Name: Kwantitatieve Phosphoproteomics in Fatty Acid Gestimuleerd Saccharomyces cerevisiae /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-12T23:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 41 s
Description: Leer een kwantitatieve fosfoproteomics-methode voor Saccharomyces cerevisiae met cryolyse, HILIC-fractie en IMAC-verrijking. Deze techniek verbetert de analyse van fosfopeptiden via massaspectrometrie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen graag Dr Rich Rogers bedanken voor technische bijstand met massaspectrometrie analyses en behulpzaam discussies en Drs. Rob Moritz, Jeff Ranish, en Hamid Mirzai voor nuttige discussies. Dit werk werd gefinancierd door de NIH Centers of Excellence.

Celgroei en media <ol><li> Een enkele kolonie van BY4742Δarg4Δlys1 cellen &#39;s nachts in 100 ml rijke media om een OD 600 van 1,0 dan zaad in twee 1 liter culturen van een minimale gist medium (0,17% yeast nitrogen base, zonder ammoniumsulfaat of aminozuren, 0,5% ammonium sulfaat) met een volledige aanvulling van aminozuren, aangevuld met 20 mg / L van isotopisch normale of zware arginine (13 C 6 15 N 4, Isotec) en lysine (13 C 6 15 N 2; Isotec). </li><li> De cellen werden gekweekt gedurende 18 uur, tot een OD 600 van 1,8. Het is cruciaal dat de cellen gaan door minstens 9 generaties volledige opname van de gelabelde isotopen te bereiken. Het licht monster werd gepelleteerd, gewassen met steriel water, reseeded in een oleaat bevattend medium (isotopisch normale arginine en lysine, 0,2% oleaat (Sigma Chemicals) en 0,5% Tween 40 (Sigma Chemicals)) en gestimuleerd nog eens 85 minuten. Dit levert een isotopisch licht, met betrekking tot arginine en lysine, oleaat-gestimuleerde monster en een isotopisch zware glucose-grown referentiemonster. </li></ol> Cell Lysis, isolatie en fractionering van peptiden <ol start="3"><li> Weeg centrifuge fles. Oogst monsters door middel van centrifugeren gedurende 3 minuten. Verwijder de media en zuig overtollige vloeistof. Weeg pellet en een fles (zal typisch opbrengst tussen de 1-2 gram), dan knipperen vriezen in vloeibare stikstof. Voeg een volume dat overeenkomt met het gewicht van de pellet &#39;slijpen&#39; buffer om de bevroren pellets in vloeibare stikstof (fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, Gibco), 10% glycerol, proteaseremmers (SigmaFast proteaseremmer Tabletten, Sigma) en HALT fosfatase-remmers (Thermo Scientific )). </li><li> Freeze het slijpen schip in vloeibare stikstof. Wacht tot de vloeibare stikstof ophoudt koken. Breng de pellet aan het malen vaartuig, met bevroren kogellagers. </li><li> Grind bij 600 rpm met een 1 min 20 sec cyclus met een richting omkering gedurende 3 minuten. Opnieuw invriezen het slijpen schip in vloeibare stikstof. Herhaal dit vier keer gedurende 15 minuten in totaal slijpen tijd. </li><li> Verzamel de bevroren grindate in een 50 ml Falcon buis plaatsen droog ijs. Bewaren bij -80 ° C tot klaar voor gebruik. </li><li> Maak een oplossing van 10 ml 8M ureum, 0,1 M ammoniumbicarbonaat, 0,1 M Tris pH 8,6. Voeg drie volumes van de ureum buffer tot een volume van het bevroren grindate (bijvoorbeeld 3mls van het ureum buffer toegevoegd aan een 1 gram pellet met 1 ml PBS buffer). Onmiddellijk ultrasone trillingen het mengsel met een sonde ultrasoonapparaat (2 - 10 seconden pulsen). Houd de tip de buurt van de bodem van de buis om te voorkomen dat schuimvorming van de oplossing. De grindate moet onmiddellijk in oplossing gaan. </li><li> Schakel het lysaat door centrifugatie gedurende 5 minuten bij 4 ° C. </li><li> Overdracht supernatant in de frisse buizen. </li><li> Maak een verse hoeveelheid van 0,5 M Tris [2-carboxyethyl] fosfine (TCEP). Voeg toe aan monster op 1:100 voor een 5mm uiteindelijke concentratie. Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur </li><li> Alkylering van verminderde cysteines. Laat afkoelen tot kamertemperatuur. Maak een verse hoeveelheid van 1M joodacetamide. Houden in het donker (we de buis wikkelen in folie). Voeg toe aan een uiteindelijke concentratie van 20 mm. Incubeer in het donker gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. </li><li> Quench de joodacetamide met 20mm DTT van een 1M voorraad bij kamertemperatuur gedurende 1 uur </li><li> Kwantificeren van het eiwit met een standaard Bradford of BCA assay (niet beschreven). Neem een ​​monster voor analyse door middel van SDS PAGE hieronder. </li><li> Te valideren incorporatie van de zware isotopen, gebruik 100 ul van de gereduceerde en gealkyleerde lysaat. Verdunnen 1:4 met dH 2 O, ultrasone trillingen en voeg trypsine op 50:1 eiwit trypsine. Digest voor een minimum van 4 uur, droge monster in een Speed ​​Vac en daarna ontzouten met een C18 Ultramicrospin de kolommen (The Nest Group). <ol><li> Hydrate kolom met 100 ul van acetonitril </li><li> Equilibreren met 200 ul 0,1% TFA. </li><li> Resuspendeer droge monster in 200 ul 0,1% TFA. Belasting op kolom. Centrifugeer op 200 xg ~ of de minimale snelheid die nodig is voor stroming door de kolom. </li><li> Was tweemaal met 200 ul 0,1% TFA. </li><li> Twee keer elueren met met 50 ul 60% acetonitril, 0,1% TFA. </li><li> Monster in een Speed ​​Vac. </li><li> Resuspendeer monster in 20 ul 0,1% mierenzuur. Run 2 ui op een massa-spectrometer. Controleer integratie van isotopisch zware arginine en lysine door een 10 en 8 Dalton verschuiving in de respectieve m / z spectra. De opname voor elk aminozuur moet tussen 96 - 98%. </li></ol></li><li> Meng gelijke hoeveelheden (mg van eiwitten) van de isotopisch zware en lichte monsters. </li><li> Verdunnen sample 01:04 met 20% methanol. </li><li> Voeg trypsine op 1:200. Incubeer overnacht bij 37 ° C. </li><li> Controleer of de spijsvertering is gegaan tot voltooiing door middel van SDS PAGE. Run 2 en 4 pl van de predigestion monster en 8 eend 16 ul van de post trypsine verteren. Visualiseren door Coomassie kleuring die de spijsvertering is voltooid. Als het niet compleet is, ultrasone trillingen van het monster met een sonde ultrasoonapparaat kort en te verteren weer met trypsine. </li><li> Droog het monster in een Speed ​​Vac. Bij het ​​droog 200 ul van gefilterd dH 2 O en vortex toe te voegen tot de pellet in oplossing gaat. Droog monster in een Speed ​​Vac. Resuspendeer wederom met dH 2 O. Weer droog monster. </li><li> Resuspendeer pellet in 0,1% trifluorazijnzuur (TFA, Sigma). Controleer of de pH-waarde is ongeveer 3 met behulp van pH-strips. Als zuur nodig met 10% TFA. </li><li> Pellet van de oplossing. </li><li> Ontzouten van de monsters op een Waters Sep-Pak Vac 500 mg C18 kolom. Niet overbelasten deze kolommen. Het maximale bedrag is 5 mg maar het is beter te laden iets minder. Verdeel het monster over meerdere kolommen indien nodig. <ol><li> Hydrateren de kolom met 5 ml 100% acetonitril. Centrifugeer op 200 xg ~ of de minimale snelheid die nodig is voor stroming door de kolom. </li><li> Evenwicht kolom met 5 ml 0,1% TFA. Belasting monster. Verzamel stroom en laad het opnieuw. </li><li> Wassen met 5 ml 0,1% TFA. Herhalen. </li><li> Elueren met 2ml 60% acetonitril, 0,1% TFA. </li><li> Droog monster in een Speed ​​Vac. </li></ol></li></ol> Peptide Fractionering en isolatie van fosfopeptiden <ol><li> Peptiden zijn gefractioneerd op een HILIC kolom. We maken gebruik van een Tosoh TSK-Gel Amide-80 4,6 mm x 25 cm analytische kolom met een bewaker kolom. Neem de tijd met deze stap, voert de kolom gedurende 2 uur bij 90% A voert u twee lege hellingen voordat u uw monster. De maximale belasting op een column van deze grootte wordt gedacht dat ongeveer XX, we meestal niet belasting meer dan 5 mg per run. </li><li> Oplosmiddel A - 98% ACN/0.1% TFA Oplosmiddel B - 2% ACN/0.1% TFA Belasting in 90% A meer dan 20 &#39;, 90% A tot 85% A meer dan 5&#39;, 85% A tot 60% A meer dan 40 &#39;, 60% A tot 0% A meer dan 5&#39;, 0% A tot 90% A over 5 &#39;. </li><li> Het debiet is 1ml/min en fracties werden verzameld op 2 minuten met intervallen te beginnen bij de 85% A tot 60% A verloop. </li><li> Combineer fracties om het aantal fracties te verminderen tot 10. Verhoogde fracties zullen waarschijnlijk opleveren grotere dekking van de phosphoproteome. </li></ol> Verrijking van fosfopeptiden <ol><li> Fosfopeptiden zijn verrijkt met behulp van PHOS-Select Iron Affiniteit Gel. We aliquot onze IMAC hars om te voorkomen dat herhaalde vries ontdooien. Maak 50 ml van een 250 mM azijnzuur, 30% ACN belasting oplossing. Breng de pH op 2.7 met HCl. Resuspendeer pellets in 500 pi van de belasting-oplossing. Controleer de pH, aan te passen met HCl of NaOH als dat nodig is. </li><li> Voorwas 200 ul van IMAC kralen in een passende kolom. We maken gebruik van Molbiotec spin-kolommen. Voeg 15 ul van een 50% slurry (gel om de oplossing te laden) aan elke fractie, en incubeer de monsters voor 30 &#39;met een eind over eind rotatie. Houd de stroom voor analyse. </li><li> Was de monsters 3 keer met last-oplossing en een keer met 500 ul gefilterd dH 2 O. </li><li> Elueer peptiden met 2 - 3 min met 400 ul van 50 mM Na 2 HPO 4 (pH 8,4) buffer. Transfer naar een glazen flacon. </li><li> Verzuren tot pH 3 met 5 pi 100% mierenzuur, flash bevriezen in vloeibare stikstof, en gedroogde monster in een Speed ​​Vac. </li><li> Resuspendeer fosfopeptiden in 200 pi van 0,1% TFA en C18 schoon als hierboven beschreven. Droog naar beneden geëlueerd monsters in een Speed ​​Vac. </li><li> Resuspendeer peptiden in 20 pl van 0,1% mierenzuur. Gebruik 2 pi per massa-spectrometer analyse of als dat nodig is. </li></ol> Opmerkingen Voor veel van dit protocol dat u zult werken &#39;blind&#39;. De cel lysis kan worden gecontroleerd door western blotting en Bradford of BCA testen, en de trypsine spijsvertering kan ook gemakkelijk worden beoordeeld. De HILIC kolom gaf een trace vergelijkbaar met deze, of zoals door anderen gezien [1, 2] afhankelijk van de vloeistofchromatografie machine die wordt gebruikt. Monsters worden gecontroleerd door massa-spectrometrie, test je samples op goedkope machines, zoals LCQs of MALDIs voordat je naar de hoge kosten analyses op een hoge nauwkeurigheid van massa&#39;s, hoge resolutie machine. Tenslotte, indien u een droging in een monster met een zuur in, gebruik dan glas.

<ol><li>Albuquerque, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multidimensional+chromatography+technology+for+in-depth+phosphoproteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A multidimensional chromatography technology for in-depth phosphoproteome analysis.</a> Mol Cell Proteomics. 7 (7), 1389-1396 (2008).</li>
<li>McNulty, D. E., Annan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophilic+interaction+chromatography+reduces+the+complexity+of+the+phosphoproteome+and+improves+global+phosphopeptide+isolation+and+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Hydrophilic interaction chromatography reduces the complexity of the phosphoproteome and improves global phosphopeptide isolation and detection.</a> Mol Cell Proteomics. 7 (5), 971-980 (2008).</li>
<li>Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+complex+protein+mixtures+using+isotope-coded+affinity+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags.</a> Nat Biotechnol. 17 (10), 994-999 (1999).</li>
<li>Ross, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+protein+quantitation+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+amine-reactive+isobaric+tagging+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents.</a> Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).</li>
<li>Gruhler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+phosphoproteomics+applied+to+the+yeast+pheromone+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative phosphoproteomics applied to the yeast pheromone signaling pathway.</a> Mol Cell Proteomics. 4 (3), 310-327 (2005).</li>
<li>Wilson-Grady, J. T., Villen, J., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoproteome+analysis+of+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Phosphoproteome analysis of fission yeast.</a> J Proteome Res. 7 (3), 1088-1097 (2008).</li>
<li>Villen, J., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SCX%2FIMAC+enrichment+approach+for+global+phosphorylation+analysis+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The SCX/IMAC enrichment approach for global phosphorylation analysis by mass spectrometry.</a> Nat Protoc. 3 (10), 1630-1638 (2008).</li>
<li>Jensen, S. S., Larsen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+impact+of+some+experimental+procedures+on+different+phosphopeptide+enrichment+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the impact of some experimental procedures on different phosphopeptide enrichment techniques.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 21 (22), 3635-3645 (2007).</li>
<li>Larsen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+selective+enrichment+of+phosphorylated+peptides+from+peptide+mixtures+using+titanium+dioxide+microcolumns%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns.</a> Mol Cell Proteomics. 4 (7), 873-886 (2005).</li>
<li>Pinkse, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+isolation+at+the+femtomole+level+of+phosphopeptides+from+proteolytic+digests+using+2D-NanoLC-ESI-MS%2FMS+and+titanium+oxide+precolumns%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Selective isolation at the femtomole level of phosphopeptides from proteolytic digests using 2D-NanoLC-ESI-MS/MS and titanium oxide precolumns.</a> Anal Chem. 76 (14), 3935-3943 (2004).</li>
<li>Tao, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+phosphoproteome+analysis+using+a+dendrimer+conjugation+chemistry+and+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative phosphoproteome analysis using a dendrimer conjugation chemistry and tandem mass spectrometry.</a> Nat Methods. 2 (8), 591-598 (2005).</li>
<li>Zhou, H., Watts, J. D., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+approach+to+the+analysis+of+protein+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A systematic approach to the analysis of protein phosphorylation.</a> Nat Biotechnol. 19 (4), 375-378 (2001).</li>
<li>Bodenmiller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible+isolation+of+distinct%2C+overlapping+segments+of+the+phosphoproteome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Reproducible isolation of distinct, overlapping segments of the phosphoproteome.</a> Nat Methods. 4 (3), 231-237 (2007).</li>
</ol>

Deze methode levert een verrijking van fosfopeptiden die kwantitatief kunnen worden geanalyseerd. Een aantal parameters kunnen worden gewijzigd in dit protocol, maar het belangrijkste aspect om te onthouden is om het behoud van uw fosforylatie. Voorbereiding van de cellen voor de kwantificering kan worden bereikt in een aantal verschillende manieren, bijvoorbeeld als je niet kunt uw cellen label in vivo, tags zoals ICAT [3] of ITRAC [4] kan gebruikt worden na de winning tot differentieel label twee culturen voo...

<table><tbody><tr><td>Isotec&amp;#8482; L-arginine-&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;,&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;N&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>608033</td><td></td></tr><tr><td>Isotec&amp;#8482; L-lysine-&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>609021</td><td></td></tr><tr><td>GIBCO&amp;#8482; Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) 7,4 (10X) vloeistof</td><td>Invitrogen</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>SigmaFAST Protease Remmer Tabletten</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>78420</td><td></td></tr><tr><td>Retsch PM100 kogelmolenmaalmachine </td><td>Retsch</td><td>20.540.0001</td><td></td></tr><tr><td>Retsch 125 ml maalbeker van roestvrij staal</td><td>Retsch</td><td>01.462.0148</td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrospin C18-kolom</td><td>De Nest Groep</td><td>SUM SS10</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak Vac 500 mg C18</td><td>Waters</td><td>WAT043395</td><td></td></tr><tr><td>TSK-Gel Amide-80 4,6 mm x 25 cm analytische kolom</td><td>Tosoh Corp.</td><td>13071</td><td>Dit is de HILIC-chromatografische kolom.</td></tr><tr><td>Guardkolom 4,6 mm ID x 1 cm</td><td>Tosoh Corp.</td><td>19021</td><td>Wij raden deze guardkolom aan om de levensduur van uw HILIC-kolom te verlengen.</td></tr><tr><td>PHOS-Select&amp;#8482; IJzeraffiniteitsgel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9740</td><td>Dit is de IMAC-hars. Verdeel in aliquoten en bewaar.</td></tr></tbody></table>

kwantitatieve phosphoproteomics in fatty acid gestimuleerd saccharomyces cerevisiae</em

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Dit protocol beschrijft de groei en stimuleren, met het vetzuur oleaat, van isotopisch zware en lichte S. cerevisiae cellen. Cellen worden gemalen met behulp van een cryolysis procedure in een kogelmolen molen en de daaruit voortvloeiende grindate gebracht oplossing van ureum oplosbaar. Deze procedure maakt het mogelijk om lysis van de cellen in een metabool inactieve toestand, met behoud van fosforylatie en het voorkomen van heroriëntatie van de phosphoproteome tijdens de cel lysis. Na de reductie, alkylering, trypsine vertering van de eiwitten, worden de monsters ontzout op C18 kolommen en het monster complexiteit verminderd door fractionering met hydrofiele interactie chromatografie (HILIC). HILIC kolommen bij voorkeur behouden hydrofiele moleculen die goed geschikt is voor phosphoproteomics. Gefosforyleerde peptiden hebben de neiging om later elueren in de chromatografische profiel dan de niet gefosforyleerde tegenhangers. Na fractionering, zijn fosfopeptiden verrijkt met behulp van geïmmobiliseerde metalen chromatografie, die zich baseert op lading op basis van affiniteit voor Phosphopeptide verrijking. Aan het einde van deze procedure de monsters zijn klaar om kwantitatief worden geanalyseerd met behulp van massaspectrometrie.

Beschrijving van een kwantitatieve fosforylering procedure met behulp van cryolysis, ureum solubilziation, HILIC fractionering en IMAC verrijking van gefosforyleerde peptiden.

Kwantitatieve Phosphoproteomics in Fatty Acid Gestimuleerd Saccharomyces cerevisiae</em

Dit protocol beschrijft de kweek en stimulatie, met het vetzuur oleaat, van isotopisch zware en lichte S. cerevisiae-cellen. Cellen worden vermalen ...

Fosforylering is een cruciaal cellulair signaleringsmechanisme dat processen aanstuurt variërend van eiwitlokalisatie tot DNA-transcriptie, en de studie van fosforylering alleen via massaspectrometrie is een opwindende nieuwe vooruitgang in het onderzoek naar zowel signalering als proteomica. Differentieel gelabelde cellen worden gelyseerd in een kogelmolen, vervolgens gereduceerd, gealkyleerd, gemengd en gedigesteerd. De gedigesteerde peptiden worden gefractioneerd door middel van hydrofiele interactiechromatografie en fosfopeptiden worden uit de fracties verrijkt via iMac-verrijking.De met fosfopeptiden verrijkte fracties worden vervolgens geïdentificeerd via MS/MS. Hallo, ik ben Ramsey Celine van de E-groep aan het Institute Persistence Biology. Vandaag laten we u een procedure zien voor de extractie van metabolisch gelabelde fosfopeptiden.Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om het proteoom van de fossa kwantitatief te bestuderen. Laten we beginnen. Deze procedure start met het kweken van isotopisch lichte en zware gistcellen.Inoculeer eerst 100 milliliter rijk medium met een enkele kolonie gistcellen. Laat deze cultuur overnight groeien tot een OD 600 van 1,0. Gebruik deze vervolgens om twee culturen van één liter minimaal medium aan te zetten, die een volledige set aminozuren bevatten en zijn aangevuld met 20 milligram per liter isotopisch gelabelde.Kweek zowel de culturen met normale als met isotopisch zware arginine en lysine in volumes van één liter gedurende 18 uur tot een OD 600 van 1,8. Het is essentieel dat de cellen door ten minste negen generaties gaan om een volledige incorporatie van de gelabelde isotopen te bereiken. Wanneer de cellen de gelabelde isotopen volledig hebben geïncorporeerd, centreer de cellen die zijn gekweekt in het medium met isotopisch normale arginine en lysine.Om een celpellet te verkrijgen, wordt het pellet gewassen met steriel water en geplaatst in een medium met oleaat, houdend aan isotopisch normale arginine en lysine, en gedurende 85 minuten gestimuleerd. Dit levert een isotopisch licht, met oleaat gestimuleerd monster op. De andere cultuur, gegroeid in media met isotopisch zware arginine en lysine, wordt niet gestimuleerd met oleaat en dient als een isotopisch zwaar, op glucose gegroeid referentiemonster.Om één liter te verzamelen, wordt de cultuur verdeeld over vier centrifugeflessen van 250 milliliter. Na centrifugatie worden de cellen in één buis verzameld door slechts 100 milliliter van het medium te verwijderen, de cellen opnieuw te suspenderen en over te brengen naar de volgende buis. Aan het einde wordt één grote pellet verzameld in een enkele centrifugebuis door drie minuten te centrifugeren bij 4.000 RPM.Na het verwijderen van het medium wordt het gewicht van de centrifugefles met pellet vergeleken met dat van een lege centrifugefles. Verwijder na centrifugatie het medium en aspireer het overtollige vloeistof uit de flessen; weeg de pellets, waarbij een typisch rendement tussen één en twee gram ligt. Vervolgens worden de pellets snel ingevroren in vloeibare stikstof, waarna er een maalsuspensie die protease- en fosfataseremmers bevat aan de pellets wordt toegevoegd.Het volume toegevoegde maalbuffer dient gelijk te zijn aan het gewicht van het pellet. Bevries het maalvat in vloeibare stikstof. Wanneer de vloeibare stikstof is gestopt met koken.Gebruik een spatel om stukjes van het pellet af te schrapen en breng deze over naar het maalvat dat bevroren maalkogels bevat. Maal de pellets bij 600 RPM met een cyclus van één minuut gevolgd door een 22e cyclus met richtingsomkering gedurende drie minuten. Vries het maalvat opnieuw in vloeibare stikstof in.Herhaal het malen nog vier keer voor een totale duur van 15 minuten. Noteer de maaltijd zodra het malen voor beide monsters is voltooid. Verzamel het bevroren maalgut in 50 milliliter falcon tubes en bewaar deze bevroren in vloeibare stikstof of in droogijs.Bewaar het gemalen monster bij -80 °C tot gebruik. De isolatie en fractionering van de peptiden beginnen met hun alkylering. De eerste stap is het solubiliseren van het monster in de ureumoplossing.Los elk gemalen monster op door drie volumes ureumbuffer toe te voegen aan één volume bevroren gemalen monster. Voeg bijvoorbeeld drie milliliter RIA-buffer toe aan een pellet van één gram. Met één milliliter PBS-buffer.Soniceren het mengsel onmiddellijk met de probe. Gebruik tipsonificatie. Houd de tip nabij de bodem van de buis om schuimvorming van de oplossing te voorkomen.Het gemaalde materiaal moet onmiddellijk in de oplossing terechtkomen. Clarificeer de lysaten door centrifugatie bij 6.000 RPM gedurende vijf minuten. Draag de supernatant bij vier graden Celsius over naar nieuwe buisjes.Om de reductiereactie te starten, voegt u vers bereide 0,5 molar tris, twee carboxyl LITAL PHOSPHINE of TCEP toe aan elk monster in een verdunning van 1:100. Om een uiteindelijke TCEP-concentratie van 5 millimolar te bereiken, incubeert u de monsters gedurende één uur bij 37 °C. Laat de monsters na de incubatie bij 37 °C afkoelen tot kamertemperatuur.Voeg vervolgens vers bereide 1 M iodoacetamide toe tot een eindconcentratie van 20 mM en incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur in het donker. Na de incubatie van één uur wordt de iodoacetamide geneutraliseerd met 20 mM DTT. Laat dit gedurende één uur bij kamertemperatuur staan.De gereduceerde en gealkyleerde lysaten zijn nu klaar voor trypsinevertering. Op dit punt kunnen monsters van de lysaten worden gebruikt voor proteïnekwantificatie, SDS-page analyse om de cellyse te verifiëren en massaspectrometrie-analyse om de incorporatie van de zware isotopen te valideren. Om de trypsinevertering te starten, mengt u gelijkwaardige hoeveelheden van de isotopisch zware en lichte monsters.Verdun het monster één op vier met 20% methanol en voeg trypsine toe in een verdunning van één op 200. Incubeer het monster overnight bij 37 °C. Controleer de volgende dag of de digestie volledig is via SDS-PAGE en Coomassie-kleuring, en droog het monster vervolgens in een speedvac tot het monster droog is.Voeg 200 µL gefilterd gedestilleerd water toe en vortex tot het pellet is opgelost. Droog het monster in een speed vac en resuspendeer het opnieuw met gedestilleerd water. Nadat het monster opnieuw is gedroogd, wordt het pellet geresuspendeerd in 0,1% trifluorazijnzuur of TFA; controleer indien nodig met pH-strips of de pH rond de drie ligt. Verzuur met 10% TFA om eventuele neerslag uit het pellet te verwijderen.Het met trypsine verteerde monster wordt nu ontzout met een Waters Set Pack VAC 500 mg C18-kolom. Hydrateer de kolom eerst met 5 mL 100% acetonitril door te centrifugeren bij ongeveer 200 ×g of de minimale snelheid die nodig is voor doorstroming door de kolom. Equilibreer de kolom vervolgens met 5 mL 0,1% TFA en breng het monster over.Zorg ervoor dat de kolom niet overbelast raakt en verdeel de monsterhoeveelheid bij necessity over meerdere kolommen. Verzamel de doorloop in een afvalcontainer en belaad de kolom indien nodig opnieuw; was daarna met 5 mL 0,1% TFA. Herhaal deze wasstap en elueer vervolgens met 2 mL 60% acetonitril 0,1% TFA. De EEU moet worden opgevangen door middel van centrifugatie.Droog het monster in een speed vac en resuspendeer het gedroogde monster in 200 µL solvent B. Het geresuspendeerde monster is nu klaar voor peptidefractionering. Fractioneer de peptiden op een TSK gel AMIDE 80 analytische kolom met een guardkolom. Voer deze stap zorgvuldig uit. laat de kolom twee uur draaien met 90% solvent A en voer vervolgens twee blanco gradiënten uit voordat u uw monster injecteert. Normaal gesproken laden we niet meer dan vijf milligram per run op een kolom van deze grootte; moderne en zelfs minder moderne vloeistofchromatografiesystemen maken automatische monsterinjectie, fractieopvang, flowrate-controle en gradiëntmengsels mogelijk.Deze worden aan het begin van de run ingesteld zoals beschreven. Laad 90%A in over 20 minuten, 90%A naar 85%A over vijf minuten, 85%A naar 60%A over 40 minuten, 60%A naar 0%a over vijf minuten en 0%A naar 90%a over vijf minuten. Stel de stroomsnelheid in op één milliliter per minuut en verzamel fracties met intervallen van twee minuten.Combine fracties beginnend bij de gradiënt van 85%A naar 60%A om het aantal fracties te verminderen tot 10; een groter aantal fracties zal waarschijnlijk zorgen voor een bredere dekking van het fosfoproteoom. Fosfopeptiden worden verrijkt door middel van geïmmobiliseerde metaalaffiniteitschromatografie. Wij gebruiken de phos select iron affinity gel als iMac-hars.Resuspend eerst de pellets in 500 µL laadoplossing. Voeg vervolgens 15 µL van een 50% slurry toe aan elke fractie en incubeer de monsters gedurende 30 minuten met end-over-end rotatie. Bewaar de flow voor analyse.Was het monster drie keer met laadoplossing en eenmaal met 500 µL gefilterd gedestilleerd water; elueer na de wasbeurten de peptiden gedurende twee tot drie minuten met 400 µL van 50 mM natriumfosfaatbuffer. Breng de geëlueerde peptiden over naar een glazen vial. Voeg vijf µL 100% mierenzuur toe aan de peptiden om deze te verzuren tot pH 3, resuspendeer de fosfopeptiden in 200 µL 0,1% TFA en ontzout deze opnieuw met een C 18-kolom zoals eerder beschreven; droog de geëlueerde monsters vervolgens in een speed vac.Resuspendeer ten slotte de fosfopeptiden in 20 µL 0,1% mierenzuur. De monsters zijn nu klaar om kwantitatief te worden geanalyseerd via massaspectrometrie. Hier wordt een chromatografisch spoor getoond van de fractionering van totale cellulaire peptiden met gebruik van H-I-L-I-C chromatografie.In dit chromatogram is te zien dat hoewel fosfopeptiden over het gehele elutieprofiel worden aangetroffen, het merendeel van de gefosforyleerde residuen wordt vastgehouden tot bijna aan het einde van het elutieprofiel. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe cellen worden vermalen, eiwitten worden gedigereerd, peptiden worden gefractioneerd en fosfopeptiden worden verrijkt middels geïmmobiliseerde metaalaffiniteitschromatografie. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om eraan te denken de fosforylering te behouden en de pH van de buffers op te controleren.Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

quantitative-phosphoproteomics-fatty-acid-stimulated-saccharomyces

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschrijven we een nieuwe kwantitatieve proteomics-techniek voor het identificeren van eiwitcomplexen in Saccharomyces cerevisiae. In deze studie hebben we gebruik gemaakt van de SILAC methode, samen met affiniteit zuivering, gevolgd door tandem massaspectrometrie te identificeren met een hoge specificiteit van de binding partners van een ER-eiwit, Scs2p.

Identificatie van eiwit-complexen met kwantitatieve proteomics in S. cerevisiae

Beschrijven we een nieuwe kwantitatieve lipidomics methode voor het identificeren van een groot aantal soorten lipiden in gist met behulp van survey-scan electrospray ionisatie massa spectrometrie (ESI / MS). Deze methode dan op dit moment beschikbare methoden voor lipide identificatie en kwantificering in de mogelijkheid om verschillende moleculaire vormen van lipiden, gevoeligheid en snelheid op te lossen.

Een kwantitatieve beoordeling van de gist Lipidome met behulp van electrospray ionisatie massaspectrometrie

Twee aanvullende methoden op basis van flowcytometrie en microscopie gepresenteerd die de kwantificering van de enkele cel, de dynamiek van genexpressie geïnduceerd door de activering van MAPK route in gist mogelijk.

Temporele Kwantificering van MAPK geïnduceerde expressie in Single gistcellen

Dit artikel beschrijft een op groei gebaseerde gisttest voor de bepaling van genetische vereisten voor eiwitafbraak. Het demonstreert ook een methode voor snelle extractie van gisteiwitten, geschikt voor western blotting om biochemisch de afbraakvereisten te bevestigen. Deze technieken kunnen worden aangepast om de afbraak van een verscheidenheid aan eiwitten te monitoren.

-Groei op basis Vaststelling en Biochemische Bevestiging van Genetische Eisen voor de afbraak van eiwitten in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Veel voorspelde (fosfo)lipasen zijn slecht gekarakteriseerd met betrekking tot hun substraatspecificiteit en fysiologische functies. Hier bieden we een protocol om enzymactiviteiten te optimaliseren, naar natuurlijke substraten te zoeken en fysiologische functies voor deze enzymen voor te stellen.

Het definiëren van de ondergrond hebben voor lipase en fosfolipase Kandidaten

Dit protocol beschrijft een procedure om uitpakken en verrijken van phosphopeptides van prostaatkanker cellijnen of weefsels voor een analyse van de phosphoproteome via massa spectrometrie gebaseerde proteomics.

Verrijking van de Phosphopeptide in combinatie met kwantitatieve Label-vrije Spectrometrie van de massa te onderzoeken van de Phosphoproteome in prostaatkanker

We presenteren een protocol met behulp van vloeibare chromatografie in combinatie met tandem massaspectrometrie te identificeren en te kwantificeren belangrijke cellulaire lipiden in Saccharomyces cerevisiae. De beschreven methode voor een kwantitatieve beoordeling van belangrijke lipideklassen binnen een gistcel is veelzijdig, robuust en gevoelig.

Kwantitatieve analyse van de cellulaire lipidoom van Saccharomyces Cerevisiae met behulp van vloeibare chromatografie in combinatie met tandem massaspectrometrie

Hier wordt een fosfaatprotemische benadering gepresenteerd, namelijk stop and go extractietip op basis van phosfoproteom, die een hoge doorvoer en diepe dekking van Arabidopsis phosphoproteome biedt. Deze aanpak definieert het overzicht van osmotische stresssignalering in Arabidopsis.

Fosfaatprotemische strategie voor profilering osmotische stresssignalering in Arabidopsis

We presenteren een protocol voor de identificatie en kwantificering van belangrijke klassen van in water oplosbare metabolieten in de gist Saccharomyces cerevisiae. De beschreven methode is veelzijdig, robuust en gevoelig. Het maakt de scheiding van structurele isomeren en stereo-somerische vormen van in water oplosbare metabolieten van elkaar mogelijk.

Kwantitatieve metabolomica van Saccharomyces Cerevisiae met behulp van vloeistofchromatografie in combinatie met tandemmassaspectrometrie

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de metabolische etikettering van gist met 14C-azijnzuur, dat wordt gekoppeld aan dunnelaagchromatografie voor de scheiding van neutrale lipiden.

Analyse van neutrale lipidesynthese in Saccharomyces cerevisiae door metabole etikettering en dunne laagchromatografie

Hier introduceren we een protocol voor het gebruik van substraten met gistoppervlak voor enzymatische modificatietests. Het platform werd gedemonstreerd met behulp van de analyse van de defosforyleringsactiviteit van tyrosinefosfatase SHP-2 tegen een van zijn substraten als een representatieve enzymatische modificatietest.

Enzymatische modificatie en beoordeling van flowcytometrie van door het gistoppervlak weergegeven eiwitten

Leer een kwantitatieve fosfoproteomics-methode voor Saccharomyces cerevisiae met cryolyse, HILIC-fractie en IMAC-verrijking. Deze techniek verbetert de analyse van fosfopeptiden via massaspectrometrie.

Kwantitatieve Phosphoproteomics in Fatty Acid Gestimuleerd Saccharomyces cerevisiae

Meer video's verkennen