Name: Het maken van Gynogenetic Diploïde zebravis in het begin van Pressure (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: Leer hoe je gynogenetische diploïde zebravis produceert met hydrostatische druk en UV-bestrade sperma. Deze methode blokkeert de tweede meiotische deling en genereert homozygote embryo's voor genetisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Methoden voor in vitro fertilisatie en gynogenetische diploïden werden voor zebravis ontwikkeld door Charline Walker in het laboratorium van George Streisinger aan de Universiteit van Oregon in de jaren 70 en 80. De hier beschreven methode is ongewijzigd ten opzichte van de protocollen van Charline, die volledig beschikbaar zijn in The Zebrafish Book3.Methoden voor in vitro fertilisatie en gynogenetische diploïden voor zebravis werden in de jaren 70 en 80 ontwikkeld door Charline Walker in het laboratorium van George Streisinger aan de University of Oregon. De hier beschreven methode is ongewijzigd ten opzichte van de protocollen van Charline, die volledig beschikbaar zijn in The Zebrafish Book3.

Overzicht van vroege druk
Opmerking: recepten voor veel van de reagentia die in dit protocol worden gebruikt, zoals tricaine, viswater en Hanks-zoutoplossing, zijn online beschikbaar in hoofdstuk 10 van het Zebrafish Book3 (<a href="http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html">http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html</a>)
<ol>
<li>Produceer embryo's door middel van in vitro fertilisatie met behulp van UV-geïnactiveerde sperma.</li>
<li>Breng de bevruchte eieren onmiddellijk over naar een glazen flacon (met een plastic klikdop) die tot de rand is gevuld met eiwater. Bedek het open uiteinde van de flacon met een dun vel latexrubber en klik de dop (waarin een gat is gemaakt) over het rubber op de flacon.</li>
<li>Plaats de flacon in een hydraulische pers en verhoog 1,4 min na de bevruchting de druk naar 8.000 p.s.i. (Let op dat veel persen zijn gekalibreerd om de druk te lezen die wordt uitgeoefend op een zuiger met een diameter van 2 inch, en dat de aflezingen moeten worden omgezet naar p.s.i.)</li>
<li>Begin 6 min na de bevruchting met het geleidelijk verlagen van de druk over een periode van 1 min.</li>
</ol>
Gedetailleerde procedure voor vroege drukmeting
<ol>
 <li>Dag voor het experiment
 <ol style="list-style-type:lower-alpha;">
 <li>Scheid in de late namiddag de mannetjes en vrouwtjes die zullen worden gestript. Elk oud mannetje kan worden gebruikt, aangezien hij geen genetisch materiaal zal bijdragen. Vrouwtjes moeten er groot uitzien met een dikke buik. Mannetjes moeten geel en vitaal ogen.</li>
 <li>Houd vrouwtjes en mannetjes 's nachts gescheiden in opvangbakken waar ze in de ochtend gemakkelijk toegankelijk zijn.</li>
 </ol></li>
 <li>Ochtend van het experiment
 <ol style="list-style-type:lower-alpha;">
 <li>Bereid Hanks-oplossing voor; voeg natriumbicarbonaat toe.</li>
 <li>Neem mee naar de visfaciliteit: ijsemmer, Hanks, Tricaine, timer, buisjes voor het verzamelen van sperma.</li>
 <li>Verdun Tricaine in viswater.</li>
 </ol></li>
 <li>Verzamelen van sperma
 <ol style="list-style-type:lower-alpha;">
 <li>Bereid een helder flesje met Hanks-oplossing op ijs voor. Meet ~50 μl per mannetje dat gestript zal worden.</li>
 <li>Anestheseer 3 of 4 mannetjes tegelijk door onderdompeling in tricaine. Ze kunnen met een plastic lepel uit het anestheticum worden getild.</li>
 <li>Spoel af in viswater en dep "vochtig-droog" met een papieren handdoek (zeer belangrijk: water activeert het sperma).</li>
 <li>Plaats de vis in een schuimhouder onder een stereomicroscoop bij lage vergroting met epi-verlichting. Scheid de buikvinnen met een pincet en positioneer een microcapillair bij de opening van de cloaca.</li>
 <li>Strijk zachtjes maar stevig langs de zijkanten van de vis met een gladde (Millipore) pincet.</li>
 <li>Zodra het melkachtige sperma uit de genitale porie komt, verzamel je dit in het microcapillair met behulp van zachte zuiging.</li>
 <li>Pool het sperma van meerdere mannetjes in ijskoude Hanks-zoutoplossing. Sperma van 5-10 mannetjes is voldoende voor de bevruchting van enkele honderden eitjes. Sperma in koude Hanks-oplossing blijft gedurende enkele uren of zelfs dagen efficiënt eitjes bevruchten. Schat de spermaconcentratie visueel in en verzamel voldoende om een troebele suspensie te maken.</li>
 </ol></li>
 <li>UV-inactivering van sperma
 <ol style="list-style-type:lower-alpha;">
 <li>Vul de bodem van een glazen Petrischaal met ijs.</li>
 <li>Plaats een horlogeglas bovenop het ijs in de schaal.</li>
 <li>Breng met een Pasteurpipet het sperma vanuit de reageerbuis over naar het horlogeglas. Zorg dat er zoveel mogelijk sperma in de pipet komt zonder luchtbellen mee te nemen. Blaas het sperma bovendien niet op in het horlogeglas terwijl je het uit de pipet spuit. Spuit het sperma in een dunne, gelijkmatige laag op het horlogeglas. GOOI DEZE PIPET WEG.</li>
 <li>Plaats de Petrischaal in een UV-crosslinker.</li>
 <li>Zet de crosslinker 2 minuten aan.</li>
 <li>Verwijder het sperma met een SCHONE pipet van het horlogeglas en breng het over naar een eppendorfflesje gemarkeerd met UV Sperm en plaats dit op ijs.</li>
 </ol></li>
 <li>Eierverzameling en in vitro bevruchting
 <ol style="list-style-type:lower-alpha;">
 <li>Anestheseer drie of vier vrouwtjes tegelijk in tricaine.</li>
 <li>Spoel af in viswater en dep &quot;vochtig-droog&quot; met een papieren handdoek. Te veel water zal de eitjes doen opzwellen en de bevruchting belemmeren.</li>
 <li>Plaats het vrouwtje in een plastic petrischaal van 35 mm en druk met vochtige (niet natte) vingers zachtjes maar stevig op de buik. Als ze klaar is om eitjes te leggen, zullen deze vrij gemakkelijk naar buiten komen.</li>
 <li>Verzamel de eitjes met een spatel en breng het vrouwtje terug in het water. Goede eitjes hebben een gelige, doorschijnende kleur, terwijl eitjes die te lang in het vrouwtje zijn gebleven wit en waterig zijn (zie hieronder). Om goede eitjes te verkrijgen, verzamel je deze gedurende de eerste 2 uur nadat het licht in de visfaciliteit is aangegaan. Houd de eitjes afgedekt om uitdroging te voorkomen.</li>
 <li>Voeg 30-50 μl van de UV-spermasuspensie toe aan de eitjes en roer voorzichtig met de pipetpunt.</li>
 <li>Voeg onmiddellijk ongeveer 1 ml viswater toe en start de timer. Eitjes die op dit punt worden nagelaten te ontwikkelen, zullen haploïde zijn.</li>
 </ol></li>
 <li>Vroege druk. Let op: stappen a-g moeten binnen 90 seconden na bevruchting worden voltooid!
 <ol style="list-style-type:lower-alpha;">
 <li>Start de timer op het moment dat de eitjes worden geactiveerd door de toevoeging van water.</li>
 <li>Wacht een paar momenten en voeg meer water toe; draai de eitjes naar het midden van de schaal.</li>
 <li>Breng de bevruchte eitjes met een afgeknipte en gepolijste Pasteurpipet over naar de drukflesjes.</li>
 <li>Voeg indien nodig meer eierwater toe aan de flesjes zodat ze bijna overstromen, waarbij een druppel water op de rand van de flesjes blijft staan.</li>
 <li>Plaats een rubberen dop over de waterdruppel en bevestig het plastic deksel over het rubber.</li>
 <li>Plaats het flesje (of de flesjes) ondersteboven in de drukcilinder en voeg meer eierwater toe om de cilinder te vullen. Sluit de dop van de cilinder stevig.</li>
 <li>Plaats de cilinder in de pers met de zuiger omhoog en breng een druk van 8,000 lbs/sq. in toe.</li>
 <li>Laat de cilinder in de pers tot 6 min na het tijdstip van activatie (voor een totale druktijd van 4,5 min).</li>
 <li>Verwijder na 6 min na activatie de cilinder uit de pers en haal de flesjes uit de cilinder. Droog de flesjes voorzichtig af om afkoeling van de embryo's te voorkomen.</li>
 <li>Reset de cilinder en vul deze opnieuw met eierwater.</li>
 <li>Bereid de volgende flesjes voor door ze indien nodig gedeeltelijk te vullen met eierwater.</li>
 <li>Herhaal dit voor alle batches eitjes.</li>
 </ol></li>
</ol>
OPMERKING: De cilinder kan tot 3 vials tegelijk bevatten, dus het kan raadzaam zijn om de bevruchting van de eitjes enkele minuten uit te stellen om te zien of andere vrouwtjes die al in het tricaine zitten eitjes afgeven. Dit helpt het proces te versnellen door meer batches tegelijkertijd te behandelen. Onthoud daarnaast dat er geen extra vissen in het tricaine geplaatst mogen worden zodra de pers in gebruik is, totdat de behandeling is voltooid. Te lang in het anestheticum blijven kan fataal zijn voor de vissen. Ten tweede kunnen eitjes die verkregen worden door vissen uit te knijpen terwijl de pers in gebruik is, te droog zijn om nog levensvatbaar te zijn tegen de tijd dat de pers opnieuw gebruikt kan worden.

<ol><li>Streisinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregation+analyses+and+gene-centromere+distances+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Segregation analyses and gene-centromere distances in zebrafish.</a> Genetics. 112 (2), 311-311 (1986).</li>
<li>Streisinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+clones+of+homozygous+diploid+zebra+fish+%28Brachydanio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio).</a> Nature. 291 (5813), 293-293 (1981).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 4th ed, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2000).</li>
<li>Johnson, S. L., Africa, D., Horne, S., Postlethwait, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Half-tetrad+analysis+in+zebrafish%3A+mapping+the+ros+mutation+and+the+centromere+of+linkage+group+I%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Half-tetrad analysis in zebrafish: mapping the ros mutation and the centromere of linkage group I.</a> Genetics. 139 (4), 1727-1727 (1995).</li>
<li>Beattie, C. E., Raible, D. W., Henion, P. D., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+pressure+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Early pressure screens.</a> Methods Cell Biol. 237 (71), 2575-25 (1999).</li>
<li>Johnson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centromere-linkage+analysis+and+consolidation+of+the+zebrafish+genetic+map%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Centromere-linkage analysis and consolidation of the zebrafish genetic map.</a> Genetics. 142 (4), 1277-1277 (1996).</li>
<li>Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+mutants+with+disrupted+early+T-cell+and+thymus+development+identified+in+early+pressure+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Zebrafish mutants with disrupted early T-cell and thymus development identified in early pressure screen.</a> Dev Dyn. 237 (9), 2575-2575 (1999).</li>
</ol>

Het is belangrijk om er zeker van te zijn dat embryo's die met deze methode zijn geproduceerd, echte gynogenetische diploïden zijn. Genereer als controles een nest normale diploïde eieren (door een deel van het sperma zonder UV-inactivering apart te houden) en een nest haploïde embryo's (door een nest eieren die zijn bevrucht met UV-sperma apart te houden zonder dat deze de EP-procedure ondergaan). Eén dag na bevruchting hebben haploïde embryo's een korte lichaamsas en een onregelmatige morfologie van de hersenen en somi...

<table><tbody><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Horlogeglas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>French Press</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drukcilinder</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instant ocean</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pasteurpipetten</td><td></td><td></td><td>Het smalle uiteinde afsnijden, vuurpolissen</td></tr><tr><td>UV-crosslinker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>microcapillairen</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

het maken van gynogenetic diploïde zebravis in het begin van pressure

Making Gynogenetic Diploid Zebrafish by Early Pressure

Heterozygotie bij diploïde eukaryoten maakt genetische onderzoeken vaak omslachtig. Methoden die levensvatbare homozygote diploïde nakomelingen voortbrengen uit heterozygote vrouwtjes, maken het mogelijk om gemuteerde F1-vrouwtjes direct te screenen op schadelijke mutaties in een versneld forward-genetisch onderzoek. Streisinger et al.1,2beschreef methoden voor het maken van gynogenetische (homozygote) diploïde zebrafish doordat zebrafish-eicellen worden geactiveerd met door ultraviolet licht geïnactiveerde zaadcellen en door fysische behandelingen (hitte of druk) die microtubuli despolimeriseren, wordt ofwel de tweede meiotische of de eerste zygotische celdeling voorkomen. De methode van "vroege druk" (EP) blokkeert de meiose II, die kort na de bevruchting plaatsvindt. De EP-methode levert een hoog percentage levensvatbare embryo's op die zich kunnen ontwikkelen tot vruchtbare volwassenen van beide geslachten. De methode genereert embryo's die homozygoot zijn op alle loci, behalve op die loci die tijdens meiose I door recombinatie van hun centromeer zijn gescheiden. Homozygote mutaties worden in EP-worpen gedetecteerd tussen 50% voor centromerische loci en minder dan 1% voor telomerische loci. Deze methode is letterlijk overgenomen uit het Zebrafish Book3.

Dit is een methode voor het genereren van gynogenetische diploïde zebravissenembryo's (embryo's waarvan de enige genetische bijdrage van de moeder afkomstig is) door de tweede meiotische deling onmiddellijk na bevruchting met ultraviolet-geïnactiveerde sperma te blokkeren. EP-embryo's zijn niet volledig homozygoot vanwege recombinatie tijdens de eerste meiotische deling, maar ze zijn wel homozygoot op alle loci die niet door recombinatie van hun centromeer zijn gescheiden.

Het maken van Gynogenetic Diploïde zebravis in het begin van Pressure

Heterozygotie bij diploïde eukaryoten maakt genetisch onderzoek vaak omslachtig. Methoden die levensvatbare homozygote diploïde nakomelingen direct produceren uit ...

Hoi, ik ben Charlene Walker van het laboratorium van Charles Kimmel aan de University of Oregon, het Institute of Neuroscience. En ik ben Gregory Walsh. Ik werk in het laboratorium van Cecilia Moens in de Division of Basic Sciences bij het Fred Hutchinson Cancer Research Center.Vandaag laten we u een procedure zien voor het maken van triploïde zebravissen met behulp van de methode van vroege drukbehandeling. Deze methode maakt gebruik van hydrostatische druk om microtubuli te depolymeriseren in een ei dat is bevrucht met UV-bestraald sperma, mits dit op het juiste tijdstip gebeurt.Dit voorkomt de uitstoting van het tweede polaire lichaam, waardoor een diploïde embryo ontstaat waarvan de homologe chromosomen de twee producten van meiose I zijn. Deze techniek werd begin jaren 70 ontwikkeld toen ik werkte in het laboratorium van George Reisinger aan de University of Oregon. In ons laboratorium gebruiken we deze procedure in genetische screens over twee generaties.De gameten van F1-mutageen vissen kunnen direct worden gescreend op recessieve mutaties die leiden tot ontwikkelingsfenotypes in homozygote gyno, genetisch diploïde nakomelingen. Omdat zebravis een hoge genetische interferentie vertoont, gebruiken we deze methode ook om mutaties in kaart te brengen op chromosomen en om te schatten hoe ver deze mutaties van het centromeer afliggen. Laten we beginnen. Bereid u in de late namiddag, de dag voor het experiment, voor op de spermaverzameling door de mannetjes en vrouwtjes die gestript moeten worden te scheiden; oude mannetjes kunnen worden gebruikt, aangezien zij geen genetisch materiaal zullen bijdragen.De vrouwtjes moeten er groot uitzien met een dikke buik, terwijl de mannetjes er geel en vitaal uit moeten zien. Bewaar de mannetjes en vrouwtjes een nacht in afzonderlijke opvangbakken waar ze 's ochtends gemakkelijk bereikbaar zijn. Bereid op de ochtend van het experiment de Hank-oplossing en voeg natriumbicarbonaat toe.Breng het materiaal in een isemmer naar de visfaciliteit. De Hank's-oplossing, trica, een timer en buisjes voor het verzamelen van sperma. Verdun ten slotte de trica in viswater zodra u in de visfaciliteit bent.Dit zal worden gebruikt om de vissen in de volgende stap te anesthetiseren. Om te beginnen met de spermaverzameling, bereid een helder vial met Hank's oplossing op ijs voor. Zorg dat er voldoende gekoelde Hank's oplossing aanwezig is (ongeveer 50 µL per mannetje dat wordt uitknepen) en anesthetiseer één of twee mannetjes per keer.Door onderdompeling en trica kunnen ze met een plastic lepel uit het anesthesicum worden getild. Spoel de mannetjes met viswater en dep ze droog op een papieren handdoek. Dit is zeer kritisch, omdat water het sperma activeert.Zodra ze droog zijn, monteer je de vissen in een schuimhouder onder een stereomicroscoop bij een lage vergroting met epi-verlichting. Scheid de buikvinnen met een pincet en positioneer een microcapillair bij de opening van de cloaca om te beginnen met het verzamelen van sperma. Strijk zachtjes maar stevig over de zijkanten van de vis met gladde mill Pour-pincetten terwijl het melkachtige sperma uit de genitalieporie komt; verzamel dit in het microcapillair door middel van zachte zuigkracht en neem het sperma van meerdere mannetjes op in ijs.Koude Hank's gebalanceerde zoutoplossing met sperma van vijf tot 10 mannetjes is voldoende voor de bevruchting van eicellen van 20 tot 30 vrouwtjes. Sperma dat bewaard wordt in koude Hank's-oplossing, blijft gedurende enkele uren efficiënt eicellen bevruchten.Verzamel voldoende sperma om een troebele suspensie te maken voor de UV-inactivatie van het sperma. Begin met het vullen van de bodem van een glazen Petrischaal met ijs. Plaats een horlogeglas op het ijs in de schaal.Gebruik vervolgens de pipette om het sperma vanuit de reageerbuis over te brengen naar het horlogeglas. Zorg ervoor dat er zoveel mogelijk sperma in de pipette wordt opgenomen zonder luchtbellen mee te nemen. Het is cruciaal om beluchting van het sperma te voorkomen; breng het sperma in een dunne, gelijkmatige laag aan op het horlogeglas en gooi de pipette weg.Nadat het sperma is overgebracht, plaatst u de Petrischaal in een UV-crosslinker. Zet de crosslinker aan en stel de energie in op 900 JUULs. Gebruik na het crosslinken een schone pipet om het sperma uit het horlogeglas te verwijderen, breng het over naar een fendor-buisje gemarkeerd met 'UV sperm' en plaats dit op ijs.Om te beginnen met de eiverzameling, worden eerst telkens twee vrouwtjes geanestheseerd. Bij het gebruik van Trica is het cruciaal om de vissen niet te lang in het middel te houden, omdat langdurige anesthesie tot de dood van de vis kan leiden. Spoel de vissen vervolgens af met viswater en dep ze droog met een papieren handdoek.Dit is cruciaal omdat overtollig water de eitjes doet opzwellen en bevruchting verhindert. Plaats het vrouwtje met vochtige, maar niet natte vingers in een plastic Petrischaal van 35 millimeter. Druk zachtjes maar stevig op de buik.Als ze klaar is om eitjes te leggen, zullen deze gemakkelijk naar buiten komen; verzamel de eitjes met een spatel en plaats het vrouwtje terug in het water. Goede eitjes hebben een gelige, doorschijnende kleur, terwijl eitjes die te lang in het vrouwtje zijn gebleven wit en waterig zijn. Om goede eitjes te verkrijgen, moeten deze worden verzameld tijdens de eerste twee uur nadat de lichten in de visfaciliteit zijn aangegaan; houd de eitjes afgedekt om uitdroging te voorkomen.Voeg na het verzamelen van de eitjes 30 tot 50 µL van de UV-spermasuspensie toe aan de eitjes en roer voorzichtig met een pipetpunt. Voeg onmiddellijk ongeveer 1 mL viswater toe en start de timer. Eitjes die vanaf dit punt worden gelaten om zich te ontwikkelen, zullen haploïde zijn.De volgende stappen moeten binnen 90 seconden na de bevruchting worden uitgevoerd. Start de timer op het moment dat de eitjes worden geactiveerd door de toevoeging van water.De exacte timing van de metafase van meiose I is temperatuurafhankelijk. De timing van het aan- en uitschakelen van de druk is geoptimaliseerd voor 28,5 °C. Wacht na het starten van de timer enkele momenten, voeg vervolgens meer water toe en zwem de eitjes naar het midden van de schaal.Gebruik hiervoor een afgeknotte en gladgemaakte pasturepipet. Breng de bevruchte eitjes indien nodig over naar de drukbuisjes en voeg extra eiwater toe aan het buisje zodat ze bijna overlopen, waarbij een waterdruppel op de rand van de buisjes achterblijft. Plaats vervolgens een rubberen dop over de waterdruppel en bevestig het plastic deksel over het rubber.Plaats de vials ondersteboven in de drukcilinder en voeg meer eiwater toe. Om de cilinder te vullen, plaatst u de bovenkant stevig op de cilinder. Plaats de cilinder na het sluiten in de pers met de zuiger naar boven en oefen een druk uit van 8, 000 pounds per square inch.Laat de cilinder in de pers tot zes minuten na het tijdstip van activering, voor een totale drukduur van 4,5 minuten. Verwijder de cilinder zes minuten na activering uit de pers. Haal de vials uit de cilinder en droog deze voorzichtig af om afkoeling van de embryo's te voorkomen.Reset de cilinder en vul deze opnieuw met eierwater. Bereid de volgende vials voor door ze naar behoefte gedeeltelijk te vullen met eierwater. Herhaal deze stappen voor alle batches eieren.De cilinder kan tot twee vials tegelijk bevatten, dus het kan raadzaam zijn om de bevruchting van de eitjes één tot twee minuten uit te stellen om te zien of andere vrouwtjes in de trica ook eitjes afgeven. Dit helpt het proces te versnellen door meer batches tegelijkertijd te behandelen. Bovendien, als u vissen uitknijpt terwijl de pers wordt gebruikt, kunnen de eitjes te droog zijn om levensvatbaar te blijven tegen de tijd dat de pers opnieuw kan worden gebruikt; 24 uur na de bevruchting zal een haploïde zebravissenbryo een kort, gedrongen lichaam, een korte staart en een minder duidelijk gevormde hersenen hebben.Toch zullen ze allemaal dezelfde lichaamsdelen hebben, zoals somieten, een ruggenkoord, ogen en oren. Als diploïden, haploïden en diploïden vertonen ze allen ongehinderde buigingsbewegingen rond 24 uur. Na bevruchting hebben EP diploïde broedjes en zusjes lange staarten, goed gevormde hersenen en zouden ze ongeveer 60 tot 70% levensvatbaar moeten zijn.Deze lijken sterk op de onbehandelde geplaatste controles. Gewoonlijk bevat een batch haplo-embryo's een mengeling van goed uitziende embryo's, dode embryo's en alles daartussenin. De verhouding tussen goed uitziende embryo's en defecte embryo's weerspiegelt de schadelijke genen in het genoom van het vrouwtje.Mutaties zijn relatief eenvoudig te identificeren, zelfs met deze achtergrond, omdat er verschillende individuen tot 50% met hetzelfde kenmerkende fenotype zullen zijn. Het is belangrijk om er zeker van te zijn dat de embryo's die met deze methode zijn geproduceerd werkelijke OID's zijn; als controles dient men een nest van normale diploïde eieren te genereren door een deel van het sperma zonder UV-inactivatie apart te houden, en een nest van haplo-embryo's door een nest eieren die bevrucht zijn met UV-sperma zonder de EP-procedure te doorlopen; haplo's zijn na twee tot drie dagen niet levensvatbaar. EP-diploïden zouden eruit moeten zien als normale diploïden.Hoewel er enkele onregelmatige EP-monsters kunnen voorkomen, zouden clutches van EP-diploiden voor een groot deel levensvatbaar moeten zijn, rond de 70 tot 90%. De aanwezigheid van haploën in de ingezette EP-clutch duidt op een fout in het EP-proces. Bijvoorbeeld, wanneer de pers geen druk kan vasthouden. De aanwezigheid van diploiden in de haplo-clutch duidt op een onvolledige inactivering van het sperma, bijvoorbeeld door een defect in de crosslinker.We hebben zojuist aangetoond hoe eenvoudig in vitro fertilisatie bij zebravissen kan worden uitgevoerd en hoe gynogenetisch afgeleide diploïde zebravissenembryo's kunnen worden gemaakt door de tweede meiotische deling te remmen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de timing van de vroege druk nauwkeurig is en dat de pers gedurende de behandeling een druk van 8.000 pounds per square inch handhaaft. Zorg ervoor dat uw pers is gekalibreerd.Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

making-gynogenetic-diploid-zebrafish-by-early-pressure

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De zebravis is een krachtig modelsysteem voor ontwikkelingsbiologie en onderzoek naar menselijke ziekten vanwege hun genetische overeenkomsten met hogere gewervelde dieren. Dit protocol beschrijft een methodologie om haploïde zebravis-embryo's te creëren die kunnen worden gebruikt voor forward screen-strategieën om recessieve mutaties in genen die essentieel zijn voor vroege embryogenese te identificeren.

Productie van Haploid zebravis embryo&#39;s door<em&gt; In Vitro</em&gt; Bemesting

Dit protocol geeft stap-voor-stap instructies over hoe je parabiotische zebravis-embryo's van verschillende genetische achtergronden kunt genereren. In combinatie met de ongeëvenaarde beeldvormingscapaciteiten van het zebravis-embryo biedt deze methode een uniek krachtig middel om cel-autonome versus niet-cel-autonome functies voor kandidaat-genen van belang te onderzoeken.

Generatie Parabiotic zebravis embryo&#39;s door Surgical Fusion of Developing Blastulae

Een gewijzigde protocol voor ploïdie manipulatie maakt gebruik van een heat shock naar een één-cyclus kraam in cytokinese induceren in de vroege embryo. Dit protocol wordt gedemonstreerd in de zebravis, maar kan voor andere soorten.

Ploïdie Manipulatie van zebravis embryo&#39;s met Heat Shock 2 Treatment

Zebravis onlangs gewend waren als een modelsysteem in vivo DNA replicatie timing tijdens ontwikkeling bestuderen. Hier is gedetailleerde de protocollen voor het gebruik van embryo's de zebravis profiel replicatie timing. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast om te bestuderen van replicatie timing mutanten, individuele celtypes, ziekte modellen en andere soorten.

Profilering van DNA replicatie Timing met behulp van de zebravis als een modelsysteem In Vivo

Hier, laten we het proces van het creëren van een cellulaire elektrische spanning verslaggever zebrafish lijn om te visualiseren van embryonale ontwikkeling, beweging, en vis tumor cellen in vivo.

Visualisatie van cellulaire elektrische activiteit in de zebravis vroege embryo's en tumoren

Presenteren we een efficiënt en gemakkelijk te gebruiken protocol voor het voorbereiden van primaire celculturen van zebravis embryo's voor transfectie en levende cel imaging, evenals een protocol bij het bereiden van primaire cellen van volwassen zebrafish hersenen.

Cultuur en de transfectie van zebravis primaire cellen

Skeletspierregeneratie wordt aangedreven door weefsel ingezeten spierstamcellen, die bij veel spierziekten zoals spierdystrofie worden aangetast, en dit resulteert in het onvermogen van spieren om te regenereren. Hier beschrijven we een protocol dat het mogelijk maakt om spierregeneratie te onderzoeken in zebravismodellen van spierziekte.

Het onderzoeken van Spierregeneratie in Zebrafish Modellen van Spierziekte

Embryologische manipulaties zoals uitroeiing en transplantatie van cellen zijn belangrijke hulpmiddelen om vroege ontwikkeling te bestuderen. Dit protocol beschrijft een eenvoudig en effectief transplantatieapparaat om deze manipulaties uit te voeren in zebravisembryo's.

Een eenvoudig en effectief transplantatieapparaat voor zebravisembryo's

Dit werk beschrijft een protocol voor het modulaire Tol2-transgenesesysteem, een gateway-gebaseerde kloonmethode om transgene constructies in zebravisembryo's te creëren en te injecteren.

Het Zebrafish Tol2-systeem: een modulaire en flexibele gateway-gebaseerde transgenesebenadering

Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van maternale mutant dat een stabiele zpc:cas9 knock-in-lijn koppelt aan Tol2-gemedieerde afgifte van sgRNA-expressiecassettes.

Generatie van maternale mutanten met behulp van zpc:cas9 knock-in zebravissen

Leer hoe je gynogenetische diploïde zebravis produceert met hydrostatische druk en UV-bestrade sperma. Deze methode blokkeert de tweede meiotische deling en genereert homozygote embryo's voor genetisch onderzoek.

Het maken van Gynogenetic Diploïde zebravis in het begin van Pressure

Meer video's verkennen