Test voor Pathogeen-geassocieerde Moleculaire Pattern (PAMP)-Triggered Immuniteit (PTI) in Planten
9 september 2009
Een cel dood-gebaseerde test voor het PTI in Nicotiana benthamiana planten is beschreven.
Hi, ik ben Suma TI van het lab van Greg Martin bij het Voice Thompson Institute for Plant Research. Vandaag laten we je een procedure zien voor een celdood-gebaseerde test voor PAM-getriggerde immuniteit of PTI. We gebruiken deze procedure in ons lab om de betrokkenheid van een gen bij PTI te onderzoeken.
Dus laten we beginnen. Begin de procedure door Nicotiana ANA te laten groeien tot ze ongeveer zeven weken oud zijn. Vier tot vijf dagen voordat je begint.
De PAM-getriggerde immuniteit of PTI-test. Knip de planten bij om alle axillaire takken en bloemen te verwijderen. Probeer de axillaire takken snel te verwijderen nadat ze zijn verschenen om de planten beter te kunnen hanteren.
Na het voorbereiden van de planten ga je verder met het kweken van bacteriën. Deze procedure gebruikt niet-pathogene bacteriën voor het induceren van plantimmuniteit vóór een tweede inoculatie met uitdagende bacteriën, start de groei van alle bacteriën die in de test worden gebruikt. Gebruik tegelijkertijd bevroren glycerolstokken van de pseudomonas-bacteriën voor elke pseudomonas-bacteriestok.
Spreid een kleine hoeveelheid bacteriën op het midden van een A KBM-plaat met het juiste antibioticum en incubeer de plaat bij 30 graden Celsius gedurende ongeveer 18 tot 24 uur. Gebruik voor de agrobacterium een eerder voorbereide verse plaat om een vloeibare cultuur te starten in twee milliliter lb. Laat het de volgende dag bij 30 graden Celsius schudden.
Voeg 150 tot 200 microliter vloeibaar KBM toe aan de platen met de pseudomonas-bacteriën. Verspreid de bacteriën over de hele plaat. Gebruik een steriele greter.
Plaats de platen nogmaals in de incubator voor 20 tot 24 uur. Vier agrobacterium. Start een secundaire cultuur in ongeveer vijf tot tien milliliter LB met 20 micromolar aceton.
Laat de cultuur overnacht groeien bij 30 graden Celsius met schudden. Na het voorbereiden van de bacteriën ga je verder met het voorbereiden van de planten voor de test de dag voordat je de PTI-test uitvoert. Na het voorbereiden van de bacteriën verplaats je de planten naar een kamer met een temperatuur van 22 tot 24 graden Celsius met ongeveer 35 tot 40% relatieve luchtvochtigheid en constante verlichting.
Gebruik vervolgens een dikke zwarte stift om cirkels op de bladeren te markeren. Kies goed ontwikkelde bladeren en vermijd oudere bladeren of bladeren die taai of dik aanvoelen. Vermijd het markeren van de onderste delen van het blad.
De cirkels zijn minimaal 1,5 centimeter in diameter en er kunnen twee tot vier cirkels per blad worden gemaakt. De cirkels moeten goed verdeeld zijn en bij voorkeur geen grote ader raken. Begin de PTI-test door de bacteriën te oogsten die worden gebruikt voor het induceren van PTI.
De gebruikte pseudomonas-soort zou een bacteriënmat moeten hebben gevormd die duidt op goede groei. Haal ze van de plaat door ze af te schrabben met een steriele lange houten stok en schud ze op in ongeveer 20 tot 25 milliliter 10 millimolair. Magnesiumchloride-oplossing voor agrobacterium centrifuge.
De cultuur om de cellen te verzamelen en schud opnieuw op in ongeveer 20 tot 25 milliliter 10 millimolair magnesiumchloride plus 10 millimolair. MES pH 5,6, herhaal de centrifugatie en schud opnieuw op in ongeveer 20 tot 25 milliliter van de magnesiumchloride plus MES-oplossing. Nu dat de inducerende pseudomonas en agrobacterium-bacteriën opnieuw zijn opgeschort.
Meet de optische dichtheid van alle drie de culturen bij een golflengte van 600 nanometer. Pas de ODS aan door de cellen te verdunnen met magnesiumchloride voor de pseudomonas en MES plus magnesiumchloride voor de agrobacterium. De uiteindelijke vereiste OD-waarden staan in het bijbehorende schriftelijke protocol.
Een totaal volume van 25 milliliter bacteriecultuur is voldoende om ongeveer 40 tot 50 plekken te inoculeren. Begin nu de test door de PTI-inductoren in de vooraf gemarkeerde cirkels op de bladeren te infiltreren met behulp van een spuit van één milliliter zonder naald. Schrijf de volgorde waarin de planten zijn geïnfiltreerd en het exacte tijdstip op waarop de infiltratie is begonnen, na de inductie.
Ga enkele uren na de inductie-inoculatie verder met de uitdagende inoculatie. Haal de bacteriestammen binnen die nodig zijn voor de uitdagende inoculatie, zoals eerder getoond voor de inducerende pseudomonas-stammen. Meet opnieuw de OD en pas de concentratie van de culturen aan volgens het bijbehorende GR-protocol.
Begin de uitdagende inoculatie zeven uur na de infiltratie van de inductor. Gebruik de volgende inductor-uitdagercombinaties. Kies een punt op de rand van de eerste inoculatiecirkel als het centrum van de tweede inoculatiecirkel.
Voer de uitdagende infiltratie uit in dezelfde volgorde van planten als die van de inductie. Als er meerdere plekken op een blad zijn, zorg er dan voor dat de infiltraties elkaar niet overlappen. Plaat ten slotte seriële verdunning van alle culturen die in de test zijn gebruikt op KBM- of LB-platen met de juiste antibiotica.
Twee dagen na de uitdagende inoculatie kan men beginnen met het evalueren van de PTI-respons twee dagen na de inductie- en uitdagende inoculaties. Zoek naar het verschijnen van celdood als gevolg van effector-getriggerde immuniteit of ETI in de plekken die zijn uitgedaagd met PST DC 3000-celdood in het overlappende infiltratiegebied duidt op een afbreking van PTI en moet worden gescoreerd als een positief fenotype vier tot vijf dagen na de inductie- en uitdagende inoculaties. Zoek naar het verschijnen van celdood als gevolg van ziekte in de plekken die zijn uitgedaagd met de DC 3000 hop Q1-mutant of PS back high again. Zoek naar afbreking van PTI die wordt aangegeven door celdood als gevolg van ziekte in het overlappende infiltratiegebied. Blijf de planten observeren tot degenen die niet zijn aangetast door PTI celdood beginnen te vertonen in het overlappende infiltratiegebied.
Planten die zijn afgesteld voor FLS twee zijn aangetast door PTI twee dagen na inoculatie met de PFDC-combinatie. Celdood wordt gezien in het overlappende gebied, wat duidt op een afbreking van PTI. Controleplanten die niet voor een gen zijn afgesteld, zijn ook
Overzicht
Dit artikel beschrijft een op celdood gebaseerde test voor PAM-geïnduceerde immuniteit (PTI) in Nicotiana benthamiana-planten. De procedure omvat de voorbereiding van planten en bacteriën, gevolgd door een reeks inoculaties om de PTI-respons te evalueren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Plantimmunologie
- Celdood-assays
- Pathogeen-plantinteracties
Achtergrond
- PAM-geïnduceerde immuniteit (PTI) is een kritiek verdedigingsmechanisme bij planten.
- Nicotiana benthamiana wordt veel gebruikt voor het bestuderen van plantimmuniteit.
- Het begrijpen van PTI kan helpen bij het ontwikkelen van ziektebestendige plantvariëteiten.
- Celdood-assays zijn essentieel voor het evalueren van immuunresponsen.
Doel van de studie
- Om een methode te demonstreren voor het beoordelen van PTI in Nicotiana benthamiana.
- Om de rol van specifieke genen in de PTI-respons te onderzoeken.
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor onderzoekers in plantimmunologie.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van Nicotiana benthamiana-planten door bladeren te trimmen en te markeren.
- Groei van niet-pathogene bacteriën voor het induceren van PTI.
- Infiltratie van bacterieculturen in vooraf gemarkeerde bladgebieden.
- Evaluatie van celdoodresponsen na uitdagingsinoculaties.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle inductie van PTI werd waargenomen door middel van celdood-assays.
- Celdood in overlappende gebieden duidde op een afbreking van PTI.
- Controleplanten vertoonden normale PTI-responsen zonder celdood in de overlappende gebieden.
- Planten die voor specifieke genen waren uitgeschakeld, vertoonden verminderde PTI-responsen.
Conclusies
- De beschreven test evalueert effectief PTI in Nicotiana benthamiana.
- Het begrijpen van PTI-mechanismen kan plantteeltstrategieën informeren.
- Deze methode kan worden aangepast voor verschillende studies in plantimmuniteit.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This assay enables mechanistic de-risking of plant immune pathways by quantitatively linking PAMP recognition to downstream defense outputs. It supports target validation in agrochemical discovery by providing a reproducible readout for compounds that modulate PTI. The method enhances predictive confidence in early-stage screening for molecules that enhance or suppress plant immunity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates the FLS2-flg22 signaling axis to validate pattern recognition receptors as therapeutic targets.
- Operational Value: Uses a cell death phenotype to functionally confirm PTI competence or breakdown in genetic or chemical perturbation models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, spatially resolved outputs (overlapping vs. non-overlapping cell death) to distinguish PTI efficacy from ETI or disease susceptibility.
- Operational Value: Standardized in Nicotiana benthamiana, a scalable transient expression system amenable to high-throughput agroinfiltration workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects molecular initiation (PAMP-PRR binding) to organismal outcomes (cell death containment), enabling pathway continuity assessment.
- Operational Value: Facilitates cross-functional alignment between molecular biologists and plant pathologists via a shared phenotypic endpoint.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target engagement (PAMP-PRR binding) to functional validation (immune output) and phenotypic screening (compound library screening for immunomodulators).
- Discovery Biology: Tests whether a gene, protein, or small molecule modulates the earliest detectable output of PRR signaling.
- Screening: Delivers a binary, imaging-compatible readout (cell death presence/absence in overlap zone) amenable to automated scoring.
- Analytics: Enables comparison of PTI strength across genotypes or treatments via spatial quantification of defense responses.
- Translational Research: Bridges lab-based immune assays to field-relevant outcomes by modeling how early signaling affects disease resistance.
- Enterprise Reuse: Establishes a plug-and-play platform for testing diverse PAMPs, effectors, or microbial strains in a common phenotypic format.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking receptor activation to a defined immunological consequence.
- Operational Value: Requires only basic infiltration and microscopy equipment, enabling broad adoption across discovery and translational teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions in agrochemical lead optimization by predicting field-relevant immune priming capacity.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of immunomodulatory candidates based on mechanistic fidelity to native PTI.
Implementation Considerations
- Expertise in plant growth, bacterial culture, and leaf infiltration techniques.
- Access to controlled-environment growth chambers with precise humidity and lighting.
- Standardized bacterial strains and optical density adjustment protocols for reproducible PAMP delivery.
- Adaptation considerations for different plant species or PAMP-effectors beyond flg22-FLS2.
- Practical limitation: Assay sensitivity to environmental variables necessitates strict growth condition controls.
