Name: DNA Transfectie van zoogdieren skeletspieren met behulp van In Vivo Elektroporatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 56 s
Description: Leer DNA-transfectie in muizen skeletspieren met in vivo elektroporatie. Deze methode maakt visualisatie van eiwitexpressie mogelijk via fluorescentiemicroscopie voor genexpressiestudies.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken dr. T. Otis, afdeling Neurobiologie, UCLA, voor het delen van de TPLSM faciliteit met ons, dr. C. Fahlke, Instituut voor Fysiologie, RWTH Aachen, Duitsland, voor het soort schenking van de pEYFP-ClC1 plasmide, en de heer . R. Serrano voor technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door subsidies van NIH / NIAMS beurzen AR047664 en AR54816.

Experimentele procedures voor in vivo elektroporatie van de FDB en IO spieren <ol><li> Voordat u begint met de in vivo elektroporatie protocollen moeten zoogdieren expressieplasmiden worden versterkt de concentratie opbrengst in het bereik van tot 2-5 ug plasmide / ul van TE. NB: We routinematig gebruik van commerciële versterking kits en volg de fabrikant procedures. Commerciële expressieplasmiden het dragen van de CMV promoter werken heel goed in de skeletspieren in vivo transfecties. </li><li> Aliquot het nodige volume (10-20 ul) van het plasmide oplossing en sla het op in twee 0,5 ml Eppendorf buizen (een voor elke voet van de muis). </li><li> Bereid een oplossing die 2 mg / ml hyaluronidase in steriele Tyrode. </li><li> Met behulp van een verlamming doos, diep verdoven een muis met behulp van 4% isofluraan in O2 met een goedgekeurde gas narcose machine. Leg het dier op een verwarmingselement (37 ° C) en onderhouden van de anesthesie met behulp van een knaagdier gezichtsmasker. Monitor de narcose diepte teen knijpen reflex. </li><li> Onder observatie met een dissectie microscoop, injecteren 10 pi van de hyaluronidase oplossing onder de voetzolen van een voet van de muis met behulp van een een &quot;lange 33 gauge steriele naald. Door de huid dringen op een punt dicht bij de hiel van de voet en subcutaan vooraf de naald naar de basis van de tenen voor ~ 1 / 4 &quot;. </li><li> Herhaal de procedure met de andere voet indien gewenst. </li><li> Koppel de anesthesie en plaats de muis in een kooi. Laat het volledig herstellen van anesthesie. </li><li> Na een uur, verdoven het dier voor de tweede keer en plaats deze op de verwarming pad. Volgens dezelfde procedure beschreven voor de oplossing hyaluronidase, injecteren een totaal van 20-50 ug van het plasmide DNA (afhankelijk van de grootte van het plasmide construct). Het totale injectievolume moet minder dan 20 pL / voet zijn. Opmerking: wanneer 15-20 μ L nodig is, is het raadzaam om de huid te sluiten bij de naald ingang met tissue-lijm. </li><li> Koppel de anesthesie en plaats de muis in een kooi. Laat het volledig herstellen van de narcose en voor 10-15 minuten te wachten. </li><li> Verdoven het dier voor de derde keer en plaats het op de verwarming pad. </li><li> Selecteer een voet van het dier. Plaats een vergulde acupunctuur naald onder de huid aan de hiel, en een tweede aan de onderkant van de tenen. Elektroden zijn georiënteerd evenwijdig aan elkaar en loodrecht op de lange as van de voet. </li><li> Sluit het hoofd van de naalden (elektroden) om de elektrische stimulator met behulp van micro-clip connectoren. Electroporate de spieren door het toepassen van 20 pulsen, 20 ms in duur / stuk, bij 1Hz. Afhankelijk van de afstand tussen de elektroden, is voltage amplitude van de pulsen &#39;aangepast (door de monitoring met een oscilloscoop) om een elektrisch veld van ~ 100 V / cm Let op opbrengst:. Geen contracties in reactie op de stimuli moeten worden geobserveerd indien het niveau van de verdoving voldoende is. </li><li> Indien gewenst, herhaalt u de bovenstaande procedures in de contralaterale voet van het dier. </li><li> Ga terug het dier zijn kooi en een keer volledig hersteld van de narcose te onderhouden onder observatie. Opmerking: als de procedure ging normaal, het dier moet volledige mobiliteit terug te krijgen binnen 30 minuten en daarna is klaar om terug te worden gestuurd naar het dier kamer in het terrarium. De injecties van hyaluronidase en DNA in de voetzolen hebben geen merkbare negatieve effecten op de dieren. Eenmaal hersteld van anesthesie, muizen zijn in staat om normaal te kuieren rond de kooi. Als extra voorzorgsmaatregel, toe te voegen aan het drinkwater van het dier Carprofen op 0,0027 mg / ml gedurende 2 dagen als een pijnstiller. </li><li> Eiwitexpressie kan worden getest 2-8 dagen na transfectie. Echter, aanhoudende expressie van vele eiwitten waargenomen voor maanden. </li></ol> OPMERKING: Alle dieren procedures werden goedgekeurd door Animal van de UCLA kanselier Research Committee als mandataris van de Animal Welfare Act en de PHS beleid inzake Humane zorg en het gebruik van proefdieren. Representatieve resultaten: De correcte toepassing van de in vivo elektroporatie hierboven beschreven procedures moeten leiden tot daadwerkelijke transfectie van plasmiden in FDB en IO spieren. Echter, de efficiëntie van de expressie van transgeen eiwit varianten zal afhangen van het plasmide, de omvang en complexiteit van het eiwit, de functionele eigenschappen van het eiwit, en een aantal andere variabelen buiten onze controle. Zoals geïllustreerd in Figuur 1 voor een FDB-spier geëlektroporeerd in de aanwezigheid van een commerciële plasmide (PMR-mCherry) dat codeert voor mCherry eiwit, zijn de meeste van de spiervezels getransfecteerd met ons protocol zoals wordt geïllustreerd door het feit dat de meesten van hen weer te geven rode fluorescentie. Dit sluit niet uit dat individuele vezels verschillende graden van eiwitexpressie vertonen, of dat er weinig vezels niet getransfecteerd op alle 3. Het moet be merkte op dat de efficiënte expressie van grote hoeveelheden van fluorescerende eiwitten zoals mCherry, EGFP, ECFP, en EYFP, niet de spiervezels &#39;prikkelbaarheid en excitatie-contractie koppeling eigenschappen beïnvloeden. In feite zijn ze niet te onderscheiden van die in de sham getransfecteerde spieren (resultaten niet getoond). Praktische benaderingen gebruikt om de gelokaliseerde expressie van fluorescent-gemerkte eiwitten in de skeletspieren vezels te controleren. De intracellulaire lokalisatie van de di novo uitgedrukt transgene eiwitten wordt routinematig geëvalueerd door gelijktijdig het verwerven, het gebruik van de TPLSM, fluorescerende beelden van de respectievelijke labels en beelden van goed-geïdentificeerde markers van cellulaire structuren. De meest typische van deze laatste zijn: a) tweede harmonische generatie (SHG) beelden, die voortvloeien uit de myosine anisotropie van de sarcomeer A banden (gecentreerd op de M-lijnen) en 9,10, b), di-8-ANEPPS fluorescentie beelden, die kunnen worden verkregen door middel van etikettering het oppervlak en dwarse tubulaire (T-tubulus) systeem membranen van de spiervezels met deze impermeant potentiometrische dye11. In fluorescentie beelden van spiervezels gekleurd met di-8-ANEPPS, de T-tubuli verschijnen als smalle banden van de fluorescentie georiënteerd ongeveer loodrecht op de lange as van de vezel. Deze banden zijn ongelijk afstand van elkaar: ze zijn van elkaar gescheiden door een lange afstand die zich uitstrekt over de M-lijnen, en een korte een dat zich uitstrekt over de Z-lijn 11. Expressie en lokalisatie van α-actinine-EGFP in de skeletspier vezels. Een voorbeeld van de uitdrukking van een gelabeld variant van de structurele spiereiwit α-actinine is weergegeven in Figuur 2. Dit eiwit is bekend dat een belangrijke component van de Z-lijn zijn en als zodanig, routinematig wordt gebruikt als een marker van deze structure12. We FDB en IO spieren getransfecteerd met het plasmide pEGFPN1-α-actinin1 codering voor de mens (niet-spier) α-actinine gelabeld bij de C-terminal met EGFP. Zes dagen na transfectie, vonden we dat, zoals beoordeeld door EGFP fluorescentie distributie, α-actinine meestal wordt uitgedrukt in smalle banden gelijke afstand van elkaar langs de vezel-as. Een enkele band per sarcomeer wordt gezien (Figuren 2A en 2D). De colocalization van deze banden met de Z-lijnen wordt aangetoond door het vergelijken van de verdeling van EGFP fluorescentie met de SHG (Figuur 2B) en di-8-ANEPPS (figuur 2E) beelden. Zoals blijkt uit de overlay-afbeelding (figuur 2C), α-actinine-EGFP bands worden afgewisseld met de SHG bands, wat aangeeft dat ze halverwege gelegen tussen twee opeenvolgende M-bands, die samenviel met de locatie van de Z-lijnen. In getransfecteerde spiervezels gekleurd met di-8-ANEPPS, zijn α-actinine-EGFP bands gezien in het midden tussen elk paar van de T-tubuli (figuur 2F) waarvan bekend is dat flank van de Z-lijnen (dat wil zeggen gescheiden door een kortere afstand), dus aangeeft dat transgene α-actinine is gericht op de Z-lijn. Expressie van DHPRα1s gelabeld aan de N-terminus met EGFP De efficiëntie van spier transfectie met pEGFPC1.1-DHPR α 1s is geverifieerd TPLSM beelden (bijv. figuur 3A) waaruit blijkt dat de meeste vezels uitdrukken EGFP-DHPRα1s (een transmembraan eiwit). Het meest opvallende kenmerk van de getransfecteerde vezels is de dubbele gestreepte patroon van EGFP fluorescentie (Figuren 3A en 3B), zoals zou worden verwacht als dit eiwit was gericht op de T-tubuli. Het kan ook worden waargenomen in figuur 3 dat, hoewel verschillende vezels tonen verschillende niveaus van fluorescentie-intensiteit, de gestreepte fluorescentie patroon van een individuele vezel lijkt te worden gehandhaafd homogene langs de vezel. Bij hogere vergroting (figuur 3B), is duidelijk te zien dat de ongelijke afstand tussen de bands is vergelijkbaar met dat in de vezels gekleurd di-8-ANEPPS (bijv. figuur 2E). De overlay beelden (Figuur 3B &amp; 3E) illustreren dat het SHG bands bevinden zich in de grotere afstand tussen EGFP-DHPRα1s bands, bevestigende dat dit eiwit is bij de T-tubuli. Extra FRET metingen met de niet-fluorescerende lipofiel anion DPA-(gegevens niet getoond) verder aan te tonen dat het EGFP-groep is binnen enkele nanometers van de innerlijke folder van de T-tubuli &#39;membranen. Lokalisatie en functionele evaluatie van de expressie van EYFP-ClC1 Vezels getransfecteerd met pEYFP-ClC1, die een EYFP-tagged construct (aan de N-terminal) van de skeletspieren chloride kanaal (ClC1), display EYFP fluorescentie bands (Figuur 4A) codeert met een patroon vergelijkbaar met dat voor het EGFP-DHPRα1s &#39;expressie (Figuur 3A) en die overeenkomt met de T-tubulus regeling als geïllustreerd met di-8-ANEPPS aankleuring (figuur 2E). Zoals verwacht, de superpositie van EYFP-ClC1 (Figuur 4A) en de SHG&#39;s (Figuur 4B) zoals weergegeven in de overlay (Figuur 4C), illustreren dat het SHG bands zijn gecentreerd op de grote afstand of tussen EYFP fluorescentie bands. Om te beoordelen of de uitdrukking van EYFP-ClC1 resulteert in een significante toename van de rust geleiding van de spiervezels, die verwacht worden van de overexpressie van functionele chloride kanalen, we enzymatisch los spiervezels van de getransfecteerde FDB spieren en hun elektrofysiologische eigenschappen bestudeerd met behulp van een twee-micro-elektroden experimentele opstelling eerder beschreven 6,11,13. Figuur 5 toont de resultaten van twee vezels: een expressie van grote hoeveelheden EYFP-ClC1 zoals beoordeeld door de wereldwijde fluorescentie-intensiteit metingen in een standaard fluorescentie microscoop (niet getoond), en de andere is een niet-getransfecteerde controle. De spanning record in figuur 5A (verkregen uit de spiervezels uiten EYFP-ClC1) laat zien dat als gevolg van de excessieve rust geleiding, de vezel is bijna niet opgewonden. Momenteel zorgt de pulsen van maximaal 400nA (0,5 ms) die nodig is om te worden gebruikt om een ​​zeer kleine actieve respons (geen overshoot, figuur 5A) te lokken. Na het vervangen van de externe Tyrode oplossing om een ​​met 500 pM van het chloride-blokker 9-ACA, 200 nA stroompulsen voldoende waren om een ​​actie potentiaal (Figuur 5B) te lokken, maar veel langzamer en breder zijn dan die opgenomen in de controle-vezel ( figuur 5C). Zoals verwacht, de toevoeging van negen-ACA heeft minimale effecten op deze controle vezel (Figuur 5D). <img src="/files/ftp_upload/1520/1520fig1tmb.jpg" alt="Figuur 1" border="0" /> Figuur 1. Transfectie-efficiëntie van de in-vivo elektroporatie methode. Helderveld (A) en fluorescentie (B) beelden van een FDB spier getransfecteerd met PMR-mCherry. Dagen na de elektroporatie protocol: 12 dagen. Gelieve <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1520/1520fig1.jpg">Klik hier</a> voor een grotere versie van figuur 1. <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure2.jpg" alt="Figuur 2" /> Figuur 2. Expressie en targeting van α-actinine-EGFP in FDB vezels. Panelen A en B zijn EGFP-fluorescentie en SHG beelden, respectievelijk van een vezel te drukken α-actinine-EGFP. Panel C is een superpositie van de beelden in A en B. Panels D en E zijn fluorescentie beelden van een andere vezel te drukken α-actinine-EGFP en gekleurd met di-8-ANEPPS, respectievelijk. Paneel F is de superpositie van beelden in D en E. dagen na elektroporatie protocol: 6 dagen. <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure3.jpg" alt="Figuur 3" /> Figuur 3. Expressie en targeting van EGFP-DHPRα1s in FDB vezels. Paneel A, EGFP fluorescentie beeld van een groep van vezels te drukken EGFP-DHPRα1s. Panel B is een uitbreiding van het plein in paneel A om beter tonen de gestreepte patroon van de eiwitexpressie. Paneel C is de SHG afbeelding die overeenkomt met het beeld in paneel A. Panel D is de overlay van de beelden A en C. Panel E is een uitbreiding van het aangegeven gebied in paneel D. dagen na elektroporatie protocol: 20 dagen. <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure4.jpg" alt="Figuur 4" /> Figuur 4. Expressie en targeting van EYFP-ClC1 in FDB vezels. Panelen A en B zijn EYFP fluorescentie en SHG beelden, respectievelijk van vezels te drukken EYFP-ClC1. Paneel C is de superpositie van de beelden in panelen A en B. Panel D is een intensiteit profiel gemeten langs de witte lijn gemarkeerd in de afbeelding in paneel C. dagen na elektroporatie protocol: 7 dagen. <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure5.jpg" alt="Figuur 5" /> Figuur 5. Electrofysiologische beoordeling vezels uiten van transgene EYFP-ClC1. Panelen A en B zijn spanning records uit een vezel te drukken EYFP-ClC1 in reactie op de huidige pulsen voor en na behandeling met 9-ACA, respectievelijk. Panelen C en D zijn spanning records (actiepotentialen) veroorzaakte in reactie op de huidige pulsen in een niet-getransfecteerde vezels voor en na behandeling met 9-ACA, respectievelijk.

<ol><li>Muangmoonchai, R., Wong, S., Smirlis, D., Phillips, I., Shephard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+liver+in+vivo+by+biolistic+particle+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Transfection of liver in vivo by biolistic particle delivery.</a> Molecular Biotechnology. 20 (2), 145-151 (2002).</li>
<li>DiFranco, M., Capote, J., Quinonez, M., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-dependent+dynamic+FRET+signals+from+the+transverse+tubules+in+mammalian+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Voltage-dependent dynamic FRET signals from the transverse tubules in mammalian skeletal muscle fibers.</a> J Gen Physiol. 130 (6), 581-600 (2007).</li>
<li>DiFranco, M., Neco, P., Capote, J., Meera, P., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+evaluation+of+mammalian+skeletal+muscle+as+a+heterologous+protein+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Quantitative evaluation of mammalian skeletal muscle as a heterologous protein expression system.</a> Protein Expression and Purification. 47 (1), 281-288 (2006).</li>
<li>Meera, P., Dodson, P. D., Karakossian, M. H., Otis, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+GFP-tagged+neuronal+glutamate+transporters+in+cerebellar+Purkinje+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Expression of GFP-tagged neuronal glutamate transporters in cerebellar Purkinje neurons.</a> Neuropharmacology. 49 (6), 883-889 (2005).</li>
<li>DiFranco, M., Capote, J., Quinonez, M., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+FRET+Signals+between+DPA+and+the+%7Balpha%7D1s+and+%7Bbeta%7D1a+Subunits+of+the+DHPR+of+Mammalian+Skeletal+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Dynamic FRET Signals between DPA and the {alpha}1s and {beta}1a Subunits of the DHPR of Mammalian Skeletal Muscle.</a> Biophys. J. 94, 2633-2633 (2008).</li>
<li>Woods, C. E., Novo, D., DiFranco, M., Capote, J., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+in+the+transverse+tubular+system+and+voltage+dependence+of+calcium+release+in+normal+and+mdx+mouse+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Propagation in the transverse tubular system and voltage dependence of calcium release in normal and mdx mouse muscle fibres.</a> J Physiol. 568 (Pt 3), 867-880 (2005).</li>
<li>DiFranco, M., Woods, C. E., Capote, J., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophic+skeletal+muscle+fibers+display+alterations+at+the+level+of+calcium+microdomains%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dystrophic skeletal muscle fibers display alterations at the level of calcium microdomains.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (38), 14698-14703 (2008).</li>
<li>Lueck, J. D., Mankodi, A., Swanson, M. S., Thornton, C. A., Dirksen, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+Chloride+Channel+Dysfunction+in+Two+Mouse+Models+of+Myotonic+Dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Muscle Chloride Channel Dysfunction in Two Mouse Models of Myotonic Dystrophy.</a> J. Gen. Physiol. 129 (1), 79-94 (2007).</li>
<li>Zipfel, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+tissue+intrinsic+emission+microscopy+using+multiphoton-excited+native+fluorescence+and+second+harmonic+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7075-7080 (2003).</li>
<li>Plotnikov, S. V., Millard, A. C., Campagnola, P. J., Mohler, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Myosin-Based+Source+for+Second-Harmonic+Generation+from+Muscle+Sarcomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Myosin-Based Source for Second-Harmonic Generation from Muscle Sarcomeres.</a> Biophys J. 90 (2), 693-703 (2006).</li>
<li>DiFranco, M., Capote, J., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+and+functional+characterization+of+the+transverse+tubular+system+of+mammalian+muscle+fibers+using+the+potentiometric+indicator+di-8-ANEPPS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Optical imaging and functional characterization of the transverse tubular system of mammalian muscle fibers using the potentiometric indicator di-8-ANEPPS.</a> J Membr Biol. 208 (2), 141-153 (2005).</li>
<li>Mills, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+the+actin-binding+proteins%2C+%7B%7Balpha%7D%7D-actinin-2+and+-3%2C+in+different+species%3A+implications+for+the+evolution+of+functional+redundancy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Differential expression of the actin-binding proteins, {{alpha}}-actinin-2 and -3, in different species: implications for the evolution of functional redundancy.</a> Hum. Mol. Genet. 10 (13), 1335-1346 (2001).</li>
<li>Woods, C. E., Novo, D., DiFranco, M., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+action+potential-evoked+sarcoplasmic+reticulum+calcium+release+is+impaired+in+mdx+mouse+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The action potential-evoked sarcoplasmic reticulum calcium release is impaired in mdx mouse muscle fibres.</a> J Physiol. 557 (Pt 1), 59-75 (2004).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te melden.

We beschrijven hier de gedetailleerde stappen die gevolgd moeten worden om een doeltreffende transfecties van DNA plasmiden te bereiken in de skeletspier vezels door in vivo elektroporatie. De belangrijkste voordelen van onze aanpak zijn de eenvoud van de uitvoering, en de minimale invasiviteit, wat resulteert in verwaarloosbare gezondheidsrisico voor de dieren. In werkelijkheid, zijn de hierboven beschreven elektroporatie protocollen niet leiden tot veel meer dan twee subcutane injecties per voet, gevolgd door...

dna transfectie van zoogdieren skeletspieren met behulp van in vivo elektroporatie

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

Een groeiende interesse in de celbiologie is transgenically gemodificeerde vormen van essentiële eiwitten (bv. fluorescent gelabelde bouwt en / of gemuteerde varianten) te drukken om hun endogene distributie en functionele relevantie te onderzoeken. Een interessante benadering die is ingevoerd om deze doelstelling te voldoen volledig gedifferentieerde cellen is de<em&gt; In vivo</em&gt; Transfectie van plasmiden met verschillende methoden in specifieke weefsels zoals de lever<sup&gt; 1</sup&gt;, Skeletspieren<sup&gt; 2,3</sup&gt;, En zelfs de hersenen<sup&gt; 4</sup&gt;. We presenteren hier een gedetailleerde beschrijving van de stappen die moeten worden gevolgd om genetisch materiaal efficiënt transfecteren in vezels van de<em&gt; Flexor digitorum brevis</em&gt; (FDB) en<em&gt; Interosseus</em&gt; (IO) spieren van volwassen muizen met behulp van een<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroporatie aanpak. De experimentele parameters zijn geoptimaliseerd is om het aantal spiervezels getransfecteerd terwijl het minimaliseren van weefsel schade die de kwaliteit en kwantiteit van de eiwitten, uitgedrukt in individuele vezels kunnen aantasten te maximaliseren. We hebben geverifieerd dat de implementatie van de methodiek beschreven in dit document resulteert in een hoge opbrengst van oplosbare eiwitten, dat wil zeggen EGFP en ECFP<sup&gt; 3</sup&gt;, Calpaïne, FKBP12, β2a-DHPR, enz.; structurele eiwitten, dat wil zeggen minidystrophin en α-actinine, en membraaneiwitten, dat wil zeggen α1s-DHPR, RyR1, cardiale Na / Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Warmtewisselaar, NaV1.4 Na kanaal, SERCA1, enz., wanneer toegepast op FDB, IO en andere spieren van muizen en ratten. De efficiënte expressie van sommige van deze eiwitten is geverifieerd met biochemische<sup&gt; 3</sup&gt; En functionele aanwijzingen<sup&gt; 5</sup&gt;. Echter, veruit de meest voorkomende bevestiging benadering door ons gebruikt zijn standaard fluorescentie microscopie en twee-foton laser scanning microscopie (TPLSM), die toelaten om niet alleen de totale expressie te identificeren, maar ook de gedetailleerde intracellulaire lokalisatie van fluorescent gelabelde eiwitten constructen. De methode kan ook worden gebruikt om de plasmiden die coderen voor de expressie van eiwitten van fysiologische relevantie (zoals hier afgebeeld) transfecteren, of voor interferentie RNA (siRNA) gericht op de expressie van normaal tot expressie gebrachte eiwitten (niet door ons getest nog) niet te onderdrukken. Opgemerkt moet worden dat de transfectie van FDB en IO spiervezels is bijzonder relevant voor het onderzoek van zoogdieren spierfysiologie sinds vezels enzymatisch los te zien van deze spieren zijn op dit moment een van de meest geschikte modellen om de basismechanismen van prikkelbaarheid en excitatie-contractie koppeling te onderzoeken onder stroom of spanning klem voorwaarden<sup&gt; 2,6-8</sup&gt;.

We beschrijven gedetailleerde procedures voor de efficiënte transfectie van plasmide DNA in de vezels van mond spieren van levende muizen met behulp van elektroporatie en de daaropvolgende visualisatie van eiwitexpressie met behulp van fluorescentie microscopie.

DNA Transfectie van zoogdieren skeletspieren met behulp van In Vivo Elektroporatie

Een groeiende interesse binnen de celbiologie is het tot expressie brengen van transgene gemodificeerde vormen van essentiële eiwitten (bijv. fluorescent gelabelde constructen en/of mutante ...

Elektroporatie kan in vivo worden uitgevoerd om DNA en plasmiden te transfecteren en transgeen te laten tot expressie komen in de flexor digitorum brevis (FDB) en de interosseuze (IO) spieren van een volwassen muis. De procedure begint met het anesthetiseren van de muis. Het plantaire oppervlak van één voet wordt voorbereid voor de eerste injectie van hyaluronidase door de naald bij de hiel in te brengen en deze subcutaan langs de voet te leiden.Na één uur wordt het dier opnieuw geanestheseerd en wordt het plasma geïnjecteerd in hetzelfde subcutane gebied van de voet waar de hyaluronidase is geïnjecteerd. Na 10 minuten worden vergulde acupunctuurnaalden subcutaan geplaatst, zoals getoond. De electroporatiepulsen worden toegediend nadat de naalden, indien nodig, zijn verbonden met de stimulator.De procedure kan worden herhaald in de contralaterale voet. Na een periode van twee tot acht dagen wordt het dier geofferd, worden de spieren gedissekeerd en wordt de transfectie van het gewenste eiwit geverifieerd door de fluorescentie onder een microscoop waar te nemen. Hallo, ik ben Marino DeFranco van het laboratorium van Julio Vera op de afdeling Fysiologie van de Davy Geffen School of Medicine aan de UCLA.Vandaag laten we u een procedure zien voor de Inbivo-transfectie van een transgeen eiwit-exprimerend plasmide in spiervezels van volwassen muizen. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de expressie en lokalisatie van transgene eiwitten te bestuderen, alsofwijl we ook het effect van eiwit-overexpressie op de fysiologie van spiervezels onderzoeken. Laten we beginnen.Voordat u start met de in vivo electroporatieprotocollen, moeten mammalische expressieplasmiden worden geamplificeerd om concentraties te verkrijgen in de range van twee tot vijf microgram plasmide per microliter TE-buffer. Wij maken routinematig gebruik van Qiagen-amplificatiekits en volgen de instructies van de fabrikant. Wij raden commerciele expressieplasmiden aan die de CMV-promotor dragen, zoals bijvoorbeeld EEG FPC one of EEG FPN one van Invitrogen.Omdat deze promoter zeer goed werkt in skeletspieren, zullen we de procedure voor transecties in vivo demonstreren. Met behulp van P EEG FPN één hebben we vooraf een oplossing bereid die twee milligram per milliliter hyaluronidase in steriele tyro bevat. Deze oplossing wordt op kamertemperatuur bewaard tot de dieren worden voorbereid.Voor de transfectie gebruiken we een anesthesiebox die is aangesloten op een goedgekeurde gasanesthesiemachine en anesthetiseren we het dier diep met 4% isofluraan in zuurstof. Zodra het dier is geanestheseerd, brengen we zalf aan om de ogen van de muis te beschermen tegen uitdroging tijdens de daaropvolgende anesthesieprocedures. Plaats het dier op een warmtematte die is ingesteld op 37 °C en handhaaf de anesthesie met behulp van een gezichtsmasker.Controleer de diepte van de anesthesie door de teenknijpreflex te testen. Wanneer het dier diep onder narcose is, gebruik dan een steriele naald van 33 gauge met een lengte van één inch om 10 µL van de high UR-oplossing onder de huid van het voetzoolkussentje van één poot van de muis te injecteren. Observeer dit onder een dissectiemicroscoop, penetreer de huid op een punt dicht bij de hiel van de poot en voer de naald subcutaan voort richting de basis van de tenen.Injecteer de oplossing gedurende ongeveer een kwart inch voorzichtig om overmatige bolling van de huid te voorkomen. Herhaal de procedure bij de andere voet. Indien gewenst zal het geïnjecteerde enzym gedurende een periode van ongeveer één uur het bindweefsel rondom de spiervezels verzachten door hyaluronzuur te hydrolyseren.Dit zal de diffusie vergemakkelijken van het DNA-plasmide dat vervolgens in de interstitiële ruimte tussen de vezels zal worden geïnjecteerd. Koppel na de hyaluronidase-injectie de anesthesie los en plaats de muis in een kooi. Het dier zal binnen drie tot vier minuten herstellen van de anesthesie.Anestheseer het dier na één uur voor een tweede maal. Neem 10 µL van de plasmidoplossing en plaats een druppel op de achterzijde van een schoon, klein weegschaaltje. Neem de druppel op met de injectiespuit en injecteer deze in het voetkussen.Volgens dezelfde procedure als beschreven voor de hyaluronidase-oplossing voor grotere eiwitten kunnen grotere hoeveelheden plasma worden geïnjecteerd. We raden aan om niet meer dan 20 µL te injecteren wanneer meer dan 15 µL noodzakelijk is. We bevelen het gebruik van weefsellijm aan om de huid bij het insteekpunt van de naald te sluiten, om elk risico op lekken van DNA via het punctiepunt te voorkomen.Koppel de anesthesie los en plaats de muis in een kooi. Laat het dier volledig herstellen van de anesthesie en wacht 10 tot 15 minuten om de electroporatie voor te bereiden. Anestheseer het dier zoals eerder beschreven.Selecteer één poot van het dier en plaats één vergulde acupunctuurnaald of elektrode onder de huid bij de hiel, en de tweede aan de basis van de tenen. De naalden zijn parallel aan elkaar en loodrecht op de lengteas van de poot georiënteerd. De acupunctuurnaalden hebben een diameter van 160 µm en een lengte van 13 mm.Ze worden individueel verpakt en steriel verkocht. Afhankelijk van de afstand tussen de naalden dient de pulsamplitude te worden aangepast om spanningspulsen af te geven, waarbij een elektrisch veld van ongeveer 100 volt per centimeter wordt gegenereerd.Stel de polsduur in op 20 milliseconden en de frequentie op één hertz. Verbind de kop van de elektroden met de elektrische stimulator met behulp van microclipconnectoren. Stimuleer de voetspieren door 20 elektrische pulsen toe te passen.Houd de spanningsgolfvorm in de oscilloscoop in de gaten. Er worden geen grote contracties waargenomen als reactie op de stimuli. Als het niveau van de anesthesie adequaat is, kan dit, indien gewenst, worden gedaan terwijl het dier nog onder anesthesie is.Herhaal de bovenstaande electroporatieprocedure in de andere voet. Keer het dier na electroporatie terug naar de kooi en houd het onder observatie. Het dier moet binnen vijf minuten zijn volledige mobiliteit terugkrijgen, voordat het volledig is uitgewoekt uit de anesthesie. Als er geen ongewenste reacties waren en de procedure normaal is verlopen, voeg dan als aanvullende voorzorgsmaatregel gedurende twee dagen carfin in een concentratie van 0,027 milligram per milliliter toe aan het drinkwater van het dier.De expressie van een analgetisch eiwit kan twee tot acht dagen na transfectie worden bepaald. Er is echter bij veel eiwitten waargenomen dat de expressie gedurende maanden aanhoudt. De transfectie-efficiëntie van een FDB-spier die is geëlektroporeerd met het commerciële plasmide P EEG FPN one, coderend voor het EGFP-eiwit, kan eenvoudig worden gevisualiseerd met UV-licht van een handheld UV-lamp of UV-diodes met hoge intensiteit.Bij het bekijken van de poot van de muis onder de dissectiemicroscoop kan worden waargenomen dat de meeste spiervezels met ons protocol zijn getransfecteerd, wat blijkt uit het feit dat de meeste vezels groene fluorescentie vertonen. De dissectiemicroscoop toont het algemene transfectiepatroon van de spier. Herhaal deze waarneming.Het gebruik van een epifluorescentiemicroscoop maakt het mogelijk om het patroon van EGFP-expressie in bundels spiervezels of zelfs in individuele vezels te visualiseren. De efficiëntie van de expressie van het mCherry-eiwit in FDB-spiervezels kan worden geëvalueerd door de lichtveld- en fluorescentiebeelden van de spier met elkaar te vergelijken. De intracellulaire lokalisatie van de de novo tot expressie gekomen transgene eiwitten kan hiervoor worden geëvalueerd met behulp van tweefoton-laserscannendmicroscopie.Beelden van de fluorescentiegelabelde eiwitten en beelden van goed geïdentificeerde markers van cellulaire structuren worden simultaan verkregen. De meest typische cellulaire structurele markers zijn de second harmonic generation- of SHG-beelden, die voortkomen uit de myosinen in de sarcomere A-banden gecentreerd rond de M-lijnen en kleuring.Annex fluorescentiebeelden, die verkregen kunnen worden door het labelen van het oppervlak en de transversale tubulaire of t-tubule-systeemmembranen van de spiervezels met een imperiaan potentiametrische kleurstof in fluorescentiebeelden van spiervezels gekleurd met kleurstof acht anep. De t-tubuli verschijnen als smalle banden van fluorescentie die ongeveer loodrecht op de lange as van de vezel zijn georiënteerd. Deze banden zijn ongelijkmatig over elkaar verdeeld.Ze worden gescheiden door een lange afstand, die zich over de M-lijnen uitstrekt, en een korte afstand die zich over de Z-lijn uitstrekt. Een voorbeeld van de expressie van een getagde variant van het structurele spiereiwit alpha actinin wordt hier getoond. Dit eiwit is een hoofdbestanddeel van de Z-lijn en wordt routinematig gebruikt als marker voor deze structuur.We transfecteerden FDB- en IO-spieren met het plasmide P-E-G-F-P Fpn one alpha actinine, dat codeert voor menselijk niet-spier alpha-actinine met een EGFP-tag aan de C-terminus, zes dagen na transfectie. We stelden vast dat alpha-actinine hoofdzakelijk tot expressie komt in smalle banden die gelijkmatig verdeeld zijn langs de as van de vezel. Er is één enkele band per sarcomere zichtbaar.De colocalisatie van deze banden met de Z-lijnen wordt aangetoond door de distributie van de EGFP-fluorescentie te vergelijken met respectievelijk de SHG- of de D8-annex-beelden, zoals getoond in het overlay-beeld. Alpha-actinine- en EGFP-banden wisselen af met de SHG-banden, wat aangeeft dat zij zich halverwege twee opeenvolgende M-banden bevinden, wat samenvalt met de locatie van de Z-lijnen in getransfecteerde spiervezels gekleurd met d an up. Alpha-actinine-EGFP-banden zijn zichtbaar, gecentreerd tussen elk paar T-tubuli, waarvan bekend is dat zij de Z-lijnen flankeren. Dit toont aan dat transgene alpha-actinine naar de Z-lijn wordt gericht.De expressie en targeting van de N-terminaal met EGFP gelabelde DHPR alpha one s wordt getoond in figuur drie. EGFP-fluorescentie is hoofdzakelijk zichtbaar als paren banden met een spreidingspatroon dat vergelijkbaar is met dat van de T2Es. Het superponeren van SHG- en EGFP-DHPR alpha one s-beelden demonstreert dat er twee EGFP-fluorescerende banden aanwezig zijn tussen elke twee opeenvolgende SHG-banden, wat suggereert dat DHPR alpha one s correct is getarget naar de T2ES D8 en abstaining, niet getoond, een definitief bewijs levert voor de tubulaire targeting van DHPR alpha one s. Vezels getransfecteerd met PEYFP CLC1, dat codeert voor een met EYFP gelabeld construct aan de C-terminus van het skeletspierchloridekanaal CLC1, vertonen EYFP-fluorescentiespannen die overeenkomen met de arrangement van de T-tubuli, zoals geïllustreerd met D8 en abstaining.Zoals verwacht. De superpositie van EYFP CLC one en SG-beelden, zoals getoond in de overlay, illustreert dat de SHG-banden gecentreerd zijn in de grote tussenruimte tussen de EYFP-fluorescentiebanden. Om vast te stellen of de expressie van EY FP CLC one leidt tot een significante toename van de rustgeleiding van de spiervezels, zoals verwacht bij de overexpressie van functionele chloridekanalen, hebben we spiervezels enzymatisch gedissocieerd uit de GETRANSFECTEerde FDB-spier en hun elektrofysiologische eigenschappen bestudeerd met behulp van een experimentele opstelling met twee micro-elektroden.Deze afbeelding toont resultaten van twee vezels. Eén vezel die grote hoeveelheden EYFP clc tot expressie brengt, beoordeeld op basis van globale fluorescentie-intensiteitsmetingen in een standaard fluorescentiemicroscoop, en de andere is een niet-getransfecteerde controle.De spanningsmeting werd verkregen van de spiervezel die EY FP CLC-1 tot expressie bracht. Een stroompuls die groter is dan nodig om een controlevezel te exciteren, wekt slechts een geringe regeneratieve respons op in de getransfecteerde vezel wanneer de externe tyro-oplossing werd vervangen door een oplossing die 500 µM van de chloridekanaalblokker 9-anthranilzuur of 9-ACA bevatte. Een kleinere puls wekte een actiepotentiaal op, hoewel deze veel trager en breder was dan die geregistreerd in de controlevezel, zoals verwacht.De toevoeging van negen a CA had minimale effecten op de controlevezel. We concluderen dat de vezel die EY FP CLC one tot expressie brengt vrijwel niet prikkelbaar is vanwege de excessieve rustchlorideconductantie. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe een plasmide dat een transgeen eiwit tot expressie brengt, kan worden getransfecteerd in een levende skeletspiervezel met behulp van elektroporatie, en hoe de transfectie-efficiëntie en de lokalisatie en functie van de getransfecteerde eiwitten kunnen worden geëvalueerd.Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

dna-transfection-mammalian-skeletal-muscles-using-vivo

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Tracking Dynamica van Muscle innesteling in kleine dieren door In Vivo TL-Imaging

Een muizenmodel van neuromusculaire elektrostimulatie (NMES), een veilige en goedkope klinische modaliteit, aan de voorste compartiment spieren wordt beschreven. Dit model heeft het voordeel van het wijzigen van een beschikbaar klinische inrichting voor het opwekken van gerichte en specifieke spiercontracties in muizen.

Een muizenmodel van Muscle Training door Neuromusculaire elektrische stimulatie

Een niet-invasieve middelen voor het succes van transplantatie myoblast evalueren beschreven. De methode maakt gebruik van een verenigd fusie reportergen samengesteld uit genen waarvan de expressie kan worden afgebeeld met verschillende beeldvormende technieken. Hier maken we gebruik van...

Molecular Imaging te Getransplanteerde Muscle Progenitor Cellen Target

Geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC)-afgeleide myogene voorlopers zijn veelbelovende kandidaten voor celtherapiestrategieën om spierdystrofieën te behandelen. Dit protocol beschrijft transplantatie en functionele metingen die nodig zijn om de engraftment en differentiatie van iPSC-afgeleide mesoangioblasten (een type spiergenitors) te evalueren in muismodellen van acute en chronische spierregeneratie.

Transplantatie van geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide mesoangioblast-achtige myogene voorlopers in muismodellen van spierregeneratie

Dit protocol maakt gebruik van elektroporatie om fluorescerend gelabelde eiwitten te introduceren en tot expressie te brengen in muisspiervezels. Na herstel na elektroporatie worden de vezels geïsoleerd. Individuele vezels worden vervolgens geïmaged met behulp van hoge resolutie confocale microscopie om de spierstructuur te visualiseren.

DNA Elektroporatie, Isolatie en beeldvorming van myofibers

Hier presenteren we een in vivo techniek voor genoverdracht naar Schwann-cellen (SC's) in de wetenschappelijke nervus ischiadicus bij knaagdieren. Deze eenvoudige techniek is nuttig voor het onderzoeken van signaalmechanismen die betrokken zijn bij de ontwikkeling en instandhouding van myeliniserende SC's.

In vivo genoverdracht naar Schwann cellen in het knaagdier heupzenuw door elektroporatie

We beschrijven een nieuwe experimentele techniek die wij minimaal invasieve spier insluiten (MIME), die is gebaseerd op het bewijsmateriaal bellen dat skelet spierweefsel levensvatbare myogenic cellen, die vergemakkelijken donor-cel-gemedieerde myogenesis bevat kunnen wanneer ingeplant een host spier.

Minimaal invasieve spier insluiten (MIME) - een roman experimentele techniek ter vergemakkelijking van de Donor-cel-gemedieerde Myogenesis

Elektroporatie van plasmide-DNA in skeletspieren is een haalbare methode om genexpressie te moduleren zonder de spiercontractiliteit bij muizen in gevaar te brengen.

Elektroporatie van plasmide-DNA in de skeletspieren van de muis

Dit protocol beschrijft micro-injectie en in vivo elektroporatie voor regionaal beperkte CRISPR-gemedieerde genoombewerking in de eileider van de muis.

Somatische genoom-engineered muismodellen met behulp van in vivo micro-injectie en elektroporatie

Functionele site-directed fluorometrie is een methode om eiwitdomeinbewegingen in realtime te bestuderen. Modificatie van deze techniek voor de toepassing ervan in native cellen maakt nu de detectie en tracking mogelijk van bewegingen van enkele spanningssensor van spanningsafhankelijke Ca2 + -kanalen in murine geïsoleerde skeletspiervezels.

Functionele site-directed fluorometrie in inheemse cellen om de prikkelbaarheid van skeletspieren te bestuderen

Hier presenteren we een protocol dat in vivo elektroporatie en denervatie van de craniale levator auris longus (LAL) spier combineert. Deze procedure maakt het mogelijk om de mogelijke rol van spiereiwitten bij de regeneratie van de neuromusculaire synaps te bestuderen.

Gecombineerde in vivo elektroporatie en kortdurende reïnnervatie van de skeletspier van de craniale levator Auris longus

Leer DNA-transfectie in muizen skeletspieren met in vivo elektroporatie. Deze methode maakt visualisatie van eiwitexpressie mogelijk via fluorescentiemicroscopie voor genexpressiestudies.

DNA Transfectie van zoogdieren skeletspieren met behulp van In Vivo Elektroporatie

Meer video's verkennen