Lentivirus Productie
2 oktober 2009
Te maken lentivirussen, zijn DNA-vectoren getransfecteerd in humane 293 cellen. Na de oogst en het concentreren van de supernatant, is virustiter bepaald door fluorescentie expressie met een flowcytometer.
Deze procedure begint met het transfecteren van 2 9 3 T-cellen met lentivirus, plasmid en virale verpakkingsvectoren, het virale supernatant wordt na minimaal een 48-urige incubatieperiode geoogst. De snat wordt gefilterd om te worden geconcentreerd met een ultracentrifuge na ultracentrifugatie. Het virale pellet wordt opnieuw opgelost met PBS om de virustiter te verkrijgen, verdun eerst geconcentreerd virus in compleet medium, voer vervolgens een seriële verdunning uit om cellen met lentivirus te infecteren.
Hallo, ik ben Shein Wong van het laboratorium van Michael McManus in het Diabetes Center van de Universiteit van Californië San Francisco. Ik ben Michael McManus. Vandaag laten we je een procedure zien voor de productie van lentivirussen.
We gebruiken deze procedure in het laboratorium om lentivirussen te maken voor RNA-interferentie. Dus laten we beginnen. Om dit protocol te beginnen, bereid het DNA voor waarmee je de 2 9 3 T-cellen zal transfecteren.
Verdun eerst FU gen zes transfectie reagens in een 1,5 milliliter buisje door 30 microliter Fuji zes te mengen met 600 microliter serumvrij medium. Wees voorzichtig om Fuji niet aan de zijkant van de buis te laten raken terwijl je het in het medium brengt, incubeer op kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Meng vervolgens in de dop van de buis vier microgram lentiviraal plasmide met 1,33 microgram.
Elke derde generatie virale verpakkingsvectoren. Het lentivirale plasmide bevat het DNA. Het virus zal zich in het genoom van elke cel invoegen die infecteert, terwijl de verpakkingsvectoren genen bevatten voor alle andere eiwitten die nodig zijn om een lintenvirus te maken. Sluit de deksel en meng door de buis een paar keer om te draaien.
Incubeer het DNA en het transfectie reagens gedurende 15 tot 20 minuten bij kamertemperatuur. Nu is het tijd om 2 9 3 cellen te transfecteren met het DNA dat je hebt bereid. Gebruik cellen die je 24 uur van tevoren hebt geplaatst en die 50 tot 70% co-fluentie hebben bereikt in de weefselkweekhood. Pipette al het bereide DNA op de 2 9 3 plaat, meng voorzichtig door de plaat heen en weer te kantelen, plaats de cellen terug in de incubator en laat virale productie 48 tot 96 uur doorgaan voordat je oogst. Tijdens de incubatie produceren de 2 9 3 cellen lentivirussen waarvan de genomen een RNA-kopie van je DNA van belang bevatten.
Nu is het tijd om het virus te verzamelen. Haal je cellen uit de incubator. Heb in de weefselkweekhood klaar, een 0,4 of vijf micron spuitfilter, een wegwerpspuit van 10 milliliter en een UltraClear Beckman centrifugebuisje.
Gebruik de wegwerpspuit om het supernatant te verwijderen, dat nu het virus bevat. Bevestig een 0,45 micron spuitfilter op de punt en filter het virus in een UltraClear Beckman centrifugebuisje. Het filter laat alleen virussen passeren en geen cellen. Voordat je weggooit, incubeer alle virusproducerende cellen.
Cultuurplaten, spuiten en filters in 10%bleach gedurende 45 minuten. Nu je het virus hebt verzameld en gefilterd, is het tijd om het virus te concentreren door eerst ultracentrifugatie. Gebruik serumvrij DMEM om alle virusbevattende buisjes binnen 0,2 gram van elkaar uit te balanceren.
Laad vervolgens de uitgebalanceerde centrifugebuisjes in SW 41 TI of SW 28 rotoremmers. Sluit de rotoremmers en haak ze aan de rotor. Plaats vervolgens de rotor in de ultracentrifuge.
Centrifugeer het virus ongeveer 90 minuten bij vier graden Celsius bij 25.000 RPM in een SW 41 TI rotor, of 24.000 RPM in een SW 28 rotor. Na centrifugatie, keer terug naar de weefselkweekhood en draai de buis om om de SNAT in een container met 10%bleach te gieten. Gebruik een Kim doekje om overtollig vocht rond het pellet te absorberen en draai de buis om in een handige rek gedurende maximaal vijf minuten totdat je klaar bent om het pellet opnieuw op te schorsen.
Om het virale pellet opnieuw op te schorsen, gebruik een filtertip om 100 microliter steriele voorgefilterde PBS toe te voegen aan je buis. Pipetteer vervolgens ongeveer 20 keer op en neer. Laat het virus gedurende een nacht bij vier graden om de resuspendering te voltooien.
Je kunt virale preparaten gedurende ongeveer een week bij vier graden en gedurende maximaal een jaar bij min 80 graden bewaren. Vergeet niet alle lege buisjes te behandelen met 10%bleach voordat je ze weggooit. Als je de virale voorbereiding langer dan een week wilt gebruiken, zal het in de koelkast blijven.
Maak minimale aliquots van vijf tot 20 microliter voor toekomstige experimenten en één aliquot van drie tot vijf microliter voor de titratie. Vries en bewaar de aliquots op ongeveer min 80. De volgende stap is om de virale titer te bepalen. Als je een fluorescente reportergen in je lentivirale plasmide hebt opgenomen, zullen geïnfecteerde cellen fluoresceren en kun je de virale titer bepalen met behulp van flowcytometrie.
Om te beginnen, verdun drie microliter geconcentreerd virus in 1,5 milliliter compleet medium in putjes, één tot zes. In een enkele rij van een 96-well plaat. Voer de volgende seriële verdunningen uit voor alle zes de putjes bij 100 microliter compleet DM.Voeg in de eerste put 100 microliter medium toe zonder virus.
Dit is je ongekleurde controle. Voeg in de tweede put 100 microliter van de verdunde virus toe aan de derde. Voeg 100 microliter van de mix van de tweede put toe aan de vierde.
Voeg 100 microliter van de derde put toe aan de vijfde. Voeg 100 microliter van de vierde put toe en aan de zesde. Voeg 100 microliter van de vijfde toe.
Neem tenslotte 100 microliter uit de zesde put en gooi weg en bleek. Breng het totale volume in alle putjes op 200 microliter met DMEM. Bij elke verdunning neemt de virale concentratie met de helft af. Merk op dat dit slechts voorgestelde verdunningen zijn, die goed zouden moeten werken voor titratie van de meeste geconcentreerde virussen.
Als je virus laag in titer of ongeconcentreerd is, moet
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft de procedure voor het produceren van lentivirussen met behulp van menselijke 293 cellen. Het proces omvat het transfecteren van cellen met DNA-vectoren, het oogsten van het virale supernatant en het bepalen van het virustiter door middel van fluorescentie-expressie.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Virologie
- Gentherapie
- Celbiologie
Achtergrond
- Lentivirussen zijn waardevolle hulpmiddelen voor genoverdracht.
- Menselijke 293 cellen worden veel gebruikt voor virale productie.
- Het begrijpen van virustiter is cruciaal voor effectieve toepassingen.
- Fluorescentie-expressie maakt kwantificering van virale deeltjes mogelijk.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode voor lentivirusproductie te demonstreren.
- Om inzicht te geven in de transfectie- en oogstprocessen.
- Om het gebruik van lentivirussen in onderzoek en therapeutische toepassingen te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Transfectie van 293T cellen met lentivirus en verpakkingsvectoren.
- Incubatie gedurende minimaal 48 uur om virale productie mogelijk te maken.
- Oogsten en filteren van het virale supernatant.
- Ultracentrifugatie om het virus te concentreren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle productie van lentivirus vanuit 293T cellen.
- Effectieve concentratie van virale deeltjes door middel van ultracentrifugatie.
- Accurate bepaling van virustiter door middel van seriële verdunning.
- Demonstratie van de betrouwbaarheid van de procedure voor toekomstige toepassingen.
Conclusies
- De beschreven methode is efficiënt voor lentivirusproductie.
- Fluorescentie-gebaseerde titerbepaling is effectief.
- Dit protocol kan worden aangepast voor verschillende onderzoeksbehoeften.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Lentivirus production enables robust gene silencing and functional genomics studies across diverse cell types, supporting early discovery and target validation in biopharma R&D. Quantitative titering via flow cytometry ensures reproducibility and scalability for downstream screening and mechanistic studies. This capability underpins predictive confidence and risk-adjusted decision-making at key portfolio inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables stable gene knockdown for interrogation of gene function in disease-relevant systems.
- Supports mechanistic de-risking by allowing precise modulation of target expression.
- Facilitates functional target validation through reproducible delivery of shRNA constructs.
Screening & Assay Development
- Provides standardized lentiviral stocks for consistent assay development and compound screening.
- Delivers quantitative viral titers to ensure reproducible infection rates across experiments.
- Enables scalable production for high-throughput screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Supports continuity from in vitro discovery to preclinical model validation when gene silencing is required.
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling pathway interrogation in relevant cell systems.
- Reduces biological ambiguity in preclinical studies through controlled gene modulation.
Pipeline & Workflow Integration
Lentivirus production integrates into the discovery-to-preclinical continuum, providing a reusable platform for gene modulation and functional studies.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification via targeted gene knockdown.
- Screening: Supplies reproducible, titered viral stocks for assay readiness and quantitative outputs.
- Analytics: Enables precise measurement of infection efficiency and gene silencing via flow cytometry.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models through consistent gene modulation.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow adaptable across multiple targets and cell systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible lentiviral preparations.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust functional studies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, cell culture, and biosafety procedures.
- Needs access to ultracentrifugation and flow cytometry infrastructure for concentration and titering.
- Demands rigorous cross-team standardization for reproducible viral production and quantification.
- Adaptable to various cell types but may require optimization for specific systems.
- Strict biosafety and waste disposal protocols must be followed throughout the workflow.
