple years provide predictable outcomes for downstream in vitro fertilization assays, reducing variability in genetic cross experiments.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of genetic hypotheses by preserving sperm lines for future crosses to validate gene function in disease-relevant systems.
- Operational Value: Standardized sperm collection and freezing procedures reduce technical variability, supporting reproducible target de-risking across laboratories.
- Predictive Value: Long-term storage capability allows retrospective testing of genetic models as new targets emerge, improving confidence in translational continuity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Cryopreserved sperm provides a uniform biological input for in vitro fertilization assays, enabling consistent egg-to-embryo conversion metrics for compound screening.
- Operational Value: Use of cryovials instead of capillary tubes improves sample handling and storage scalability in high-throughput workflows.
- Assay Readiness: Normalized sperm volumes using methanol-free freezing medium increase procedural uniformity, supporting reliable quantitative outputs in fertilization assays.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Stable fertility rates over seven years support multi-year preclinical studies requiring consistent genetic backgrounds for mechanism of action and safety profiling.
- Predictive De-risking: Reliable sperm viability reduces attrition in genetic model generation, improving success rates in phenotype-driven target validation pipelines.
- Disease-Relevant System: Zebrafish embryos derived from cryopreserved sperm enable rapid phenotypic assessment in vertebrate models aligned with human disease pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing a scalable upstream process for generating zebrafish embryos used in target validation, assay development, and phenotypic screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling on-demand generation of genetically defined embryos from archived sperm lines.
- Screening: Cryopreserved sperm improves assay reproducibility and throughput in in vitro fertilization-based compound or genetic suppressor screens.
- Analytics: Fertility rate measurements (viable embryos per total eggs) provide a quantitative endpoint for assessing sperm quality and genetic cross efficiency.
- Translational Research: Long-term sperm storage supports continuity from gene discovery through preclinical validation using consistent genetic backgrounds.
- Enterprise Reuse: Protocol establishes a reusable genetic resource management capability for large-scale zebrafish facilities supporting multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in genetic model availability, reduction of mechanistic ambiguity in cross-generational studies.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of sperm processing enable high-throughput biobanking.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions on genetic model investment, capital efficiency in maintaining live colonies, reduced biological risk in longitudinal studies.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of genetic lines based on cryopreservation success rates and long-term fertility stability.
Implementation Considerations
- Required expertise in zebrafish handling, sperm extraction, and cryopreservation techniques.
- Instrumentation needs include dry ice grinder, liquid nitrogen storage, capillary tubes, cryovials, and temperature-controlled water baths for thawing.
- Cross-team standardization requires adherence to specified materials (e.g., finely crushed dry ice, recommended tubes) to control freezing/thawing rates affecting fertility.
- Adaptation considerations include sperm volume normalization using methanol-free freezing medium to ensure uniform sample preparation across variable male outputs.
- Practical limitations: Fertility varies per sample; protocol success depends on sperm and egg quality, with minimum acceptable sperm volume thresholds defined.
