Test voor Pathogeen-geassocieerde Moleculaire Pattern (PAMP)-Triggered Immuniteit (PTI) in Planten

Hallo, ik ben Suma TI van het laboratorium van Greg Martin aan het Voice Thompson Institute for Plant Research. Vandaag laten we u een procedure zien voor een assay gebaseerd op celdood voor PAM-getriggerde immuniteit of PTI. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om te onderzoeken of een gen betrokken is bij PTI.

Laten we beginnen. Start de procedure door Nicotiana ANA te kweken tot ze ongeveer zeven weken oud zijn. Begin hiermee vier tot vijf dagen voorafgaand aan de start.

De assay voor PAM-getriggerde immuniteit of PTI. Snoei de planten om alle okselvertakkingen en bloemen te verwijderen. Probeer de okselvertakkingen kort na het verschijnen te verwijderen om de planten hanteerbaarder te maken.

Nadat de planten zijn voorbereid, kan worden overgegaan tot het kweken van de bacteriën. Deze procedure maakt gebruik van niet-pathogene bacteriën voor de inductie van plantimmuniteit voorafgaand aan een tweede inoculatie met challenge-bacteriën; start de groei van alle bacteriën die in de assay worden gebruikt. Gebruik tegelijkertijd de bevroren glycerolstocks van de pseudomonas-bacteriën voor elke pseudomonas-bacteriestock.

Verspreid een kleine hoeveelheid bacteriën in het centrum van een KBM-plaat die het juiste antibioticum bevat en incubeer de plaat bij 30 °C gedurende ongeveer 18 tot 24 uur. Gebruik voor de agrobacterium een eerder bereide verse plaat om een vloeibare cultuur te starten in twee milliliter lb. Laat dit gedurende de nacht groeien bij 30 °C onder schudcondities tot de volgende dag.

Voeg 150 tot 200 µL vloeibaar KBM toe aan de platen met pseudomonas-bacteriën. Verspreid de bacteriën over de gehele plaat met behulp van een steriele spreider.

Plaats de platen gedurende nog eens 20 tot 24 uur terug in de incubator. Start voor Agrobacterium een secundaire cultuur in ongeveer 5 tot 10 milliliter LB met 20 micromolar aceton.

Kweek de cultuur gedurende de nacht bij 30 °C onder schudcondities. Nadat de bacteriën zijn voorbereid, worden de planten voor de assay klaargemaakt op de dag voorafgaand aan de PTI-assay. Verplaats de planten na de voorbereiding van de bacteriën naar een ruimte van 22 tot 24 °C met een relatieve vochtigheid van ongeveer 35 tot 40% en constant licht.

Gebruik vervolgens een dikke zwarte stift om cirkels op de bladeren te markeren. Kies goed uitgegroeide bladeren en vermijd oudere bladeren of bladeren die taai of dik aanvoelen. Vermijd het markeren van de onderste delen van het blad.

De cirkels hebben een diameter van ten minste 1,5 centimeter en per blad kunnen twee tot vier cirkels worden gemarkeerd. De cirkels moeten voldoende uit elkaar geplaatst zijn en bij voorkeur geen grote nerf kruisen. Start de PTI-assay door de bacteriën te oogsten die worden gebruikt voor de inductie van PTI.

De gebruikte pseudomonas-soorten moeten een bacterieel gazon hebben gevormd dat wijst op een goede groei. Oogst deze van de plaat door ze af te schrapen met een steriel lang houten stokje en resuspendeer ze in ongeveer 20 tot 25 milliliter 10 millimolair magnesiumchloride-oplossing voor agrobacterium-centrifugatie.

Centrifugeer de cultuur om de cellen te verzamelen en resuspendeer deze in ongeveer 20 tot 25 milliliter van 10 millimolar magnesiumchloride plus 10 millimolar MES pH 5,6. Herhaal de centrifugatie en resuspendeer opnieuw in ongeveer 20 tot 25 milliliter van de magnesiumchloride plus MES-oplossing. De inducerende pseudomonas- en agrobacterium-bacteriën zijn nu geresuspendeerd.

Meet de optische dichtheid van alle drie de culturen bij een golflengte van 600 nanometer. Pas de OD aan door de cellen te verdunnen met magnesiumchloride voor de pseudomonas en MES plus magnesiumchloride voor de agrobacterium. De uiteindelijke vereiste OD-waarden zijn te vinden in het bijbehorende geschreven protocol.

Een totaal volume van 25 milliliters bacteriële cultuur is voldoende om ongeveer 40 tot 50 plekken te inoculeren. Begin nu de assay door de PTI-inductoren in de vooraf gemarkeerde cirkels op de bladeren te infiltreren met een spuit van één milliliter zonder naald. Noteer de volgorde waarin de planten zijn geïnfiltreerd en het exacte tijdstip waarop de infiltratie na de inductie is gestart.

Voer de challenge-inoculatie uit enkele uren na de inductie-inoculatie. Oogst de bacteriële stammen die nodig zijn voor de challenge-inoculatie op dezelfde wijze als eerder getoond voor de inducerende pseudomonas-stammen. Meet opnieuw de OD en pas de concentratie van de culturen aan volgens het bijbehorende GR-protocol.

Start de challenge-inoculatie zeven uur na de infiltratie van de induceerder. Gebruik de volgende combinaties van induceerder en challenger. Kies een punt op de periferie van de eerste inoculatiecirkel als het middelpunt van de tweede inoculatiecirkel.

Voer de challenge-infiltratie uit in dezelfde volgorde van planten als bij de inductie. Als er meerdere plekken op een blad zijn, zorg er dan voor dat de infiltraties elkaar niet overlappen. Plateer tot slot seriële verdunningen van alle in de assay gebruikte culturen op KBM- of LB-platen die de juiste antibiotica bevatten.

Twee dagen na de challenge-inoculatie kan men beginnen met het evalueren van de PTI-respons. Twee dagen na de inductie- en challenge-inoculaties moet er gezocht worden naar het verschijnen van celdood als gevolg van effector-getriggerde immuniteit of ETI in de plekken die zijn gechallenge-inoculeerd met PST DC 3000. Celdood binnen het overlappende infiltratiegebied duidt op een doorbraak van PTI en moet als een positief fenotype worden gescoord. Vier tot vijf dagen na de inductie- en challenge-inoculaties moet er gezocht worden naar het verschijnen van celdood als gevolg van ziekte in de plekken die zijn gechallenge-inoculeerd met de DC 3000 hop Q1-mutant of PS back high again. Zoek naar een doorbraak van PTI, die wordt aangegeven door celdood als gevolg van ziekte in het overlappende infiltratiegebied. Blijf de planten observeren totdat die planten waarvan de PTI niet is aangetast, celdood beginnen te vertonen in het overlappende infiltratiegebied.

Planten waarin FLS twee is uitgeschakeld, vertonen een verminderde PTI twee dagen na inoculatie met de PFDC-combinatie. Celsterfte is zichtbaar in het overlappende gebied, wat wijst op een hapering van de PTI. Controleplanten waarin geen enkel gen is uitgeschakeld, werden ebenfalls geïnoculeerd met de PFDC-combinatie en twee dagen na uitvoering van de assay onderzocht; celsterfte als gevolg van de challenge is zichtbaar buiten, maar niet binnen het overlappende gebied, dankzij een normale PTI-respons.

We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u een assay op basis van celdood uitvoert voor plant-getriggerde immuniteit of PTI. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de planten onder de door ons aanbevolen omgevingscondities moeten blijven. Hogere luchtvochtigheidsniveaus zouden de planten negatief beïnvloeden en ervoor zorgen dat de assay sneller verloopt.

Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.