Voorbereiding van de gepoolde humane bloedplaatjes Lysate (pHPL) als een efficiënte Supplement voor Animal Serum-Free menselijke stamcellen culturen
30 oktober 2009
Menselijke bloedplaatjes lysaat is een rijke bron van groeifactoren en een krachtig supplement in celcultuur. Dit protocol bevat het proces van het opstellen van een grote pool van de menselijke bloedplaatjes lysaat door uit te gaan van de bloedplaatjes rijk plasma, het uitvoeren van een aantal vries-dooi cycli en uitputting van de bloedplaatjes fragmenten.
Dit protocol beschrijft het proces voor het bereiden van een grote pool menselijk plaatjeslysaat, beginnend bij plaatjesrijk plasma. Door één vries-dooi-cyclus uit te voeren, worden de bloedplaatjes gelyseerd. Vervolgens worden ten minste 10 eenheden menselijk plaatjeslysaat samengevoegd tot één batch gepoold menselijk plaatjeslysaat of PHPL.
Dit volume van ongeveer drie liter wordt verder verdeeld in aliquoten en opnieuw ingevroren om plaatjesfragmenten te verwijderen. Deze aliquoten worden ontdooid, overgebracht naar vials en gecentrifugeerd. Het supernatant is het plaatjesfragment-gedepleteerde PHPL, dat plaatjesafgeleide groeifactoren bevat die worden gebruikt om celculturen aan te vullen.
Het overgebleven pellet met plaatjesfragmenten wordt weggegooid. Hallo, ik ben Kadina Sharmo van het laboratorium van Dr. TRO in de stamcelonderzoekseenheid van de Medical University of Grads. Vandaag laten we u een procedure zien voor de bereiding van een pool van menselijke plaatjesisolaten.
We beginnen met bloedplaatjesrijk plasma, voeren verschillende vries-dooiscycli uit en verwijderen vervolgens de plaatjesfragmenten. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om een adequaat supplement voor celculturen te verkrijgen als alternatief voor foetaal kalfsserum. Laten we beginnen.
Dit protocol begint met plaatjesrijk plasma, ook wel PRP genoemd. Dit plasma kan zijn voorbereid via cytaferese of zijn afgeleid van buffy coats. Personen buiten het vakgebied van de transfusiegeneeskunde dienen PRP aan te schaffen bij een lokale bloedbank of een andere erkende leverancier.
Controleer de steriliteit van de PRP-eenheid door 20 milliliters van elke eenheid over te brengen naar een kleine verbonden zak en de zak vervolgens los te koppelen met de lasmachine. Dit aliquot kan direct na bereiding naar een microbiologisch laboratorium worden gestuurd voor steriliteitstesten. Het is belangrijk om de PRP-eenheden in de oorspronkelijke bewaarzak te bevriezen tot ten minste -20 °C.
Zodra de bacteriële testen negatief zijn, kan de volgende stap worden uitgevoerd. Zorg ervoor dat het menselijke bloedplaatjeslysaat, nu HPL genoemd, niet overmatig opwarmt en plaats de HPL-eenheden in een waterbad van 37 °C tot de ijskristallen verdwenen zijn. Bloedplaatjes moeten na deze vries-dooi-stap worden gelyseerd om een gestandaardiseerd product voor elke pool van bloedplaatjeslysaten voor te bereiden.
Verzamel 10 tot 15 ontdooide PRP-eenheden. Sluit elke opeenvolgende HPL-zak aan op de poolzak-dubbelzak en breng vervolgens de HPL over naar deze twee zakken. Koppel de lege HPL-zakken los met de lasklem.
Meng de inhoud van de twee zakken om een eindvolume van drie tot vier liter gepoold menselijk plaatjeslysaat te verkrijgen. Dit wordt nu PHPL genoemd. Sluit een kleine zak aan en neem een monster van 20 milliliter PHPL af om de steriliteit van het gepoolde product te controleren.
verdeel PHPL-monsters in aliquots voor verdere verwerking door kleine zakken aan de poolzakken aan te sluiten. Breng volumes van ongeveer 250 milliliters over naar de kleine bewaarzakken en koppel de gevulde zakken vervolgens los met behulp van de sealer. Voer nu een extra vries-dooi-cyclus uit om de mate van plaatjesfragmentatie en de hoeveelheid vrijgekomen groeifactoren te verhogen.
Doe dit door de kleine zakjes met geportioneerde PHBL te vriezen bij -20 °C. Ontdooi de zakjes vervolgens in een waterbad van 37 °C, in de laminaire flowkast.
Gebruik steriele scharen om de slang van elke zak door te snijden en te openen, en giet vervolgens het PHPL in de flesjes van 50 milliliter. Vaak hebben plaatjesfragmenten de neiging om bloedplaatjes te aggregeren en kunnen ze ook allo-immunisatie induceren. Om deze omstandigheden te vermijden, worden de fragmenten uit het PHPL verwijderd door centrifugatie bij 4, 000 GS gedurende 15 minuten in een gekoelde centrifuge.
Pipette vervolgens het plasmasupernatant in de uiteindelijke opslagbuisjes en gooi de plaatjespellets weg om te voorkomen dat er fragmenten in uw celculturen terechtkomen. Vries aliquots van 50 milliliter PHPL opnieuw in bij minus 20 graden tot aan verder gebruik. Nu er PHPL is gegenereerd die ontdaan is van plaatjesfragmenten, kunnen de kenmerken van het lysaat worden geanalyseerd.
De functie en kwaliteit van het gepoolde plaatjeslysaat worden getest in celculturen en bewezen door de efficiënte stimulatie van celproliferatie, propagatie van mesenchymale stromale cellen of MSC's en van endotheelkolonievormende cellen, E CFC's, wat succesvol verloopt met gebruik van plaatjesfragment-gedepleete PHPL. Raadpleeg hier ons geschreven protocol voor de mediumrecepten. Twee toepassingen voor gepoold menselijk plaatjeslysaat.
In de kweek van mesenchymale stromale cellen worden MSC's van donor één getoond die zijn gekweekt met ofwel PHPL of met fragment-depleteerd PHPL. Zoals aangegeven is hier meer fragmentcontaminatie zichtbaar in vergelijking met alleen het fragment-depleteerde PHPL. Bloedplaatjesfragmenten ondersteunen de groei van MSC's onvoldoende.
Alle drie de afbeeldingen zijn genomen na 13 dagen kweek. De MSC's van donor twee zijn gedurende negen dagen gekweekt in PHPL die ontdaan was van plaatjesfragmenten, in plaats van in plaatjesrijk plasma. Let op dat PRP zonder plaatjeslyse de uitgroei van MSC's onvoldoende ondersteunt.
Raadpleeg ook het JoVE-protocol van Andreas Reish, waarin het gebruik van fragment-gedepleteerde PHPL wordt beschreven voor het isoleren en kweken van MSC's afgeleid van menselijk navelstrengbloed. We hebben zojuist aangetoond hoe u PHPL kunt maken om dierlijk serum volledig te vervangen in uw stamcelculturen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat plaatjesfragmenten moeten worden verwijderd voordat heparin en PHPL aan uw cultuurmedium worden toegevoegd.
Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft in detail de bereiding van menselijk plaatjeslysaat (HPL) uit plaatjesrijk plasma (PRP). Het proces omvat vries-dooi-cycli om de bloedplaatjes te lyseren en een lysaat te produceren dat arm is aan plaatjesfragmenten en rijk aan groeifactoren voor supplementatie van celculturen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Celkweek
- Bloedplaatjesbiologie
- Groeifactoronderzoek
Achtergrond
- Menselijk plaatjeslysaat is een krachtig supplement in celkweek.
- Het bevat diverse groeifactoren die essentieel zijn voor celproliferatie en -differentiatie.
- Het bereidingsproces is cruciaal om de kwaliteit en werkzaamheid van het lysaat te waarborgen.
- Plaatjesrijk plasma dient als startmateriaal voor de bereiding van HPL.
Doel van de studie
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor het bereiden van humaan plaatjeslysaat.
- Om de uitputting van plaatjesfragmenten te waarborgen voor een schoner lysaat.
- Om het gebruik van HPL in diverse celkweektoepassingen te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Uitgangspunt is bloedplaatjesrijk plasma (PRP).
- Het uitvoeren van vries-dooi-cycli om de bloedplaatjes te lyseren.
- Bereiding van gepoold humaan bloedplaatjeslysaat (PHPL).
- Centrifugatie om bloedplaatjesfragmenten uit het supernatant te verwijderen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle bereiding van een grote pool menselijk plaatjeslysaat.
- Verwijdering van plaatjesfragmenten gerealiseerd door middel van centrifugatie.
- Opbrengst van ongeveer drie liter aan plaatjes-afgeleide groeifactoren.
- Bereiding geschikt voor supplementatie in celculturen.
Conclusies
- Het protocol biedt een betrouwbare methode voor het bereiden van humaan plaatjeslysaat.
- HPL kan de resultaten van celkweken aanzienlijk verbeteren.
- Verdere studies kunnen de toepassingen van HPL in diverse onderzoeksvelden verkennen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Dierserumvrije kweeksystemen zijn essentieel voor het verder ontwikkelen van stamceltherapieën richting klinische vertaling en naleving van regelgeving. Dit protocol maakt schaalbare productie van menselijk plaatjeslysaat (pHPL) mogelijk als een gedefinieerd, xeno-vrij supplement dat de proliferatie van mesenchymale stromale cellen en de propagatie van endotheel-kolonievormende cellen ondersteunt. Door de lysis van plaatjes en het verwijderen van fragmenten te standaardiseren, wordt de variabiliteit tussen batches verminderd en de reproduceerbaarheid in vroege ontdekkingsfasen en preklinische workflows verbeterd.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Biedt een gedefinieerd, van menselijke oorsprong afgeleid supplement dat mechanistische studies naar proliferatie- en differentiatieroutes van stamcellen ondersteunt.
- Operationele waarde: Maakt consistente kweekcondities over experimenten heen mogelijk, waardoor de variabiliteit in assays voor targetvalidatie wordt verminderd.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert een gestandaardiseerd, groeifactorrijk medium dat betrouwbare resultaten ondersteunt in functionele stamcelassays.
- Operationele waarde: Faciliteert de standaardisatie van assays door gebruik van fragment-gedepleteerd lysaat, waardoor interferentie door plaatjesaggregaten in screeningsplatforms wordt geminimaliseerd.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt de expansie van ziekterelateerde stamcellen onder xeno-vrije omstandigheden, in overeenstemming met de vereisten voor translationele biomarkers en preklinische modellen.
- Operationele waarde: Maakt schaalbare productie mogelijk vanuit gepoolde donorbronnen, wat technologieoverdracht en GMP-gerelateerde procesontwikkeling ondersteunt.
Pipeline- & workflowintegratie
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm door een serumvrije supplement voor stamcelkweek te bieden, van vroege targetvalidatie tot preklinische expansie, ter ondersteuning van leadidentificatie en mechanistische risicovermindering.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetesten bij de proliferatie en differentiatie van stamcellen door een consistent, gedefinieerd micro milieu te bieden.
- Screening: Maakt reproduceerbaar testen van verbindingen of condities in assays op basis van stamcellen mogelijk via een gestandaardiseerd, fragment-gedepleteerd lysaat.
- Analytics: Levert kwantificeerbare output, zoals celproliferatiesnelheden en de efficiëntie van colony-forming units, wat vergelijkende analyses tussen verschillende kweekcondities mogelijk maakt.
- Translationeel onderzoek: Verbindt fundamentele ontdekkingen met preklinisch werk door de expansie van mesenchymale stromale cellen en endotheliale progenitorcellen onder klinisch relevante, diervrije condities te ondersteunen.
- Bedrijfsmatige hergebruik: Vestigt een herbruikbaar, schaalbaar proces voor het genereren van supplementen van klinische graad uit routinematig verkregen platelet rich plasma, waardoor de afhankelijkheid van variabele dierlijke sera wordt verminderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid van resultaten in stamcelkweek door ongedefinieerde dierlijke serumcomponenten te elimineren en de toevoer van groeifactoren te standaardiseren.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid door verwerking van gepoolde donoren en gestandaardiseerde vries-dooi- en centrifugatiestappen.
- Strategische waarde: Vermindert het biologische risico bij de ontwikkeling van celtherapie door een menselijk afgeleid, xeno-vrij alternatief voor foetaal kalfsserum te bieden.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door het mogelijk maken van consistente generatie van preklinische gegevens in gedefinieerde kweeksystemen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in steriele celkweektechnieken, de omgang met bloedplaatjes en centrifugatieprotocollen.
- Is afhankelijk van de toegang tot platelet-rijk plasma van erkende bloedbanken of transfusiediensten en steriele las- of sealapparatuur voor de manipulatie van zakken.
- Maakt gestandaardiseerde steriliteitstests van het input-PRP en het gepoolde lysaat vóór en na de verwerking noodzakelijk om de veiligheid van de kweek te waarborgen.
- Vereist aanpassing van kweekprotocollen om rekening te houden met lot-specifieke concentraties van groeifactoren, ondanks de poolstrategie.
- Wordt beperkt door de noodzaak van meerdere vries-dooi-cycli en centrifugatiestappen, wat de verwerkingstijd verlengt en gespecialiseerde apparatuur vereist.
