Het maken van Gynogenetic Diploïde zebravis in het begin van Pressure

Hoi, ik ben Charlene Walker van het laboratorium van Charles Kimmel aan de University of Oregon, het Institute of Neuroscience. En ik ben Gregory Walsh. Ik werk in het laboratorium van Cecilia Moens in de Division of Basic Sciences bij het Fred Hutchinson Cancer Research Center.

Vandaag laten we u een procedure zien voor het maken van triploïde zebravissen met behulp van de methode van vroege drukbehandeling. Deze methode maakt gebruik van hydrostatische druk om microtubuli te depolymeriseren in een ei dat is bevrucht met UV-bestraald sperma, mits dit op het juiste tijdstip gebeurt.

Dit voorkomt de uitstoting van het tweede polaire lichaam, waardoor een diploïde embryo ontstaat waarvan de homologe chromosomen de twee producten van meiose I zijn. Deze techniek werd begin jaren 70 ontwikkeld toen ik werkte in het laboratorium van George Reisinger aan de University of Oregon. In ons laboratorium gebruiken we deze procedure in genetische screens over twee generaties.

De gameten van F1-mutageen vissen kunnen direct worden gescreend op recessieve mutaties die leiden tot ontwikkelingsfenotypes in homozygote gyno, genetisch diploïde nakomelingen. Omdat zebravis een hoge genetische interferentie vertoont, gebruiken we deze methode ook om mutaties in kaart te brengen op chromosomen en om te schatten hoe ver deze mutaties van het centromeer afliggen. Laten we beginnen. Bereid u in de late namiddag, de dag voor het experiment, voor op de spermaverzameling door de mannetjes en vrouwtjes die gestript moeten worden te scheiden; oude mannetjes kunnen worden gebruikt, aangezien zij geen genetisch materiaal zullen bijdragen.

De vrouwtjes moeten er groot uitzien met een dikke buik, terwijl de mannetjes er geel en vitaal uit moeten zien. Bewaar de mannetjes en vrouwtjes een nacht in afzonderlijke opvangbakken waar ze 's ochtends gemakkelijk bereikbaar zijn. Bereid op de ochtend van het experiment de Hank-oplossing en voeg natriumbicarbonaat toe.

Breng het materiaal in een isemmer naar de visfaciliteit. De Hank's-oplossing, trica, een timer en buisjes voor het verzamelen van sperma. Verdun ten slotte de trica in viswater zodra u in de visfaciliteit bent.

Dit zal worden gebruikt om de vissen in de volgende stap te anesthetiseren. Om te beginnen met de spermaverzameling, bereid een helder vial met Hank's oplossing op ijs voor. Zorg dat er voldoende gekoelde Hank's oplossing aanwezig is (ongeveer 50 µL per mannetje dat wordt uitknepen) en anesthetiseer één of twee mannetjes per keer.

Door onderdompeling en trica kunnen ze met een plastic lepel uit het anesthesicum worden getild. Spoel de mannetjes met viswater en dep ze droog op een papieren handdoek. Dit is zeer kritisch, omdat water het sperma activeert.

Zodra ze droog zijn, monteer je de vissen in een schuimhouder onder een stereomicroscoop bij een lage vergroting met epi-verlichting. Scheid de buikvinnen met een pincet en positioneer een microcapillair bij de opening van de cloaca om te beginnen met het verzamelen van sperma. Strijk zachtjes maar stevig over de zijkanten van de vis met gladde mill Pour-pincetten terwijl het melkachtige sperma uit de genitalieporie komt; verzamel dit in het microcapillair door middel van zachte zuigkracht en neem het sperma van meerdere mannetjes op in ijs.

Koude Hank's gebalanceerde zoutoplossing met sperma van vijf tot 10 mannetjes is voldoende voor de bevruchting van eicellen van 20 tot 30 vrouwtjes. Sperma dat bewaard wordt in koude Hank's-oplossing, blijft gedurende enkele uren efficiënt eicellen bevruchten.

Verzamel voldoende sperma om een troebele suspensie te maken voor de UV-inactivatie van het sperma. Begin met het vullen van de bodem van een glazen Petrischaal met ijs. Plaats een horlogeglas op het ijs in de schaal.

Gebruik vervolgens de pipette om het sperma vanuit de reageerbuis over te brengen naar het horlogeglas. Zorg ervoor dat er zoveel mogelijk sperma in de pipette wordt opgenomen zonder luchtbellen mee te nemen. Het is cruciaal om beluchting van het sperma te voorkomen; breng het sperma in een dunne, gelijkmatige laag aan op het horlogeglas en gooi de pipette weg.

Nadat het sperma is overgebracht, plaatst u de Petrischaal in een UV-crosslinker. Zet de crosslinker aan en stel de energie in op 900 JUULs. Gebruik na het crosslinken een schone pipet om het sperma uit het horlogeglas te verwijderen, breng het over naar een fendor-buisje gemarkeerd met 'UV sperm' en plaats dit op ijs.

Om te beginnen met de eiverzameling, worden eerst telkens twee vrouwtjes geanestheseerd. Bij het gebruik van Trica is het cruciaal om de vissen niet te lang in het middel te houden, omdat langdurige anesthesie tot de dood van de vis kan leiden. Spoel de vissen vervolgens af met viswater en dep ze droog met een papieren handdoek.

Dit is cruciaal omdat overtollig water de eitjes doet opzwellen en bevruchting verhindert. Plaats het vrouwtje met vochtige, maar niet natte vingers in een plastic Petrischaal van 35 millimeter. Druk zachtjes maar stevig op de buik.

Als ze klaar is om eitjes te leggen, zullen deze gemakkelijk naar buiten komen; verzamel de eitjes met een spatel en plaats het vrouwtje terug in het water. Goede eitjes hebben een gelige, doorschijnende kleur, terwijl eitjes die te lang in het vrouwtje zijn gebleven wit en waterig zijn. Om goede eitjes te verkrijgen, moeten deze worden verzameld tijdens de eerste twee uur nadat de lichten in de visfaciliteit zijn aangegaan; houd de eitjes afgedekt om uitdroging te voorkomen.

Voeg na het verzamelen van de eitjes 30 tot 50 µL van de UV-spermasuspensie toe aan de eitjes en roer voorzichtig met een pipetpunt. Voeg onmiddellijk ongeveer 1 mL viswater toe en start de timer. Eitjes die vanaf dit punt worden gelaten om zich te ontwikkelen, zullen haploïde zijn.

De volgende stappen moeten binnen 90 seconden na de bevruchting worden uitgevoerd. Start de timer op het moment dat de eitjes worden geactiveerd door de toevoeging van water.

De exacte timing van de metafase van meiose I is temperatuurafhankelijk. De timing van het aan- en uitschakelen van de druk is geoptimaliseerd voor 28,5 °C. Wacht na het starten van de timer enkele momenten, voeg vervolgens meer water toe en zwem de eitjes naar het midden van de schaal.

Gebruik hiervoor een afgeknotte en gladgemaakte pasturepipet. Breng de bevruchte eitjes indien nodig over naar de drukbuisjes en voeg extra eiwater toe aan het buisje zodat ze bijna overlopen, waarbij een waterdruppel op de rand van de buisjes achterblijft. Plaats vervolgens een rubberen dop over de waterdruppel en bevestig het plastic deksel over het rubber.

Plaats de vials ondersteboven in de drukcilinder en voeg meer eiwater toe. Om de cilinder te vullen, plaatst u de bovenkant stevig op de cilinder. Plaats de cilinder na het sluiten in de pers met de zuiger naar boven en oefen een druk uit van 8, 000 pounds per square inch.

Laat de cilinder in de pers tot zes minuten na het tijdstip van activering, voor een totale drukduur van 4,5 minuten. Verwijder de cilinder zes minuten na activering uit de pers. Haal de vials uit de cilinder en droog deze voorzichtig af om afkoeling van de embryo's te voorkomen.

Reset de cilinder en vul deze opnieuw met eierwater. Bereid de volgende vials voor door ze naar behoefte gedeeltelijk te vullen met eierwater. Herhaal deze stappen voor alle batches eieren.

De cilinder kan tot twee vials tegelijk bevatten, dus het kan raadzaam zijn om de bevruchting van de eitjes één tot twee minuten uit te stellen om te zien of andere vrouwtjes in de trica ook eitjes afgeven. Dit helpt het proces te versnellen door meer batches tegelijkertijd te behandelen. Bovendien, als u vissen uitknijpt terwijl de pers wordt gebruikt, kunnen de eitjes te droog zijn om levensvatbaar te blijven tegen de tijd dat de pers opnieuw kan worden gebruikt; 24 uur na de bevruchting zal een haploïde zebravissenbryo een kort, gedrongen lichaam, een korte staart en een minder duidelijk gevormde hersenen hebben.

Toch zullen ze allemaal dezelfde lichaamsdelen hebben, zoals somieten, een ruggenkoord, ogen en oren. Als diploïden, haploïden en diploïden vertonen ze allen ongehinderde buigingsbewegingen rond 24 uur. Na bevruchting hebben EP diploïde broedjes en zusjes lange staarten, goed gevormde hersenen en zouden ze ongeveer 60 tot 70% levensvatbaar moeten zijn.

Deze lijken sterk op de onbehandelde geplaatste controles. Gewoonlijk bevat een batch haplo-embryo's een mengeling van goed uitziende embryo's, dode embryo's en alles daartussenin. De verhouding tussen goed uitziende embryo's en defecte embryo's weerspiegelt de schadelijke genen in het genoom van het vrouwtje.

Mutaties zijn relatief eenvoudig te identificeren, zelfs met deze achtergrond, omdat er verschillende individuen tot 50% met hetzelfde kenmerkende fenotype zullen zijn. Het is belangrijk om er zeker van te zijn dat de embryo's die met deze methode zijn geproduceerd werkelijke OID's zijn; als controles dient men een nest van normale diploïde eieren te genereren door een deel van het sperma zonder UV-inactivatie apart te houden, en een nest van haplo-embryo's door een nest eieren die bevrucht zijn met UV-sperma zonder de EP-procedure te doorlopen; haplo's zijn na twee tot drie dagen niet levensvatbaar. EP-diploïden zouden eruit moeten zien als normale diploïden.

Hoewel er enkele onregelmatige EP-monsters kunnen voorkomen, zouden clutches van EP-diploiden voor een groot deel levensvatbaar moeten zijn, rond de 70 tot 90%. De aanwezigheid van haploën in de ingezette EP-clutch duidt op een fout in het EP-proces. Bijvoorbeeld, wanneer de pers geen druk kan vasthouden. De aanwezigheid van diploiden in de haplo-clutch duidt op een onvolledige inactivering van het sperma, bijvoorbeeld door een defect in de crosslinker.

We hebben zojuist aangetoond hoe eenvoudig in vitro fertilisatie bij zebravissen kan worden uitgevoerd en hoe gynogenetisch afgeleide diploïde zebravissenembryo's kunnen worden gemaakt door de tweede meiotische deling te remmen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de timing van de vroege druk nauwkeurig is en dat de pers gedurende de behandeling een druk van 8.000 pounds per square inch handhaaft. Zorg ervoor dat uw pers is gekalibreerd.

Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.