Name: Test voor Pathogeen-geassocieerde Moleculaire Pattern (PAMP)-Triggered Immuniteit (PTI) in Planten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-09T16:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Leer een celdood-gebaseerde assay voor PTI in Nicotiana benthamiana. Deze methode gebruikt niet-pathogene bacteriën om plantimmuniteit te induceren en genfunctie te evalueren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Hye-Sook Oh, Joanne Morello en Alan Collmer, Departement Plant Pathologie en Plant-Microbe Biologie, Cornell University, voor waardevolle discussies. Wij danken Jesse Munkvold voor commentaar op het artikel. De financiering werd verstrekt door de National Science Foundation Plant Genome Program, award aantal DBI-0605059 (GBM).

Deel 1: Plantengroei en onderhoud Nicotiana benthamiana planten die in de test moet ongeveer 7 weken oud. Ze moeten worden ontdaan van ten minste 4-5 dagen voorafgaand aan de test om alle oksel takken en bloemen te verwijderen. Het is een goed idee om binnenkort te verwijderen oksel takken nadat ze ontstaan ​​in zodat de planten beter beheersbaar. Deel 2: Bacteriële cultuur DAG 1: <ol><li> Platen of culturen van alle stammen die in de test worden geïnitieerd op hetzelfde moment. Voor de Pseudomonas spp. waaronder twee inductoren en 3 uitdaging stammen, streep bacteriën op KBM platen met de juiste antibiotica van bevroren glycerol voorraden (tabel 2). Een kleine hoeveelheid bacteriën moet worden verspreid over het midden van de plaat. Incubeer de plaat bij 30 ° C gedurende ongeveer 18-24 uur. Voor Agrobacterium, start een vloeibare cultuur in 2 ml LB van een verse plaat en groeien &#39;s nachts bij 250 rpm, 30 ° C. </li></ol> DAG 2: <ol start="2"><li> Voor Pseudomonas, voeg 150 tot 200 pl van vloeistof KBM de bacteriën en verdeel ze over de gehele plaat met behulp van een steriele glazen strooier. Zet de plaat terug in de incubator en laten groeien voor een ander 20-24 uur. Er moet een bacteriële grasveld op de plaat de volgende dag worden, met vermelding van een goede groei. Voor Agrobacterium, start een tweede cultuur in ongeveer 5-10 ml LB met 20 iM acetosyringone en laat het &#39;s nachts tot 20 uur groeien bij 250 rpm, 30 ° C. </li></ol> Deel 3: Voorbereiden van planten voor de test DAG 2: <ol><li> Een dag voor de test van de planten moet worden verplaatst naar een kamer bij 22-24 ° C, ~ 35-40% RV en constant licht. </li><li> Markeer cirkels op bladeren die ten minste 1,5 cm in diameter met een dikke zwarte stift. Twee tot vier cirkels kunnen worden gemarkeerd per blad. De cirkels moet goed verdeeld en bij voorkeur niet over een grote ader. Kies een goed uitgebouwd bladeren. Voorkomen dat oudere bladeren of bladeren die zijn moeilijk of dik aanvoelt en vermijd markering cirkels op de lagere delen van het blad. </li></ol> Markering cirkels een dag voorafgaand aan het experiment is niet essentieel voor het protocol. Echter, het bespaart u tijd als er grote aantallen van planten worden getest, en maakt het makkelijker te bereiken nauwkeurige timing tussen de inductie van PTI en uitdaging inentingen. Deel 4: Inductie van PTI DAG 3: <ol><li> Oogst de cellen van de plaat in 10 mM MgCl 2 voor P. fluorescens en P. putida. Voor Agrobacterium, centrifuge de cultuur cellen te verzamelen en resuspendeer in 10 mM MgCl 2 + 10 mM MES pH 5,6. Herhaal het centrifugeren en resuspendeer in de MgCl 2-MES-oplossing. Meet de optische dichtheid (OD) van de cellen bij 600 nm. Stel de ODS tot de uiteindelijke gewenste waarden zoals beschreven in Tabel 2. Pseudomonas Ten slotte mag niet worden gesuspendeerd in 10 mM MgCl 2 en Agrobacterium in de MgCl 2-MES-oplossing. Een totaal volume van 25 ml is voldoende om ongeveer 40-50 plekken inoculeren. </li><li> Infiltreren het PTI inductoren in de pre-gemarkeerde cirkels op de bladeren met behulp van een 1 ml zonder naald spuit. Noteer de volgorde waarin de planten waren geïnfiltreerd en de exacte tijd waarop de infiltratie was begonnen. </li></ol> Deel 5: Challenge inoculatie <ol><li> Bereid P. syringae pv. tomaat DC3000, Pst DC3000 Δ hopQ1-1 en Ps pv. tabaci voor de uitdaging, zoals beschreven in deel 4.1 en Tabel 2. </li><li> Zeven uur na de inductor infiltratie, voert u de uitdaging infiltratie in dezelfde orde van planten als de inductie werd gedaan. In het algemeen kan een punt aan de rand van de eerste inenting cirkel gebruikt worden als het centrum van de tweede inenting cirkel. Als er meerdere vlekken op een blad zorg dan dat de infiltraties elkaar niet overlappen. </li><li> Plaat seriële verdunningen van alle culturen die in de test op de KBM-of LB-platen met de juiste antibiotica om het exacte aantal CFU te bepalen. </li></ol> Deel 6: Scoren voor afbraak van PTI Dag 5: <ol><li> Kijk voor het verschijnen van celdood als gevolg van ETI in de plekken die werden uitgedaagd met Pst DC3000. Celdood in het overlappende gebied van infiltratie geeft een overzicht van PTI en dient te worden gescoord als een positief fenotype. </li></ol> Dag 7: <ol start="2"><li> Kijk voor het verschijnen van celdood als gevolg van ziekte in de plekken die werden uitgedaagd met Pst DC3000 Δ hopQ1-1 of Ps pv. Tabaci </em&gt;. Score voor een positieve fenotype op dezelfde wijze als beschreven in deel 6.1. </li></ol> Wanneer de controle planten (die niet mag worden aangetast voor het PTI) beginnen te celdood show in het overlappende gebied van infiltratie, stoppen met het maken een verdere waarnemingen. Deel 7: Representatieve resultaten Figuur 1 toont het resultaat van een test bij het ​​P. fluorescens werd gebruikt als de inductor en Pst DC3000 als de uitdaging. <img src="/files/ftp_upload/1442/fig1tmb.jpg" alt="Figuur 1" border="0" /> Figuur 1. P. fluorescens was geïnfiltreerd op N. benthamiana bladeren (zwarte cirkel) naar PTI te induceren en 7 uur later, de plek werd uitgedaagd met Pst DC3000 (witte cirkel). Planten zwijgen voor FLS2 toonde een specificatie van PTI in de regio waar P. fluorescens was geïnfiltreerd (A), zoals gezien door celdood. Controle planten die niet zwijgen toonde geen celdood in het overlappende gebied als gevolg van inductie van PTI (B). Rode pijlen geven een gebrek aan of aanwezigheid van celdood in het overlappende gebied van infiltratie. Foto&#39;s werden genomen 2 dagen na de infiltraties. Gelieve <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1442/fig1.jpg">Klik hier</a> voor een grotere versie van figuur 1 te zien. <table border="1"><tbody><tr><td> PTI inductor </td><td> Celdood-uitlokken uitdaging </td><td> Aard van celdood </td><td> Code </td></tr><tr><td> Pseudomonas fluorescens 55 </td><td> Pseudomonas syringae pv tomaat (Pst.) DC3000 6 </td><td> ETI </td><td> Pf / DC </td></tr><tr><td> P. putida KT2440 </td><td> Pst DC3000 </td><td> ETI </td><td> Pp / DC </td></tr><tr><td> P. fluorescens 55 </td><td> Pst DC3000 Δ hopQ1-1 6 </td><td> Ziekte </td><td> Pf/Q1-1 </td></tr><tr><td> Agrobacterium tumefaciens GV2260 </td><td> P. syringae pv. tabaci 11528R </td><td> Ziekte </td><td> Agro / Ptab </td></tr></tbody></table> Tabel 1: Combinaties van PTI induceren en celdood-uitlokken van microben die in de cel dood test voor PTI. <table border="1"><tbody><tr><td> Bacteriestam </td><td> Selectiemedium </td><td> Laatste OD worden gebruikt in experiment </td><td> Overeenkomstige CFU / ml </td></tr><tr><td> P. fluorescens 55 </td><td> KBM Ampicilline (100 ug / ml) </td><td> 0.5 </td><td> 1 x 10 9 </td></tr><tr><td> P. putida KT2440 </td><td> KBM Ampicilline (100 ug / ml) </td><td> 0.5 </td><td> 1 x 10 8 </td></tr><tr><td> A. tumefaciens GV2260 </td><td> LB Rifampicine (100 ug / ml) </td><td> 0.5 </td><td> 5 x 10 8 </td></tr><tr><td> Pst DC3000 </td><td> KBM Rifampicine (100 ug / ml) </td><td> 0.02 </td><td> 2 x 10 7 </td></tr><tr><td> Pst DC3000 Δ hopQ1-1 </td><td> KBM Rifampicine (100 ug / ml) </td><td> 100-voudige verdunning van 0,1 </td><td> 1 x 10 6 </td></tr><tr><td> P. syringae pv. tabaci 11528R </td><td> KBM Rifampicine (100 ug / ml) </td><td> 100-voudige verdunning van 0,1 </td><td> 1 x 10 6 </td></tr></tbody></table> Tabel 2: Cultuur voorwaarden en inoculum niveaus worden gebruikt in de test. De OD en de bijbehorende CFU niveaus kan variëren tussen de verschillende merken van spectrofotometers.

<ol><li>Abramovitch, R. B., Anderson, J. C., Martin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+elicitation+and+evasion+of+plant+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bacterial elicitation and evasion of plant innate immunity.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (8), 601-60 (2006).</li>
<li>Jones, J. D., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plant+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The plant immune system.</a> Nature. 444 (7117), 323-323 (2006).</li>
<li>Zipfel, C., Robatzek, S., Navarro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+disease+resistance+in+Arabidopsis+through+flagellin+perception%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception.</a> Nature. 428 (6984), 764-764 (2004).</li>
<li>Oh, H. S., Collmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+resistance+against+bacteria+in+Nicotiana+benthamiana+leaves+is+accompanied+by+reduced+vascular+staining+and+suppressed+by+multiple+Pseudomonas+syringae+type+III+secretion+system+effector+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Basal resistance against bacteria in Nicotiana benthamiana leaves is accompanied by reduced vascular staining and suppressed by multiple Pseudomonas syringae type III secretion system effector proteins.</a> Plant J. 44 (2), 348-348 (2005).</li>
<li>Goodin, M. M., Zaitlin, D., Naidu, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotiana+benthamiana%3A+its+history+and+future+as+a+model+for+plant-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Nicotiana benthamiana: its history and future as a model for plant-pathogen interactions.</a> Mol Plant Microbe Interact. 21 (8), 1015-1015 (2008).</li>
<li>Wei, C. F., Kvitko, B. H., Shimizu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000+mutant+lacking+the+type+III+effector+HopQ1-1+is+able+to+cause+disease+in+the+model+plant+Nicotiana+benthamiana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">A Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 mutant lacking the type III effector HopQ1-1 is able to cause disease in the model plant Nicotiana benthamiana.</a> Plant J. 51 (1), 32-32 (2007).</li>
</ol>

De celdood-gebaseerde test kan worden gebruikt om de betrokkenheid van een gen in PTI te bepalen. Zo kan het verlies-van-functie mutanten voor een gen van interesse worden getest met deze test. Van de vier combinaties van inductor en uitdaging inentingen gegeven in tabel 1, is het mogelijk dat slechts een combinatie kan resulteren in een fenotype in uw installatie achtergrond. We hebben gezien dat planten zwijgen voor FLS2 een specificatie van PTI in het Pf / DC en Pf/Q1-1 combinaties van inductor en uitdaging inentingen (tabel 1) laten zien. Het is essentieel dat de milieu-omstandigheden voor de bepaling zo dicht mogelijk bij de beschreven in deel 3.1. Lage luchtvochtigheid veroorzaakt celdood om door te gaan te snel, waardoor de test moeilijk om te scoren. Als de voorwaarden zoals beschreven in ons protocol werken niet in uw laboratorium, probeer dan het veranderen van de hoogte van de inductor of uitdaging inenting. Een andere parameter die kan worden gewijzigd is de tijd tussen inductie en uitdaging, maar we hebben gemerkt dat de kortere tijd hiaten de oorzaak van de test af te breken te snel in controle planten. We raden ten minste 4-5 planten worden getest in een experiment en een positief fenotype moet worden herhaald in minstens 3-4 onafhankelijke experimenten.

<table><tbody><tr><td>MES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP300-100</td><td>Bereid als 1M voorraadoplossing, stel de pH in en steriliseer door filtratie. Bewaar bij kamertemperatuur.</td></tr><tr><td>Life Science UV/Vis Spectrofotometer</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>DU 730</td><td></td></tr></tbody></table>

test voor pathogeen-geassocieerde moleculaire pattern (pamp)-triggered immuniteit (pti) in planten

Assay for Pathogen-Associated Molecular Pattern (PAMP)-Triggered Immunity (PTI) in Plants

Waar te nemen potentiële ziekteverwekkers in hun omgeving, planten gebruiken patroonherkenning receptoren (PRRS) aanwezig op hun plasma-membranen. PRRS herkennen bewaard microbiële eigenschappen genoemd pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs) en deze detectie leidt tot PAMP-triggered immuniteit (PTI), die effectief kolonisatie van plantaardige weefsels voorkomt door niet-pathogenen 1,2. De meest bestudeerde systeem in PTI is de FLS2-afhankelijke route 3. FLS2 erkent de PAMP flg22 dat is een onderdeel van bacteriële flagelline. Succesvolle ziekteverwekkers bezitten virulentiefactoren of effectoren die kunnen onderdrukken PTI en laat de pathogeen de ziekte een te veroorzaken. Sommige planten op hun beurt hebben resistentiegenen die effectoren of hun activiteit, wat leidt tot effector-triggered immuniteit (ETI) 2 te detecteren. Beschrijven we een celdood-gebaseerde test voor het PTI gewijzigd ten opzichte van Oh en Collmer 4. De test werd gestandaardiseerd in N. benthamiana, die wordt steeds vaker gebruikt als een modelsysteem voor de studie van plant-pathogeen interacties 5. PTI is veroorzaakt door infiltratie van een niet-pathogene bacteriestam in de bladeren. Zeven uur later, een bacteriestam die ervoor zorgt dat een ziekte of die activeert ETI is geïnfiltreerd in een gebied overlappen de oorspronkelijke infiltratie zone. PTI veroorzaakt door de eerste infiltratie in staat is te vertragen of te voorkomen de schijn van celdood als gevolg van de tweede uitdaging infiltratie. Omgekeerd, het uiterlijk van celdood in het overlappende gebied van inenting geeft een overzicht van PTI. Vier verschillende combinaties van inductoren van PTI en uitdaging inentingen waren gestandaardiseerd (tabel 1). De test werd getest op niet-zwijgen N. benthamiana planten die diende als de controle-en planten zwijgen voor FLS2 die voorspeld worden aangetast in hun vermogen om PTI te ontwikkelen.

Een cel dood-gebaseerde test voor het PTI in Nicotiana benthamiana planten is beschreven.

Test voor Pathogeen-geassocieerde Moleculaire Pattern (PAMP)-Triggered Immuniteit (PTI) in Planten

Om potentiële pathogenen in hun omgeving waar te nemen, maken planten gebruik van patroonherkenningsreceptoren (PRR's) die zich op hun plasmamembranen bevinden. PRR's herkennen ...

Hallo, ik ben Suma TI van het laboratorium van Greg Martin aan het Voice Thompson Institute for Plant Research. Vandaag laten we u een procedure zien voor een assay gebaseerd op celdood voor PAM-getriggerde immuniteit of PTI. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om te onderzoeken of een gen betrokken is bij PTI.Laten we beginnen. Start de procedure door Nicotiana ANA te kweken tot ze ongeveer zeven weken oud zijn. Begin hiermee vier tot vijf dagen voorafgaand aan de start.De assay voor PAM-getriggerde immuniteit of PTI. Snoei de planten om alle okselvertakkingen en bloemen te verwijderen. Probeer de okselvertakkingen kort na het verschijnen te verwijderen om de planten hanteerbaarder te maken.Nadat de planten zijn voorbereid, kan worden overgegaan tot het kweken van de bacteriën. Deze procedure maakt gebruik van niet-pathogene bacteriën voor de inductie van plantimmuniteit voorafgaand aan een tweede inoculatie met challenge-bacteriën; start de groei van alle bacteriën die in de assay worden gebruikt. Gebruik tegelijkertijd de bevroren glycerolstocks van de pseudomonas-bacteriën voor elke pseudomonas-bacteriestock.Verspreid een kleine hoeveelheid bacteriën in het centrum van een KBM-plaat die het juiste antibioticum bevat en incubeer de plaat bij 30 °C gedurende ongeveer 18 tot 24 uur. Gebruik voor de agrobacterium een eerder bereide verse plaat om een vloeibare cultuur te starten in twee milliliter lb. Laat dit gedurende de nacht groeien bij 30 °C onder schudcondities tot de volgende dag.Voeg 150 tot 200 µL vloeibaar KBM toe aan de platen met pseudomonas-bacteriën. Verspreid de bacteriën over de gehele plaat met behulp van een steriele spreider.Plaats de platen gedurende nog eens 20 tot 24 uur terug in de incubator. Start voor Agrobacterium een secundaire cultuur in ongeveer 5 tot 10 milliliter LB met 20 micromolar aceton.Kweek de cultuur gedurende de nacht bij 30 °C onder schudcondities. Nadat de bacteriën zijn voorbereid, worden de planten voor de assay klaargemaakt op de dag voorafgaand aan de PTI-assay. Verplaats de planten na de voorbereiding van de bacteriën naar een ruimte van 22 tot 24 °C met een relatieve vochtigheid van ongeveer 35 tot 40% en constant licht.Gebruik vervolgens een dikke zwarte stift om cirkels op de bladeren te markeren. Kies goed uitgegroeide bladeren en vermijd oudere bladeren of bladeren die taai of dik aanvoelen. Vermijd het markeren van de onderste delen van het blad.De cirkels hebben een diameter van ten minste 1,5 centimeter en per blad kunnen twee tot vier cirkels worden gemarkeerd. De cirkels moeten voldoende uit elkaar geplaatst zijn en bij voorkeur geen grote nerf kruisen. Start de PTI-assay door de bacteriën te oogsten die worden gebruikt voor de inductie van PTI.De gebruikte pseudomonas-soorten moeten een bacterieel gazon hebben gevormd dat wijst op een goede groei. Oogst deze van de plaat door ze af te schrapen met een steriel lang houten stokje en resuspendeer ze in ongeveer 20 tot 25 milliliter 10 millimolair magnesiumchloride-oplossing voor agrobacterium-centrifugatie.Centrifugeer de cultuur om de cellen te verzamelen en resuspendeer deze in ongeveer 20 tot 25 milliliter van 10 millimolar magnesiumchloride plus 10 millimolar MES pH 5,6. Herhaal de centrifugatie en resuspendeer opnieuw in ongeveer 20 tot 25 milliliter van de magnesiumchloride plus MES-oplossing. De inducerende pseudomonas- en agrobacterium-bacteriën zijn nu geresuspendeerd.Meet de optische dichtheid van alle drie de culturen bij een golflengte van 600 nanometer. Pas de OD aan door de cellen te verdunnen met magnesiumchloride voor de pseudomonas en MES plus magnesiumchloride voor de agrobacterium. De uiteindelijke vereiste OD-waarden zijn te vinden in het bijbehorende geschreven protocol.Een totaal volume van 25 milliliters bacteriële cultuur is voldoende om ongeveer 40 tot 50 plekken te inoculeren. Begin nu de assay door de PTI-inductoren in de vooraf gemarkeerde cirkels op de bladeren te infiltreren met een spuit van één milliliter zonder naald. Noteer de volgorde waarin de planten zijn geïnfiltreerd en het exacte tijdstip waarop de infiltratie na de inductie is gestart.Voer de challenge-inoculatie uit enkele uren na de inductie-inoculatie. Oogst de bacteriële stammen die nodig zijn voor de challenge-inoculatie op dezelfde wijze als eerder getoond voor de inducerende pseudomonas-stammen. Meet opnieuw de OD en pas de concentratie van de culturen aan volgens het bijbehorende GR-protocol.Start de challenge-inoculatie zeven uur na de infiltratie van de induceerder. Gebruik de volgende combinaties van induceerder en challenger. Kies een punt op de periferie van de eerste inoculatiecirkel als het middelpunt van de tweede inoculatiecirkel.Voer de challenge-infiltratie uit in dezelfde volgorde van planten als bij de inductie. Als er meerdere plekken op een blad zijn, zorg er dan voor dat de infiltraties elkaar niet overlappen. Plateer tot slot seriële verdunningen van alle in de assay gebruikte culturen op KBM- of LB-platen die de juiste antibiotica bevatten.Twee dagen na de challenge-inoculatie kan men beginnen met het evalueren van de PTI-respons. Twee dagen na de inductie- en challenge-inoculaties moet er gezocht worden naar het verschijnen van celdood als gevolg van effector-getriggerde immuniteit of ETI in de plekken die zijn gechallenge-inoculeerd met PST DC 3000. Celdood binnen het overlappende infiltratiegebied duidt op een doorbraak van PTI en moet als een positief fenotype worden gescoord. Vier tot vijf dagen na de inductie- en challenge-inoculaties moet er gezocht worden naar het verschijnen van celdood als gevolg van ziekte in de plekken die zijn gechallenge-inoculeerd met de DC 3000 hop Q1-mutant of PS back high again. Zoek naar een doorbraak van PTI, die wordt aangegeven door celdood als gevolg van ziekte in het overlappende infiltratiegebied. Blijf de planten observeren totdat die planten waarvan de PTI niet is aangetast, celdood beginnen te vertonen in het overlappende infiltratiegebied.Planten waarin FLS twee is uitgeschakeld, vertonen een verminderde PTI twee dagen na inoculatie met de PFDC-combinatie. Celsterfte is zichtbaar in het overlappende gebied, wat wijst op een hapering van de PTI. Controleplanten waarin geen enkel gen is uitgeschakeld, werden ebenfalls geïnoculeerd met de PFDC-combinatie en twee dagen na uitvoering van de assay onderzocht; celsterfte als gevolg van de challenge is zichtbaar buiten, maar niet binnen het overlappende gebied, dankzij een normale PTI-respons.We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u een assay op basis van celdood uitvoert voor plant-getriggerde immuniteit of PTI. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de planten onder de door ons aanbevolen omgevingscondities moeten blijven. Hogere luchtvochtigheidsniveaus zouden de planten negatief beïnvloeden en ervoor zorgen dat de assay sneller verloopt.Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

assay-for-pathogen-associated-molecular-pattern-pamp-triggered

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

We hebben een eenvoudige en reproduceerbare protocol om stomatale reactie op de levende bacteriën te openen. Deze methode minimaliseert verwonden en manipulatie van het blad ten opzichte van het gebruik van de epidermale schillen eerder gerapporteerd.

Het beoordelen van stomatale Reactie op bacteriële cellen Live met behulp van Whole Leaf Imaging

We beschrijven hier een protocol voor de zuivering en karakterisering van plantaardig eiwit complexen. We zien dat door immunoprecipitatie een eiwit in een complex, zodat we kunnen zijn post-translationele modificaties en zijn interactie partners identificeren.

Identificatie van post-translationele modificaties van Plant eiwitcomplexen

Kwantificering van ziekteverwekkergroei is een krachtig hulpmiddel om verschillende Arabidopsis thaliana (hierna: Arabidopsis) immuunresponsen te karakteriseren. De hier beschreven methode presenteert een geoptimaliseerde spuitinfiltratie-assay om de groei van Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 in volwassen Arabidopsis-bladeren te kwantificeren.

Bacteriële Leaf Infiltratie Assay voor Beeldende karakterisatie van Plant Defense Reacties met behulp van de<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Pathosystem

Plant intercellulaire verbindingen, de plasmodesmata (Pd), spelen een centrale rol in plant fysiologie en plant-virus interacties. Kritische Pd vervoer zijn signalen dat rechtstreekse eiwitten aan Pd sorteren. Onze kennis over deze sequenties is echter nog in de kinderschoenen. Beschrijven we een strategie om te identificeren Pd lokalisatie signalen in Pd-gerichte eiwitten.

Identificatie van Plasmodesmal lokalisatie sequenties in eiwitten In Planta

Dit manuscript beschrijft een gemakkelijke en snelle experimentele procedure voor het bepalen van de eiwit-eiwitinteractie gebaseerd op de meting van luciferase activiteit.

Luciferase complementatie Imaging Assay in Nicotiana benthamiana bladeren voor Transient bepalen eiwit-eiwit interactie Dynamics

Dit artikel beschrijft twee methoden voor het kwantificeren van verdediging reacties in Arabidopsis thaliana na blootstelling aan immuun uitlokken: de voorbijgaande oxidatieve uitbarsting, en de remming van zaailing groei.

Patroon-geactiveerde oxidatieve burst en zaailing groeiremming assays in Arabidopsis thaliana

Hier beschreven is een nabijheid etikettering methode voor de identificatie van interactie partners van de TIR domein van de NLR immuunreceptor in Nicotiana benthamiana bladweefsel. Ook is een gedetailleerd protocol voor de identificatie van interacties tussen andere eiwitten van belang met behulp van deze techniek in Nicotiana en andere plantensoorten.

TurboID-Based Proximity Labeling voor in Planta Identificatie van Protein-Protein Interaction Networks

De zaailing overstromingstest vergemakkelijkt een snelle screening van wilde tomaten toetredingen voor de weerstand tegen de Pseudomonas syringae bacterie. Deze test, gebruikt in combinatie met de zaailing bacteriële groei test, kan helpen bij het verder karakteriseren van de onderliggende weerstand tegen de bacterie, en kan worden gebruikt om het scherm mapping populaties om de genetische basis van resistentie te bepalen.

High-Throughput Identificatie van resistentie tegen Pseudomonas syringae pv. Tomaat in Tomaat met seedling Flood Assay

Dit protocol presenteert een gedetailleerde samenvatting van strategieën om plantenwortels te enten met bodemmicroben. Voor de schimmels Verticillium longisporum en Verticillium dahliae worden drie verschillende wortelinfectiesystemen beschreven. Mogelijke toepassingen en mogelijke downstream analyses worden belicht en voor- of nadelen worden per systeem besproken.

Inentingsstrategieën om plantenwortels te infecteren met door de bodem overgedragen micro-organismen

Hier presenteren we een eenvoudige methode voor directe observatie en geautomatiseerde meting van stomatale reacties op bacteriële invasie in Arabidopsis thaliana. Deze methode maakt gebruik van een draagbaar stomatale beeldvormingsapparaat, samen met een beeldanalysepijplijn die is ontworpen voor bladbeelden die door het apparaat zijn vastgelegd.

Directe observatie en geautomatiseerde meting van stomatale responsen op Pseudomonas syringae pv. tomaat DC3000 in Arabidopsis thaliana

Dit protocol beschrijft een high-throughput benadering voor het evalueren van plantionenlekkage, peroxidaseactiviteit en calloseproductie in hetzelfde monster.

Evaluatie van bladreacties op microbiële secundaire metabolieten met behulp van een high-throughput formaat

Leer een celdood-gebaseerde assay voor PTI in Nicotiana benthamiana. Deze methode gebruikt niet-pathogene bacteriën om plantimmuniteit te induceren en genfunctie te evalueren.

Test voor Pathogeen-geassocieerde Moleculaire Pattern (PAMP)-Triggered Immuniteit (PTI) in Planten

Meer video's verkennen