Name: Lentivirus Productie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-02T21:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Leer een betrouwbare methode voor lentivirusproductie met humane 293T-cellen via transfectie, oogsten en ultracentrifugatie. Deze procedure ondersteunt genedelivery-onderzoek en therapeutische toepassingen effectief.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Sandler Astma Basic Research Center (SABRE) Sandler Foundation

Deel 1: Transfectie van HEK 293 cellen te produceren Lentivirussen * 24 uur voor transfectie, plaat 2,5 X 10 6 cellen in een 10 cm schotel voor een confluentie van 50-70% de volgende dag. <ol><li> Begin dit protocol door het opstellen van het DNA waarmee men later transfecteren een de cellen van het virus te maken. De eerste, verdunnen Fugene 6 transfectiereagens Roche, een lipide reagens die deel uitmaken cellen nemen DNA. In een 1,5 ml tube, pipet 30μl Fugene 6 in 600ul serum-vrij medium (SFDMEM). Wees voorzichtig niet te laten Fugene de zijkant van de buis zoals het wordt geleverd in het medium. Laat dit Fugene en SFDMEM mix en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. </li><li> In de dop van de tube, mix 4 ug lentivirale plasmide met 4 mg elke 3 e generatie virale vectoren verpakking (pMDL, pRSV en pVSV-G). De lentivirale plasmide bevat het DNA van het virus zal voegen in het genoom van elke cel het infecteert, terwijl de verpakking vectoren bevatten genen voor alle andere eiwitten die nodig zijn om een ​​lentivirus te maken. </li><li> Sluit het deksel en meng door het buisje een paar keer. </li><li> Incubeer 15-20 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Pipet volledige inhoud van de tube in 293 plaat. Meng voorzichtig door het kantelen van plaat heen en weer. </li><li> Ga terug de cellen naar de incubator en laat virale productie voor 48-96 uur blijven voor de oogst. </li><li> Tijdens de incubatie, de 293-cellen transcriptie van het DNA van interesse van de lentivirale plasmide, het creëren van een RNA-kopie van de lentivirale bouwen. Ook transcriberen en vertalen van de genen in de verpakking vectoren in virale eiwitten. Deze eiwitten gaan naar virussen die de RNA-versie van uw lentivirale bouwen, dat het virus zal omkeren transcriberen en in te voegen in de genomen van alle cellen die het infecteert maken. </li></ol> Deel 2: Lentivirale Harvest <ol><li> Na de incubatieperiode, neem cellen uit de incubator en gebruik maken van een disposable, 10 ml injectiespuit op het supernatant, die nu het virus te verwijderen. Er zullen ongeveer 10 ml van het supernatant. </li><li> Bevestig een 0.45μM spuit filter om de tip en filter het virus in een Beekman Ultracentrifuge buis. Het filter laat alleen virussen, en niet cellen te passeren. </li><li> Voor weggooien, incubeer alle virus-producerende cellen, cultuur platen, spuiten en filters in 10% bleekwater voor 45 minuten. </li></ol> Deel 3: Lentivirale Concentratie via Ultracentrifugatie <ol><li> Laad centrifuge buizen in SW-41Ti of SW-28 rotor emmers. </li><li> Gebruik serum-vrij DMEM tot alle virus-bevattende balans buizen binnen 0.2g. </li><li> Seal gesloten rotor emmers en deze op de rotor haak voor het plaatsen van de rotor in de ultracentrifuge </li><li> Spin het virus gedurende 90 minuten in een ultracentrifuge bij 4 ° C bij 25.000 rpm in een SW-41Ti rotor of 24.000 rpm in een SW-28 rotor. </li><li> In een weefselkweek kap, omkeren buizen op zijn kop te supernatant giet het in een container met 10% bleekwater. </li><li> Gebruik een Kimwipe om overtollige vloeistof te absorberen om de pellet en de buis in een handig rek voor niet meer dan vijf minuten omkeren. </li><li> Om resuspendeer de virale pellet, gebruik maken van een filter tip om 100 pi steriel PBS toe te voegen aan de buis, dan pipet op en neer ongeveer 20 keer. </li><li> Laat het virus bij 4 ° C gedurende de nacht opnieuw ophanging te voltooien. Men kan opslaan virale preps bij 4 graden voor ongeveer 1 week en bij -80 graden tot maximaal een jaar. Vergeet niet om alle lege buizen te behandelen met 10% bleekmiddel voor weggooien. </li><li> Als men van plan om de virale prep gebruiken voor langer dan de 1 week, brengen minimale hoeveelheden van 5-20μl voor toekomstige experimenten en een hoeveelheid van 3 tot 5μl voor de titratie. Freeze en opslaan van de monsters bij min 80. </li></ol> Deel 4: Lentivirale Titratie met gebruik van doorstroomcytometrie <ol><li> De volgende stap is het bepalen van de virale titer door flowcytometrie. Deze methode werkt alleen in gevallen waarin de lentivirale plasmide bevat een fluorescerende reporter-gen. Het idee is dat wanneer het virus een cel infecteert, het de lentivirale plasmide DNA introduceert in het genoom van die cel. De geïnfecteerde cel zal dan transcriberen en vertalen van de genen die je hebt opgenomen in de lentivirale plasmide, en als je een tl-reporter-gen opgenomen, geïnfecteerde cellen zal fluoresceren. Het niveau van de fluorescentie vertegenwoordigt de potentie, of titer van het virus. </li><li> Voor elke virale voorraad worden getitreerd, verdunde 3 ui van geconcentreerde virus in 1,5 ml van complete media (DMEM, pen-strep, glutamine, FBS). </li><li> In putten 1-6 in een enkele rij van een 96 wells plaat, voert u de volgende seriële verdunningen: alle zes putten voeg 100 ul van complete DMEM media. Om de eerste goed 100μl van de media toe te voegen met geen virus (dit is uw onbesmet controle), de tweede goed 100 pi van de verdunde virus (dat is equivalent tot1 ml onverdunde virus), toe te voegen aan de derde en voeg 100 ulvan de mix van de tweede goed, de vierde en 100 ml toe te voegen van de 3e goed, op de vijfde goed 100μl uit de 4e goed, en tot de zesde goed toe te voegen Voeg 100 ul van de 5de goed. Eindelijk 100ul uit de 6e goed en gooi deze weg in het bleekmiddel. Een seriële verdunning werd uitgevoerd waarbij elk goed heeft helft van het volume van het virus in vergelijking met de vorige. </li><li> Breng het totale volume in alle putten 200μl. Merk op dat deze alleen gesuggereerd verdunningen, die goed zou moeten werken voor titering meest geconcentreerde virussen. Als het virus is laag in titer, of een ongeconcentreerde kan nodig zijn om de verdunningen aan te passen. </li><li> Behandel alle ongebruikte verdund virus met 10% bleekwater voor 45 minuten voor weggooien in een biologisch gevaarlijk afval container. </li><li> Voeg ~ 15.000 gezond, actief delende cellen 293 aan elk van de zes waterputten. Een 96-well plaat kan gebruikt worden om 16 virale preps titer. </li><li> Keer terug cellen tot 37 graden incubator met 5% CO 2 en laat infectie te gaan voor minstens 48 uur. </li><li> Na de incubatie worden de cellen geanalyseerd op reporter expressie (in ons geval fluorescentie) met een flowcytometer. Virale deeltjes worden gekwantificeerd door het percentage van fluorescerende cellen per well. </li></ol> Bereken het aantal infectieuze eenheden per ml met de volgende formule: <div style="text-align:center;"> (# Cellen per putje op de dag van de infectie X verslaggever positieve cellen) X 1000 ______________________________________________________ ml van de vector toegevoegd aan goed </div> Deel 5: representatieve resultaten: Na een 48-uur incubatie periode na transfectie, moet de plaat van 293-cellen op ongeveer 90% TL. Een hoog percentage van de fluorescerende cellen is een indicatie van een hoog percentage van het virus producerende cellen. Na het centrifugeren, de virale pellet is nauwelijks zichtbaar bij het mengen. Dit is normaal als de pellet is helder en zeer klein. Bij de interpretatie van flowcytometer resultaten, er rekening mee dat men alleen kan nauwkeurige berekeningen titer te bereiken bij geïnfecteerd (tl-) cellen hebben ontvangen niet meer dan een virale integratie per cel. Om ervoor te zorgen dat dit het geval is, gebruik van cellen met &lt;15% besmettingsgraad voor berekeningen. Cellen met een hoger infecties hebben ontvangen waarschijnlijk meerdere virale integranten per cel. De verdunningen gesuggereerd in stap 2 moet opleveren verschillende monsters binnen dit bereik van infectie. Idealiter maken gebruik van verschillende monsters een titratie plot (lineaire lijn) van waaruit u de uiteindelijke titer te berekenen te genereren, maar u kunt berekenen titer met een enkele steekproef, indien nodig. Men kan verwachten dat titer van 1,0 x 10 7 TU / ml voor niet-geconcentreerde virus en 1,0 x 10 8 TU / ml voor geconcentreerde virus.

<ol><li>Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+concentration+of+pseudotyped+HIV-1-based+gene+transfer+vectors.%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Production and concentration of pseudotyped HIV-1-based gene transfer vectors.</a> Gene Therapy. , 72-7211 (2000).</li>
<li>Dull, T., Zufferey, R., Kelly, M., Mandel, R. J., Nguyen, M., Trono, D., Naldini, L. J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>DMEM HEK 293T-cellen Penicilline-streptomycine Glutamine Fosfaatgebufferde zoutoplossing FBS</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FuGENE 6 transfectiereagens pSico mCherry pMDL pRSV pVSVG</td><td>Roche Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bleekmiddel</td><td>Clorox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10-cm celkweekschalen 96-wells celkweekplaten </td><td>Falcon BD</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Multichannelpipet</td><td>Rainin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gefilterde pipetpunten</td><td>Rainin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Eppendorf-buisjes Spuit Spuitfilter (0,45-&amp;mu;m)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifugebuisjes</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Weefselkweekincubator bij 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beckman SW41T.I-rotor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beckman ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentiemicroscoop</td><td>Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS Array</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

lentivirus productie

Lentivirus Production

RNA-interferentie (RNAi) is een systeem van gene silencing in levende cellen. In RNAi, genen homoloog in volgorde om korte interfererende RNA (siRNA) worden monddood gemaakt bij de post-transcriptionele staat. Short hairpin RNA&#39;s, voorlopers van siRNA, kan worden uitgedrukt met behulp van lentivirus, waardoor RNAi in een verscheidenheid van celtypen. Lentivirussen, zoals het Human Immunodeficiency Virus, in staat zijn om infecteren zowel delende als niet-delende cellen. We beschrijven een procedure die tot pakket lentivirussen. Verpakkingen verwijst naar de voorbereiding van de bevoegde virus uit DNA vectoren. Lentivirale vector productie systemen zijn gebaseerd op een &#39;split&#39; systeem, waar de natuurlijke virale genoom is opgesplitst in afzonderlijke helper plasmide constructen. Deze splitsing van de verschillende virale elementen in vier afzonderlijke vectoren vermindert het risico van een replicatie-capabele virus door toevallige recombinatie van de lentivirale genoom. Hier wordt een vector die de shRNA van rente en drie verpakkingen vectoren (p-VSVG, pRSV, pMDL) tijdelijk getransfecteerd in menselijke 293-cellen. Na ten minste een 48-uur incubatieperiode, is het virus bevat supernatant geoogst en geconcentreerd. Tot slot wordt virustiter bepaald door de verslaggever (TL), expressie met een flowcytometer.

Te maken lentivirussen, zijn DNA-vectoren getransfecteerd in humane 293 cellen. Na de oogst en het concentreren van de supernatant, is virustiter bepaald door fluorescentie expressie met een flowcytometer.

Lentivirus Productie

RNA-interferentie (RNAi) is een systeem voor gen-silencing in levende cellen. Bij RNAi worden genen die sequentie-homoloog zijn aan korte interfererende RNA's (siRNA) ...

Deze procedure begint met het transfecteren van 2 9 3 T-cellen met lentivirus, plasmide en virale verpakkingsvectoren; het virale supernatant wordt geoogst na een incubatieperiode van ten minste 48 uur. Het supernatant wordt gefiltreerd om vervolgens met een ultracentrifuge te worden geconcentreerd. De virale pellet wordt geresuspendeerd in PBS om de virustiter te bepalen; verdun eerst het geconcentreerde virus in compleet medium en voer daarna seriële verdunningen uit om cellen te infecteren met het lentivirus.Hoi, ik ben Shein Wong van het laboratorium van Michael McManus bij het Diabetes Center van de University of California San Francisco. Ik ben Michael McManus. Vandaag laten we u een procedure zien voor de productie van lentivirussen.We gebruiken deze procedure in het laboratorium om lentivirussen te maken voor RNA-interferentie. Laten we beginnen. Om dit protocol te starten, bereidt u het DNA voor waarmee de 2 9 3 T-cellen worden getransfecteerd.Verdun eerst FU gene six transfectiereagens in een buisje van 1,5 milliliter door 30 µL Fuji six te mengen met 600 µL serumvrij medium. Zorg ervoor dat Fuji de wand van het buisje niet raakt terwijl u het in het medium toevoegt; incubeer vijf minuten op kamertemperatuur. Meng vervolgens, in de dop van het buisje, 4 µg lentiviraal plasmide met 1,33 µg.Elk is een viraal verpakkingsvector van de derde generatie. Het lentivirale plasmide bevat het DNA. Het virus zal zich integreren in het genoom van elke cel die het infecteert, terwijl de verpakkingsvectoren genen bevatten voor alle andere eiwitten die nodig zijn om een lentivirus te maken; sluit de dop en meng door de buis een paar keer om te keren.Incubeer het DNA en het transfectiereagens 15 tot 20 minuten bij kamertemperatuur. Het is nu tijd om de 293-cellen te transfecteren met het door u voorbereide DNA; gebruik hiervoor cellen die u 24 uur vooraf heeft geplaatst en die een confluentie van 50 tot 70% hebben bereikt. Pipetteer in de weefkweekkap al het voorbereide DNA op de 293-plaat. Meng voorzichtig door de plaat heen en weer te kantelen, plaats de cellen terug in de incubator en laat de virale productie 48 tot 96 uur voortduren vóór de oogst. Tijdens de incubatie produceren de 293-cellen lentivirussen waarvan de genomen een RNA-kopie bevatten van uw DNA van interesse.Het is nu tijd om het virus te oogsten. Haal de cellen uit de incubator. Zet een spuitfilter van 0,4 of 5 micron, een wegwerpspuit van 10 milliliter en een UltraClear Beckman centrifugebuis klaar in de steriele werkbank.Gebruik de wegwerpspuit om het supernatant, waarin zich nu het virus bevindt, te verwijderen. Bevestig een spuitfilter van 0,45 micron aan de punt en filtreer het virus in een UltraClear Beckman centrifugebuis. Het filter laat alleen virussen en geen cellen door; gooi deze vervolgens weg en incubeer alle virusproducerende cellen.Kweekplaten, spuiten en filters gedurende 45 minuten in 10% bleekmiddel weken. Nu het virus is verzameld en gefilterd, is het tijd om het virus eerst te concentreren via ultracentrifugatie. Gebruik serumvrij DMEM om alle buizen met virus zo te balanceren dat het gewichtsverschil tussen elkaar maximaal 0,2 gram is.Laad vervolgens de gebalanceerde centrifugebuizen in de SW 41 TI of SW 28 rotorbuckets. Sluit de rotorbuckets af en bevestig ze aan de rotor. Plaats daarna de rotor in de ultracentrifuge.Centrifugeer het virus gedurende ongeveer 90 minuten bij vier graden Celsius op 25.000 RPM in een SW 41 TI rotor, of op 24.000 RPM in een SW 28 rotor. Keer na centrifugatie terug naar de celkweekkast en keer de buis om om het SNAT in een container met 10% bleekloog te gieten. Gebruik een Kim wipe om overtollige vloeistof rond de pellet te absorberen en plaats de buis ondersteboven in een geschikt rek voor maximaal vijf minuten, totdat u klaar bent om de pellet te resuspenderen.Voeg 100 µL steriele, vooraf gefiltreerde PBS toe aan de buis met een filtertip om het virale pellet opnieuw op te lossen. Pipetteer vervolgens ongeveer 20 keer op en neer. Laat het virus een nacht bij 4 °C staan om de resuspensie te voltooien.Virale preparaten kunnen ongeveer één week bij vier graden en tot één jaar bij min 80 graden worden bewaard. Vergeet niet om alle lege buisjes te behandelen met 10% bleekmiddel voordat u ze weggooit. Als u van plan bent het virale preparaat langer dan één week te gebruiken, kan dit in de koelkast worden bewaard.Maak minimale aliquots van 5 tot 20 µL voor toekomstige experimenten en één aliquot van 3 tot 5 µL voor de titratie-freeze, en bewaar de aliquots bij ongeveer -80 °C. De volgende stap is het bepalen van de virale titer. Als u een fluorescent reportergen in uw lentiviraal plasmide heeft opgenomen, zullen geïnfecteerde cellen fluoresceren en kunt u de virale titer bepalen met behulp van flowcytometrie.Begin met het verdunnen van drie µL geconcentreerd virus in 1,5 mL compleet medium in de putjes één tot en met zes, in een enkele rij van een 96-well plaat. Voer de volgende seriële verdunningen uit in alle zes de putjes met 100 µL compleet DM. Voeg aan het eerste putje 100 µL medium zonder virus toe.Dit is uw ongekleurde controle. Voeg aan de tweede put 100 µL van het verdunde virus toe. Voeg aan de derde put 100 µL van het mengsel uit de tweede put toe aan de vierde.Voeg 100 µL van de derde well toe aan de vijfde. Voeg 100 µL van de vierde well toe aan de zesde. Voeg 100 µL van de vijfde well toe.Neem ten slotte 100 µL uit het zesde putje, gooi dit weg en bleek het. Breng het totale volume in alle putjes aan met DMEM tot 200 µL. Bij elke verdunning wordt de virusconcentratie gehalveerd. Let op dat dit slechts voorgestelde verdunningen zijn, die goed zouden moeten werken voor het titreren van de meeste geconcentreerde virussen.Als uw virus een lage titer heeft of niet is geconcentreerd, moet u mogelijk uw verdunningen aanpassen. Behandel elk ongebruikt verdund virus gedurende 45 minuten met 10% bleekmiddel voordat u het in een container voor biologisch gevaarlijk afval werpt. Voeg ongeveer 15.000 gezonde, actief delende 2 9 3 T-cellen toe aan elk van de zes wells.U kunt een enkele 96-wells plaat gebruiken om 16 virale preparaten te titeren; vul de wells aan tot 200 µL, plaats de cellen terug in de incubator en laat de infectie gedurende ten minste 48 uur doorgaan. Analyseer na de incubatie de celfluorescentie met behulp van een flowcytometer. U kunt het percentage fluorescerende cellen per well gebruiken om de titer of het aantal infectieuze virale deeltjes per milliliter toegevoegd virus te bepalen.Bereken het aantal infectieuze eenheden per milliliter met de volgende formule bij het interpreteren van de resultaten van de flowcytometer. Houd er rekening mee dat nauwkeurige titerberekeningen alleen mogelijk zijn wanneer geïnfecteerde cellen niet meer dan één virale integratie per cel hebben ondergaan.Om er zeker van te zijn dat dit het geval is, moeten cellen met een infectiegraad van minder dan 15% worden gebruikt voor de berekeningen. Cellen met hogere infectiegraden hebben waarschijnlijk meerdere virale integraties per cel ondergaan. De verdunning die in stap twee wordt gesuggereerd, zou verschillende monsters binnen dit bereik van infectie moeten opleveren.Gebruik bij voorkeur meerdere monsters om een titratiecurve te genereren waarmee de uiteindelijke titer kan worden berekend. De formule uit de gefitte lineaire lijn kan worden gebruikt om de virale titer te bepalen, maar indien nodig kan de titer ook met één enkel monster worden berekend. Men kan een titer van 1 x 10⁷ transducerende eenheden per milliliter verwachten voor niet-geconcentreerd virus, en 1 x 10⁸ transducerende eenheden per milliliter voor geconcentreerd virus.We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u lentivirussen produceert bij het uitvoeren van deze procedure. Het is belangrijk om alle biosafety-voorschriften na te leven en afval op de juiste wijze af te voeren. Dat is alles.Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Lentivirale expressievectoren zijn het meest effectief voertuigen stabiel tot expressie verschillende effector-moleculen of reporter-constructen in delende en niet-delende zoogdiercellen en hele organismen. Hier bieden we een protocol over hoe lentivector expressie constructen te verpakken in pseudoviral deeltjes en target cellen met behulp van de pseudoviral deeltjes transduceren.

Verpakking HIV-of FIV-based Lentivector expressie constructen en transductie van VSV-G pseudogetypeerde virale deeltjes

In dit protocol beschrijven we de productie, zuivering en titratie van lentivirale vectoren. Wij bieden een voorbeeld van lentivirale vector-gemedieerde gen-levering in de eerste gekweekte neuronen en astrocyten. Onze methoden kunnen ook van toepassing op andere...

De productie van lentivirale vectoren voor transduceren Cellen van het centrale zenuwstelsel

Hier maken we gebruik van retrovirale transductie en concatemere transfectie van een cellijn die de componenten van een lentivirale vector (LV) in de afwezigheid van tetracycline kan uitdrukken. Dit LV GFP codeert en gepseudotypeerd met een glycoproteïne, SVGmu, dat specifiek is voor een receptor op dendritische cellen.

Een tetracycline-gereguleerde Cell Line Produceert hoge titer lentivirale vectoren die specifiek zijn gericht op dendritische cellen

Hier presenteren we protocollen die een flexibele en strategische basis bieden voor het op een virale manier manipuleren van oligodendrocytenvoorlopercellen om eiwitten van belang overexpressie te laten vertonen met als doel hun rol in oligodendrocyten specifiek te onderzoeken via het in vitro model van centrale zenuwstelsel myelinisatie.

Productie en gebruik van Lentivirus om selectief transduce Primaire Oligodendrocyte Precursor Cellen voor In Vitro Myelination Testen

Hier presenteren we een protocol voor de directe omzetting van muis embryonale fibroblasten in volledig functionele en stabiele trofoblast-stamcellen door tien dagen overexpressie van Tfap2c, Gata3, Eomes en Ets2.

Protocol voor de directe omzetting van muizen embryonale fibroblasten in Trofoblast Stamcellen

We beschrijven de strategie van de productie van integrase-deficiënte lentivirale vectoren (IDLVs) als voertuigen voor het leveren van CRISPR/Cas9 naar de cellen. Met een vermogen om te bemiddelen snelle en robuuste gene bewerken in cellen, IDLVs presenteren een veiliger en even effectieve vector platform voor de levering van het gen in vergelijking met integrase-bevoegde vectoren.

Een Protocol voor de productie van Integrase-deficiënte lentivirale vectoren voor CRISPR/Cas9-gemedieerde Gene knock-out in cellen verdelen

Hier presenteren we een protocol ter bevordering van de integratie van transgenic en productie van oprichter transgene muizen met hoge doeltreffendheid door een eenvoudige injectie van een lentivirale vector in de ruimte van de perivitelline van een bevruchte oöcyt.

Lentivirale gemedieerde productie van transgene muizen: een eenvoudige en zeer efficiënte methode voor directe studie van oprichters

Gerichte DNA epigenome bewerken vertegenwoordigt een krachtige therapeutische aanpak. Dit protocol beschrijft de productie, reiniging en concentratie van de alles-in-één lentivirale vectoren herbergen van de CRISPR-dCas9-DNMT3A-transgenic voor bewerken van epigenome's in menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel (hiPSC)-afgeleid van neuronen.

Lentivirale Vector Platform voor de efficiënte levering van Epigenome-bewerkingsgereedschap in mens geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige ziekte modellen

We demonstreren een stapsgewijs protocol voor het onderzoek naar de genfunctie in macrofagen in peritoneaal weefsel in vivo, met behulp van lentivirale vectoren.

Lentivirale vectorvoorbereiding voor efficiënte gen- en microRNA-modulatie van macrofagen in buikholte in vivo bij muizen

Polyglutamine spinocerebellaire ataxieën worden veroorzaakt door CAG-expansies die aggregatiegevoelige eiwitten produceren. Dit protocol beschrijft vectorproductie, stereotaxische toediening en analyse van inclusies en verlies van neuronale markers, en biedt een gecontroleerd platform om mechanismen te onderzoeken en gerichte therapieën voor neurodegeneratieve ziekten te evalueren.

Lentiviraal-geïnduceerde striatale pathologie als preklinisch model van polyglutamine spinocerebellaire ataxie

Hier beschrijven we een methode voor celgebaseerde visualisatie, subcellulaire lokalisatie en kwantitatieve analyse van poly(ADP-ribose) (PAR) verrijkte foci in vaste zoogdiercellen. Deze test maakt het mogelijk om plaatsen te kwantificeren van door DNA-schade veroorzaakte PARP-activatie, inclusief die geassocieerd met basenexcisieherstel of enkelstrengbreukreparatie, in de kernen van aan genotoxine blootgestelde cellen.

Visualisatie en kwantitatieve analyse van door genotoxine geïnduceerde PARP1/PARP2-activatie in cellen met behulp van een op fluorescent fusie eiwit gebaseerde reporter

Leer een betrouwbare methode voor lentivirusproductie met humane 293T-cellen via transfectie, oogsten en ultracentrifugatie. Deze procedure ondersteunt genedelivery-onderzoek en therapeutische toepassingen effectief.

Lentivirus Productie

Meer video's verkennen