Chromosomale Spread Voorbereiding van menselijke embryonale stamcellen voor Karyotypering

Introductie. Hallo. Wij komen van het Institute of Biometrical Science aan de Federal University of Faja in Brazilië. In deze video bereiden we chromosoomspreidings van menselijke embryonale stamcellen voor om mogelijke chromosoomafwijkingen te detecteren. Hoewel is aangetoond dat menselijke embryonale stamcellen een stabiel karyotype vertonen, hebben diverse studies gerapporteerd dat ze, afhankelijk van de kweekcondities, vatbaar worden voor het verkrijgen van chromosoomafwijkingen, zoals de toevoeging van gehele chromosomen of delen daarvan.

De karakterisering van de genetische integriteit van HASS in vitro is cruciaal, aangezien dit essentieel is voor embryogenese-studies en medicijntesten. Bovendien zijn chromosomale veranderingen een reëel punt van zorg voor toekomstige therapeutische voorstellen, omdat deze vaak geassocieerd worden met carcinogenese. Laten we beginnen.

Behandeling van de cellen met ate In deze procedure maken we hiervan gebruik. De acht tot negen heeft in F 12 gekweekt, aangevuld met 20% no count serum replacement en 80 tot negen gram per milliliter fibroblast groeifactor. Begin met het verwijderen van de kweekfles uit de incubator en voeg onder een laminaire flowkast coit toe tot een eindconcentratie van 0.1 µg/mL.

De toevoeging van Coit aan het medium induceert mitose, rust en metafase. Wanneer de chromosomen voldoende gecondenseerd zijn en onder de microscoop gemakkelijker te visualiseren zijn, dient u steriele technieken toe te passen om contaminatie te voorkomen. Nadat Coit is toegevoegd, sluit u de kolf en plaatst u de cellen terug in de incubator.

Het fixeren van de cellen na de incubatieperiode; de cellen zijn op dit punt nog niet klaar om gefixeerd te worden. Het is niet nodig om onder steriele omstandigheden te werken. Begin met het aspireren van het medium en voeg na voltoering trypsine toe.

Voeg 0,05% DTA toe aan de kolf. Zorg ervoor dat er voldoende trypsine wordt toegevoegd om het bodemoppervlak van de cellen te bedekken. Sluit de kolf af en schud deze voorzichtig heen en weer om de vloeistof gelijkmatig te verdelen.

Laat de cellen met de trypsine vijf minuten incuberen bij kamertemperatuur. Na vijf minuten incubatie bij kamertemperatuur zouden de cellen niet langer aan de onderzijde van de kolf gehecht moeten zijn; u moet de trypsine vervolgens inactiveren door medium met serum toe te voegen of door voorzichtig serum bij de cellen te voegen. Verwijder voorzichtig de dop van de kolf en voeg het medium of het serum toe, zodat de vloeistof over de cellen naar de onderzijde van de kolf stroomt.

Pipetteer de celstuspensie meerdere keren op en neer om de cellen volledig te dissociëren. Breng de cellen over naar een conische buis van 15 milliliter, maar zorg voordat u dit doet dat de cellen goed zijn gedissocieerd en dat de suspensie geen zichtbare celklonten bevat. Sluit de buis na de overdracht met een dop en centrifug.

Meng de suspensie door deze vijf minuten voorzichtig om te keren. Na centrifugatie bij 800 RPM moet er een celpellet onderin de buis aanwezig zijn. Zorg ervoor dat het celpellet niet wordt verstoord.

Zuig het supernatant af met een P 1000 totdat er nog ongeveer 200 microliters overblijft. Dit is een gemiddeld volume voor resuspensie. Suspendeer het pellet in Resus.

Resuspendeer het pellet. Tik enkele keren voorzichtig met uw vingers tegen de buis. Controleer of de cellen goed zijn geresuspendeerd door te kijken of er geen celklonten meer in de oplossing aanwezig zijn.

Op dit punt moet de oplossing troebel zijn. Voeg vervolgens vijf milliliter van een 75 millimolaire kaliumchloride-oplossing toe, vooraf opgewarmd tot 37 °C. De hypotone oplossing moet zeer langzaam aan de onderkant van de buis worden toegevoegd terwijl u de buis draait.

Nadat u de eerste drie milliliters heeft toegevoegd, sluit u de buis stevig en zorgvuldig af. Homogeniseer de cel-suspensie met een hypotone oplossing door de buis voorzichtig horizontaal te draaien en langzaam te roteren.

Vervolg door de resterende twee milliliters op dezelfde wijze als voorheen langzaam toe te voegen. Het doel van de hypotone oplossing is om het celvolume te vergroten, zodat de chromosomen kunnen ontwarren. Deze incubatieperiode is daarom cruciaal voor het verkrijgen van goede chromosoomspreidingen. Wanneer de volledige vijf milliliters zijn toegevoegd, sluit de buis af en incubeer de cellen in een waterbad bij exact 37 °C gedurende 15 minuten.

Wanneer de incubatieperiode van 15 minuten is voltooid, haal je de buis uit het waterbad. Op dit punt kun je in een zuurkast werken, aangezien de dampen die door de fixeeroplossing worden geproduceerd toxisch zijn. Als je geen toegang hebt tot een zuurkast, zorg er dan voor dat je in een goed geventileerde ruimte werkt.

Verwijder de dop van de buis en voeg drie druppels van de fixeeroplossing toe. Dit is een mengsel van methanol en azijnzuur in een verhouding van drie op één en dient op de dag van gebruik te worden bereid. Sluit de buis stevig af en draai de buis voorzichtig horizontaal terwijl deze langzaam roteert, eerst met de klok mee en daarna tegen de klok in.

Centrifugeer de buis vijf minuten lang bij 800 RPM zonder rem. Het is zeer belangrijk dat de centrifugecyclus langzaam tot stilstand komt om verlies van materiaal door celattritie na centrifugatie te voorkomen. Dit cardiosaat leeft in ongeveer 200.

Om het pellet te resuspenderen, tikt u meerdere keren voorzichtig met de vingers tegen de buis. Controleer of de cellen goed zijn gesuspendeerd door te kijken of er geen celklonten meer aanwezig zijn. Voeg de 3 mL fixeeroplossing langzaam langs de wand van de buis toe, terwijl u de buis roteert nadat de eerste 3 mL zijn toegevoegd.

Sluit de buis T stevig af en homogeniseer de celsuspensie zorgvuldig door de buis voorzichtig horizontaal te kantelen en langzaam te draaien. Zorg ervoor dat er ten minste één volledige omwenteling wordt gemaakt. Voeg meer toe om dit mengproces te maximaliseren.

Voeg twee milliliter van de fixeeroplossing toe langs de wand van het buisje om de cellen naar beneden te brengen. Bewaar de celsuspensie gedurende de nacht bij vier graden Celsius. Deze gefixeerde cellen kunnen gedurende maanden in de fixeeroplossing bij vier graden Celsius bewaard worden.

Was de cellen de volgende dag door deze vijf minuten te centrifugeren bij 800 RPM zonder rem. Verwijder het supernatant en laat ongeveer 200 µL achter. Resuspendeer het pellet door meerdere keren met de vingers tegen de buis te tikken.

Zorg ervoor dat de cellen goed zijn geassocieerd en dat de suspensie geen zichtbare celklonten bevat. Voeg langzaam vijf milliliter verse fixeeroplossing toe via de wand van de buis. Sluit de buis af en homogeniseer de cellen door de buis voorzichtig horizontaal te kantelen terwijl u deze langzaam draait.

Naast het beschermen van de cellen zorgt de fixeeroplossing voor het verwijderen van lipiden en vervolgens eiwitten, waardoor de chromosomen gemakkelijker uitspreiden. Centrifugeer de buis gedurende vijf minuten bij 800 RPM zonder onderbreking. Het bereiden van de objectglazen: laat bij de centrifugatiestap voldoende oplossing over om het celpellet te homogeniseren.

Deze hoeveelheid vloeistof kan afhangen van het aantal cellen. Tik met de vingers enkele keren voorzichtig tegen de buis. Controleer of er geen zichtbare celklonten aanwezig zijn om er zeker van te zijn dat de cellen goed zijn gesuspendeerd.

Op dit punt moet de oplossing worden toegevoegd: breng 20 tot 30 µL cel-suspensie aan op een schone, droge objectglas door de pipet parallel aan het oppervlak te bewegen. Terwijl de fixeersolution verdampt, wordt het oppervlak onmiddellijk korrelig. Houd deze zijde 30 seconden lang met de voorkant naar boven in de stoom van heet water om de cellen te laten opzwellen.

Analyse van deze preparaten. Analyseer de preparaten na de bereiding onder een fasecontrastmicroscoop met de 10x en de 40x objectieven om te controleren of de celdichtheid geschikt is voor verdere analyse. Dit preparaat is een voorbeeld van een te hoge concentratie.

Let op dat de celkernen te dicht bij de metafase-spreidingen liggen. Als u een objectglas heeft waarbij de celdichtheid te hoog is, verdun dan de celsuspensie door meer fixeersolutie toe te voegen. Dit objectglas toont de gewenste celdichtheid.

Let op dat de metafase-spreidingen goed verspreid en geïsoleerd zijn. Zodra een objectglas met een optimale celdichtheid is verkregen, kan dit worden gekleurd en geanalyseerd. Vermijd het kiezen van metafasen die zich dicht bij de kern bevinden, omdat chromosomen mogelijk verborgen zijn of uit het zicht worden geblokkeerd.

Zoek naar metafasen die afgerond zijn, maar zorg ervoor dat er geen chromosomen recht van de metafase afstaan; kies twee metafasen die afgerond en goed geïsoleerd zijn. Zoals in de volgende dia, probeert u het rapporteren van foutieve IES te vermijden, zoals het winnen van chromosomen veroorzaakt door twee extra spreidingen. Meng het geheel, of het verlies van chromosomen veroorzaakt door rechte chromosomen.

We hopen dat deze video u zal helpen bij uw verdere experimenten. Mocht u nog vragen hebben, aarzel dan niet om contact met ons op te nemen. Veel succes en geniet ervan.