Gebruik van de Protease Fluorescerende Detection Kit om Protease activiteit te bepalen

Dit protocol begint met het toevoegen van incubatiebuffer, FXI-caseïne-oplossing en een monster met het protease van belang aan een microcentrifugebuis, waarna het geheel voorzichtig wordt gemengd en 60 minuten bij 37 °C in het donker wordt geïncubeerd. Om de proteolytische reactie aan het einde van de incubatieperiode te stoppen, wordt TCA-oplossing toegevoegd, waarna men opnieuw voorzichtig mengt en 30 minuten bij 37 °C in het donker incubeert. Deze stap zorgt ervoor dat het niet-gereageerde substraat neerslaat.

Centrifugeer het monster gedurende 10 minuten bij 10.000 Gs. Verwijder het supernatant, dat de zuuroplosbare gelabelde FXI-fragmenten bevat. Draag het supernatant over naar een vette of multi-wellplaat, verdun dit met assaybuffer en lees het monster af op een fluorimeter.

Hallo, ik ben Carrie Cup Vineyard en ik ben een wetenschapper bij onze Sigma Aldridge DeKalb-faciliteit in St. Louis, Missouri. Vandaag laat ik u een procedure zien voor de fluorometrische bepaling van protease-activiteit. We gebruiken deze procedure in ons kwaliteitscontrolelaboratorium om een lage protease-activiteit vast te stellen.

Laten we beginnen. Voor deze procedure worden de incubatiebuffer, de assaybuffer en de 0,6 normale trichloroctazijnzuur- of TCA-oplossing geleverd als gebruiksklare oplossingen. Verdeel de oplossing van fite met het label Cain in kleinere volumes en bewaar deze bij minus 20 graden Celsius. Zorg ervoor dat de oplossing tegen licht wordt beschermd door amberkleurige vials te gebruiken of door transparante buizen in folie te wikkelen.

Het gebruik van het fite Cain-substraat minimaliseert de noodzaak van herhaalde vries-dooi-cycli; herhaalde vries-dooi-cycli of krachtig schudden of mengen van de fite Cain kunnen leiden tot scheiding van de fite van de Cain, wat resulteert in een hogere achtergrond. Bereid de fit-controleoplossing als u de fluorimeter kalibreert of het lineaire bereik voor het fit e-signaal bepaalt. Maak de oplossing vers door deze te reconstitueren in assaybuffer tot de juiste concentratie.

Zodra dit gereed is, dient de oplossing tegen licht te worden beschermd. Bereid ten slotte de trypsin-proteasecontrole voor door 100 µL van 1 mM zoutzuur toe te voegen aan het vial met gelyofiliseerd trypsin en meng dit kort om te garanderen dat het trypsin is opgelost. Het bewaren van trypsin onder zure omstandigheden verhoogt de stabiliteit ervan.

Let op dat de Tripsin-controlesolutie temperatuurgevoelig is en niet stabiel is bij lage concentraties. Begin vervolgens met het voorbereiden van alle assay-monsters, inclusief de testmonsters, controles en blanco's gedurende de gehele assay. Houd de monsters voor elk testmonster beschermd tegen licht.

Combineer 20 µL incubatiebuffer, 20 µL van het fit c kian substraat en 10 µL van het testmonster in een microcentrifugebuisje. Men kan een transparant microcentrifugebuisje gebruiken, mits het monster in het donker wordt geïncubeerd. Let er ook op dat testmonsters met een hoge proteaseactiviteit verdund moeten worden.

De trypsine-controlemonster dient als positieve controle om te bevestigen dat de assay correct functioneert, om de detectielimiet te bepalen of om een algemene standaardcurve op te stellen. Om de trypsine-controle voor te bereiden, mengt u één deel aangezuurde trypsine met negen delen incubatiebuffer of de buffer die voor de testmonsters wordt gebruikt, en mengt u dit grondig. De uiteindelijke werkconcentratie van trypsine is 20 µg/mL. Indien een andere specifieke protease wordt gebruikt, dient de controleoplossing met die specifieke protease en een passende buffer te worden bereid.

Bereid de controlemonster verder voor door 20 µL incubatiebuffer, 20 µL fz cain-substraat en 10 µL van de trypsinecontrole in een microcentrifugebuisje te combineren. Het wordt aanbevolen om bij elke analyse minstens één controlemonster van 5 ng trypsine uit te voeren of om seriële verdunning te gebruiken. Het laatste monster is de blanco, bereid door 20 µL incubatiebuffer, 20 µL van het Fitz Caine-substraat en 10 µL ultrapuur water in een microcentrifugebuisje te combineren.

Wanneer de drie typen monsters gereed zijn, meng dan elke buis voorzichtig en incubeer deze 60 minuten lang bij 37 °C in het donker. Let erop niet te krachtig te mengen, aangezien overmatige turbulentie kan leiden tot een hoge fluorescentieachtergrond en de gevoeligheid van de assay kan verminderen. Men kan tot 24 uur incuberen om de gevoeligheid te verhogen, maar langere incubatietijden worden niet aanbevolen omdat het FXI-caseïne kan beginnen af te breken.

Om een hoge fluorescentieachtergrond na voltooiing van de incubatie te voorkomen, dient men geschikte beschermingsmiddelen te gebruiken bij het toevoegen van 150 µL van de TCA-oplossing aan elke microcentrifugebuis. Na incubatie met TCA moet er een witte waas in de buis zichtbaar zijn, wat duidt op het neerslaan van de onverteerde en onoplosbare caseïnemix; meng dit voorzichtig en incubeer 30 minuten lang bij 37 °C in het donker. Centrifugeer de buizen aan het einde van de incubatie met de TCA-oplossing gedurende 10 minuten bij 10.000 Gs bij kamertemperatuur.

Het supernatant bevat de zuuroplosbare fite-gelabelde Cain-fragmenten die worden gebruikt voor de fluorescentiemeting; pipetteer voorzichtig van de bovenkant van de buis, zodat er geen neerslag uit het pellet in de pipetpunt wordt getrokken, aangezien dit een fout-positieve uitslag zal geven tijdens de volgende fluorescentiedetectie. Om de protease-activiteit met een fluorimeter te meten, worden 10 µL van het TCA-supernatant gecombineerd met één milliliter assaybuffer in een buis en voorzichtig gemengd. Daarnaast wordt de FE-standaard voor analyse verdund door 10 µL FE toe te voegen aan één milliliter assaybuffer. De FE-controle en Tripsin-standaard geven een fluorescentieniveau dat het monster niet mag overschrijden. De oplossing van het TCA-supernatant en de assaybuffer kan in het donker bij 2 tot 8 °C worden bewaard voor maximaal 24 uur voordat de fluorescentie wordt gemeten.

Als er een cuvet wordt gebruikt voor de meting, breng dan 1 mL van de oplossing over naar een geschikte cuvet; indien een groot aantal monsters moet worden geanalyseerd, kan een 96-wellplaat en een fluorescentieplaatlezer worden gebruikt om fluorometrische gegevens te verkrijgen. In deze assay dient fluoresceïne-isothiocyanaat als controle voor een mogelijke instrumentkalibratie. Hier wordt een representatief lineariteitsbereik van het FS e-signaal getoond na toepassing van de beschreven procedure.

Het gebruik van deze kit met een incubatietijd van 30 minuten voor de eerste incubatiestap resulteert in deze typische standaardcurve voor trypsine en controlemonsters variërend van 1,5 nanogram tot 25 nanogram. Fluorescentiemetingen werden uitgevoerd in een multi-well plaat. De detectielimiet van de assay is de hoeveelheid protease die een significante fluorescentiewaarde produceert boven de waarde die met het blanco monster is verkregen.

Vandaag hebben we gedemonstreerd hoe u de Sigma Aldridge protease-determinatiekit gebruikt om fluorimetrische proteaseactiviteit in een biologisch monster aan te tonen. Hoewel deze kit is geoptimaliseerd voor gebruik, is het belangrijk om te onthouden dat u voor uw specifieke proteasen mogelijk kleine aanpassingen moet maken. Dat is alles.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.