Het visualiseren van de Beating Heart in Drosophila
28 september 2009
Techniek die nodig is voor het visualiseren van het kloppend hart in de larven en volwassen Drosophila Worden gepresenteerd. Elke levensfase vraagt om een andere methodologie.
Twee technieken zullen hier worden gepresenteerd voor de visualisatie van een kloppend hart in Drosophila voor de dissectie van het volwassen hart. Eerst worden het hoofd en de thorax verwijderd door een enkele snede langs de aangegeven lijn. Vervolgens worden de geslachtsdelen verwijderd en wordt de buikholte geopend met behulp van een pincet het darmkanaal, en in het geval van een vrouwelijke vlieg, worden de eierstokken verwijderd.
Het buikvet in buiksegmenten drie en vier wordt voorzichtig weggezuigd om het volwassen hart bloot te leggen voor de immobilisatie van het larvale hart. Een enkele larve geplaatst in bufferoplossing wordt bevestigd door histo-acrale lijm eerst rond het kopgebied van de larve aan te brengen. De larve wordt voorzichtig uitgerekt en meer lijm wordt aangebracht op het achterste uiteinde, en vervolgens op de flanken van de lichaamswand van de larve.
Hallo, ik ben GI Fler. Hallo, ik ben Karen er. We zijn allebei lid van het Development and Aging programma bij het Burnham Institute for Medical Research.
Vandaag laten we u de procedures zien die we hebben ontwikkeld om het kloppende hart van Laval en volwassen drosophila te visualiseren. We gebruiken beide preparaten als een manier om de hartslagparameters in de fruitvlieg te visualiseren, te onderzoeken en te kwantificeren.Drosophila. Voordat we beginnen, bereiden we eerst een kunstmatige hemolymfoplossing voor.
Deze oplossing bevat sucrose-toegang, helo, die moet worden toegevoegd aan de kunstmatige hemolymf uit gekoelde voorraadoplossingen net voor gebruik. Om bacteriële besmetting te voorkomen, brengt u de kunstmatige hemolymf naar kamertemperatuur en oxideert u de oplossing door gedurende minimaal 15 minuten lucht te bellen. Trek vervolgens verschillende fijne capillairen met behulp van een standaard pipettrekker, die nodig zal zijn voor het verwijderen van vetlichamen in de vlieg.
Zodra alles is voorbereid, moeten volwassen vliegen worden verdoofd. Dit kan worden gedaan door kortdurige blootstelling aan vliegslaap gedurende twee tot vijf minuten, maar wees voorzichtig om de vliegen niet langer dan vijf minuten in de vliegslaap te laten. Kortdurige blootstelling aan kou kan ook worden gebruikt om vliegen te verdoven, maar kooldioxide wordt niet aanbevolen omdat het langere effecten heeft op de hartslag en de hartslag.
Vervolgens worden de verdoofde vliegen met de rugzijde naar beneden geplaatst in een petrischaal bedekt met een dunne laag petroleumgelei. De hydrofobe cuticula in de vleugels en het lichaam moet omkeerbaar aan de geleï aanhechten, maar de vlieg kan indien nodig worden verplaatst. Een eerste snede wordt gemaakt met behulp van een gebogen paar veerschaar.
Dit wordt gedaan door de schaarbladen onder de poten van de vlieg te plaatsen en schuin naar de dorsale oppervlakte van de nek. De ventrale zenuwsnoer en poten worden verwijderd met een enkele snede. De voorbereiding wordt vervolgens ondergedompeld in de geoxideerde kunstmatige hemolymfoplossing met behulp van veerschaar.
De achterste punt van het achterlijf, die bestaat uit buiksegment zeven en acht, wordt met een enkele snede verwijderd. Dit biedt toegang voor het maken van laterale sneden langs beide randen van het achterlijf en dient om de verbinding tussen het achterste darmkanaal en de buikcuticula te doorbreken. Steek de bladen van de schaar in de kleine opening in de punt van het achterlijf en snijd de cuticula lateraal door.
Dit bevrijdt één rand van de ventrale buikcuticula. Pak de flap met pincet en maak een vergelijkbare snede langs de tegenoverliggende laterale rand van het achterlijf. De bevrijde flap van de ventrale buikcuticula kan nu worden verwijderd.
Het darmkanaal en andere buikorganen kunnen meestal als een enkele massa worden verwijderd met behulp van juwelierspincet en zachtjes trekken. Het verwijderen van de inwendige organen onthult de kloppende hartbuis, die nog steeds aan de dorsale cuticula is bevestigd door kleine aery-spieren en is omgeven door vetlichamen. De getrokken capillairen worden in plastic gestoken, één 16e inch slang aangesloten op een vacuümbron.
De zuigkracht is evenredig met het tipdiameter, dus pipetten met tips groter dan 40 micron in diameter mogen niet worden gebruikt eenmaal ingesteld. Dit zuigsysteem wordt gebruikt om overtollig vet rond de hartbuis weg te zuigen. Het kan ook worden gebruikt om luchtbellen die zich rond de cuticula verzamelen en eventueel puin te verwijderen.
Er moet uiterst voorzichtig worden gehandeld om het hart zelf niet aan te raken, en omdat het achterste gedeelte van het hart erg kwetsbaar is, moet die regio samen worden vermeden. De volwassen drosophila-hartbuis is nu blootgelegd en zou moeten kloppen indien nodig. De cuticula en het bevestigde hart kunnen worden herpositioneerd door de cuticula voorzichtig uit de petroleumgelei te tillen en voorzichtig terug te stampen.
Vermijd enig contact met het hartweefsel. Op dit punt moet de oplossing die de voorbereiding bewaart worden vervangen door vers kunstmatig hemolymf. Deze voorbereiding moet gedurende 20 tot 30 minuten worden geëquilibreerd met oxygenatie voordat er manipulaties worden uitgevoerd.
Als de voorbereiding langer dan 60 minuten moet worden bewaard, moet deze worden geperfundeerd met vers kunstmatig hemolymf. Deze voorbereiding is nu klaar om te worden gebruikt voor optische registratie en kan ook worden gebruikt voor elektrofysiologische registratie of voor histologische manipulaties. Er is een andere techniek vereist voor het visualiseren van het kloppende hart in de larven.
Bereik eerst de dekglasjes de dag voor de procedure. Dit wordt gedaan door een tandenstoker te gebruiken om ongeveer 50 tot 70 microliter Sard-oplossing op een 22 bij 22 millimeter dekglas te brengen. Laat de syl-bewaker overnacht op 65 graden Celsius uitharden.
Maak vervolgens de Brody- en Bates-buffer eenmaal bereid, aliquots kunnen worden bewaard bij min 20 graden Celsius en worden ontdooid wanneer dat nodig is. Bereid tenslotte de gereedschappen voor die nodig zijn om de histo-acrale lijm aan te brengen. Trek eerst verschillende fijne capilla
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft technieken voor het visualiseren van het kloppende hart bij zowel larvale als volwassen Drosophila. Elke levensfase vereist een specifieke methodologie voor een effectieve visualisatie.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Biologie
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- Drosophila is een modelorganisme dat veelvuldig wordt gebruikt in biologisch onderzoek.
- Het begrijpen van de hartfunctie in verschillende levensfasen is cruciaal voor ontwikkelingsstudies.
- Visualisatietechnieken zijn essentieel voor het observeren van fysiologische processen.
- Voor de larvale en volwassen stadia zijn verschillende methodologieën vereist.
Doel van de studie
- Het presenteren van technieken voor hartvisualisatie in Drosophila.
- Het benadrukken van de methodologische verschillen tussen de larvale en volwassen stadia.
- Het verstrekken van een gedetailleerd protocol voor onderzoekers.
Gebruikte methoden
- Verwijdering van de kop en het thorax van de volwassen Drosophila.
- Dissectie van de abdominale holte om het hart bloot te leggen.
- Gebruik van histo acral lijm voor immobilisatie van larvale harten.
- Toepassing van bufferoplossing voor larvale fixatie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van het kloppend hart in zowel larvale als volwassen Drosophila.
- Demonstratie van effectieve dissectietechnieken.
- Duidelijke protocollen voor onderzoekers om te volgen.
- Inzichten in de fysiologische verschillen in hartfunctie tijdens verschillende levensfasen.
Conclusies
- Voor de visualisatie van het hart in Drosophila zijn verschillende methodologieën nodig.
- Deze technieken kunnen het begrip van de cardiale fysiologie verbeteren.
- Verder onderzoek kan voortbouwen op deze fundamentele methoden.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Het visualiseren van het kloppende hart in Drosophila biedt een genetisch hanteerbaar systeem voor het onderzoeken van de hartfunctie en ziektemanismen. Dit model maakt targetvalidatie in een vroeg stadium en fenotypische screening mogelijk door genetische perturbaties te koppelen aan kwantificeerbare hemodynamische resultaten. De mogelijkheid om stabiele hartslagen over langere perioden vast te leggen, ondersteunt het mechanistisch minimaliseren van risico's in discovery-workflows.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroegtijdige ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken via genetische manipulatie van geconserveerde cardiale pathways.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbaar systeem voor het beoordelen van de functionele gevolgen van gene knockdown of overexpressie op de hartslag en het hartritme.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve real-time resultaten van de hartfunctie die geschikt zijn voor high-content fenotypische screening.
- Operationele waarde: Ondersteunt de standaardisatie van assays via stabiele preparaten die urenlang kloppen met een frequentie van 1-3 Hz onder gecontroleerde omstandigheden.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Biedt een ziekte-relevant systeem om menselijke hartafwijkingen te modelleren via geconserveerde moleculaire pathways.
- Operationele waarde: Faciliteert de afstemming van translationele biomarkers door het mogelijk maken van correlatie tussen structurele defecten en functionele achteruitgang.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode kan worden geïntegreerd in vroege discovery-workflows door een functionele readout te bieden die de brug slaat tussen genetische perturbatie en fysiologisch resultaat, wat de identificatie van lead-compounds en de voorspellende betrouwbaarheid ondersteunt.
- Ontdekkingsbiologie: Maakt hypothesetoetsing van genfuncties bij de ontwikkeling en het behoud van het hart mogelijk door directe visualisatie van de contractiliteit.
- Screening: Levert assay-klare preparaten met kwantificeerbare hartslagparameters voor de evaluatie van verbindingen of genetische bibliotheken.
- Analytiek: Biedt meetbare afhankelijke variabelen (hartslag, ritme, contractiliteit) die statistische vergelijkingen tussen experimentele condities mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt genetische bevindingen met functionele fenotypes, wat de preklinische continuïteit in modellen voor hartaandoeningen ondersteunt.
- Herbruikbaarheid binnen de organisatie: Vestigt een herbruikbaar platform voor cardiale fenotypering over meerdere projecten en doelwitklassen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid door ambiguïteit in de koppeling tussen gen en functie binnen cardiale pathways te verminderen.
- Operationele waarde: Garandeert reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde dissectie- en immobilisatietechnieken die variabiliteit in de preparatie minimaliseren.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroege functionele gegevens te leveren die targets ontrisken voordat er wordt geïnvesteerd in zoogdiermodellen.
- Impact op portfolio: Maakt risicogecorrigeerde prioritering van hits mogelijk op basis van cardiale veiligheids- en effectiviteitsprofielen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in het hanteren van Drosophila, microchirurgie en microscopische visualisatie.
- Afhankelijkheid van fijne capillaire instrumenten, vacuümsystemen en histoacryl-lijm voor de preparatie.
- Vereist gestandaardiseerde bufferbereiding en oxygenatieprotocollen om de levensvatbaarheid van het hart te behouden.
- Omvat overwegingen voor aanpassingen bij het vertalen van protocollen tussen larvale en volwassen stadia.
- Bevat praktische beperkingen zoals de kwetsbaarheid van het hart en aritmie bij oudere vliegen, wat de consistentie van de gegevens kan beïnvloeden.
