Uitputting van specifieke celpopulaties door Complement Uitputting

Complementdepletie is een snelle, effectieve en goedkope methode voor het zuiveren van immuuncelpopulaties. Complementdepletie begint wanneer monoklonale IGM- of IgG-antilichamen worden toegevoegd aan een celpopulatie, die zich richten op een specifiek celtype. In dit voorbeeld zullen we T-cellen targeten voor depletie.

Vervolgens wordt het complementsysteem toegevoegd om een proteolytische cascade te initiëren, wat leidt tot de dood van de T-cellen. De celpopulatie wordt daarna gecentrifugeerd, gewassen en gefilterd om dode cellen en debris te verwijderen. Deze methode voor complementdepletie resulteert doorgaans in de eliminatie van 95 tot 100% van de doelcelpopulatie.

Hallo, ik ben Bonnie Dittle. Ik ben onderzoeker bij het Blood Research Institute van het Blood Center of Wisconsin in Milwaukee. Vandaag ga ik u de techniek van complementdepletie laten zien, een snelle en goedkope methode voor de depletie van specifieke celpopulaties.

We gebruiken deze techniek in mijn laboratorium om immuuncelpopulaties sterk te verrijken, die we vervolgens gebruiken voor een reeks bioassays, waaronder die voor celactivatie en eiwitexpressieanalyse. Laten we beginnen. Bereid vóór aanvang van het experiment aliquots van 0,5 of 1 milliliter konijnencomplement voor en bewaar deze in een vriezer op -20 of -80 °C.

Zorg ervoor dat het complement getitreerd wordt naar een optimale verdunning tussen 1:10 en 1:20. Een uitstekende commerciële bron voor complement die wij routinematig voor deze procedure gebruiken, is die van Pereze Biologicals; muis- en konijn monoklonale antilichamen zijn over het algemeen effectief bij complementactivering, maar niet alle antilichamen zullen geschikt zijn. IgM-antilichamen zijn doorgaans het meest efficiënt voor complement-geïnduceerde cellyse.

IgG-antilichamen zijn de op één na meest efficiënte en worden doorgaans gebruikt omdat de meeste monoklonale antilichamen IgG zijn; titreer elk antilichaam voor optimaal gebruik bij een celdichtheid van 10⁷ cellen per milliliter, wat empirisch wordt bepaald. De meeste antilichamen worden gebruikt in het bereik van 0,1 tot 10 µg/mL. Voor de depletie van splenische T-cellen gebruiken we een monoklonaal antilichaam dat specifiek is voor TH1.

Om te beginnen met de complementdepletie worden de cellen verdund in celkweekmedium dat 5% hitte-geïnactiveerd foetaal kalfsserum bevat, zodanig dat de startpopulatie van de cellen 2 × 10⁷ cellen per milliliter bedraagt. Bijvoorbeeld: 5 × 10⁷ cellen moeten worden verdund in 2,5 milliliter medium. Dit celvolume is de helft van het eindvolume en daarmee twee keer de concentratie cellen die tijdens de depletie wordt gebruikt, welke 1 × 10⁷ cellen per milliliter zal zijn.

Bewaar op dit moment tot 1 × 10⁶ cellen, zodat de uitputting aan het einde van het experiment gekwantificeerd kan worden. Ontdooi daarnaast de benodigde hoeveelheid complement bij kamertemperatuur. We hebben vastgesteld dat een verdunning van 1:15 passend is bij gebruik van Pereze Biologicals konijnencomplement voor 5 × 10⁷ cellen; 1,5 ml bevroren Eloqua is hiervoor voldoende.

Voeg nu de juiste hoeveelheid antilichaam toe aan de celsuspensie en meng dit. Om het complement te steriliseren, gebruikt u een spuitpuntfilter met een lage eiwitbinding. Vul de spuit met één tot twee milliliters medium.

Voordat we het complement toevoegen aan 5 × 10⁷ cellen, hebben we 340 milliliter complement nodig voor een verdunning van 1:15. Filtreer het complement vervolgens direct in de buis met de cellen en het antilichaam. Pas nu het eindvolume in de buis aan, zodat de cellen een concentratie hebben van 1 × 10⁷ cellen per milliliter.

Laat de cellen vervolgens één uur incuberen bij 37 °C in een waterbad. Vergeet niet de cellen elke 15 minuten voorzichtig door omkering te mengen. Centrifugeer de cellen na de incubatie bij een snelheid die de levensvatbaarheid niet beïnvloedt.

Ga daarna terug naar de zuinige werkbank en verwijder het supernatant. Was vervolgens de cellen twee keer met 10 milliliters medium. Let op hoe het celdebris zich verzamelt, waarbij een deel aan de wanden van de polystyreenbuisjes blijft kleven.

Filter na de laatste wasbeurt de cellen door een steriele nylon cell drainer van 70 micron. Controleer tot slot de zuiverheid van de cellen door de celpopulatie van belang voor en na de flow-depletie te vergelijken.

Cytometrie en immunohistochemie zijn de voorkeursmethoden om de celzuiverheid vóór de experimenten te bepalen. Bij gebruik van een monoklonaal antilichaam dat zeer efficiënt complement activeert, zal de eerste ronde van complementdepletie de cellen met meer dan 95% reduceren. Als voorbeeld: bij het gebruik van flowcytometrie om het percentage alfa-beta T-cellen in een muizenplecytcelpreparaat te meten, stelden we vast dat deze 32,2% alfa-beta T-cellen bevatten na complementdepletie met anti-CD51, dat tot expressie wordt gebracht door alle T-cellen, maar niet door andere leukocyten. De TCR-beta-populatie werd met 95% verminderd tot een uiteindelijke concentratie van 1,56%.

Ik heb u zojuist een snelle en effectieve methode getoond voor het uitputten van specifieke celpopulaties met behulp van antigenspecifieke antilichamen via complement-depletie. Onthoud bij het uitvoeren van deze procedure dat u elk antilichaam moet testen op effectiviteit en dat u uw complement moet titreren in een pilotaal experiment voordat u begint. Dat is alles.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.