Name: Isolatie en grootschalige expansie van volwassen humane endotheelcellen kolonievormende Progenitor Cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-28T07:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
Description: Leer een dierlijk-serumvrije methode voor de isolatie en grootschalige expansie van endotheliale kolonievormende progenitorcellen (ECFC) uit volwassen menselijk perifeer bloed. Dit protocol minimaliseert het risico op immunisatie en ondersteunt onderzoek naar vasculaire homeostase en reparatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken dr. Katharina Schallmoser voor het verstrekken van pHPL en Margaretha Frühwirth en Daniela Thaler voor een uitstekende technische ondersteuning.

A.) ECFC ISOLATON DAG 1: <ol><li> Voordat u begint met het experiment voor te bereiden de celkweekmedium Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2). Supplement 500ml Endotheliale basismedium-2 met heparine (1 ml van 1000 U / ml), 5 ml 100x oplossing van penicilline / streptomycine (alle Sigma, St. Louis, MO, <a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a> ), L-glutamine (2 mM eindconcentratie ), en 50 ml gepoolde humane bloedplaatjes lysaat (pHPL). Voeg vervolgens 0,2 ml hydrocortison, 2 ml hFGF-B, 0,5 ml VEGF, 0,5 ml EGF, 0,5 ml IGF-1 en 0,5 ml ascorbinezuur (geleverd als SingleQuots, alle Lonza, Walkersville, MD; <a href="http://www.lonzabioscience.com/">http://www.lonzabioscience. com /</a> ). Steriel filtraat het medium door middel van een 0,2 m-poriegrootte van 500 ml Millipore vacuüm filter. Sinds pHPL vormt kleine stolsels die u nodig heeft twee filters voor een medium. Pre-warm gefilterd EGM-2 tot 37 ° C in een waterbad </li><li> Het verzamelen van de bloedmonsters door het opstellen van 5 ml van volwassen menselijk perifeer bloed uit de cubitaal ader in een 6 ml conserveermiddel vrij natrium-heparine bloed Vacutainer buis. Je moet het proces van de bloedmonsters binnen maximaal twee uur. </li><li> Begin met het opstellen van een 75 cm 2 (T75, Costar) kolf met een geventileerde dop, een 25 ml pipet en twee 5 ml pipetten in een laminaire stroming bank. </li><li> Pre-fill 15 ml voorverwarmd aangevuld met EGM-2 in de kolf met de 25 ml pipet. Open nu het bloed flacon en monster alle 5 ml met de 5 ml pipet in de kolf. Spoel de lege bloed flacon met 5 ml extra EGM-2 met de tweede 5 ml pipet. Het totale volume binnen de T75 is 25 ml. Sluit de geventileerde-cap van de kolf en plaats het in een incubator bij 37 ° C, 5% CO 2 en 95% luchtvochtigheid gedurende 24 uur. </li></ol> DAG 2: <ol><li> Na ongeveer 24 uur (&#39;s nachts) moet je verwijderen op de middellange-bloed mengsel om zich te ontdoen van niet-adherente cellen. Voor deze voor te bereiden twee 25 ml pipetten en drie 5 ml pipetten in de laminaire stroming, pre-warme 20 ml aangevuld EGM-2 (bereid op de vorige dag) en 30 ml PBS tot 37 ° C in een waterbad. </li><li> Haal de erlenmeyer met het monster uit de incubator en verwijder alle supernatant met een 25 ml pipet. Zorg ervoor dat u de kolf krassen te voorkomen dat schade aan eventuele kolonie. Was de binnenste fles celadhesie oppervlak drie keer door voorzichtig toevoegen van 10 ml voorverwarmde PBS en kantelen de kolf van de ene kant naar de andere. Verwijder de PBS onmiddellijk elke keer en gooi ze weg. </li><li> Voeg 20 ml vers voorverwarmde EGM-2 aan de kolf en plaats het terug in de incubator. Dit proces moet worden uitgevoerd zo snel en zacht mogelijk te maken voor de bijgevoegde cellen niet te los. ECFCs gemakkelijk los als ze worden bewaard in PBS of op kamertemperatuur het is te lang. </li><li> Het scherm via de kolf systemisch elke tweede dag te beginnen op dag twee met een lage vergroting van een lichtmicroscoop op zoek naar ECFC uitgroei. Wanneer een kolonie teken gevonden op de top aan de buitenzijde van de kolf die de positie van de kolonie. Merk op dat de flaks niet buiten de incubator voor meer dan 5 minuten. </li></ol> DAG 5: <ol><li> Op de vijfde dag uit te voeren na het zaaien een complete medium te veranderen om niet-hechtende cellen te verwijderen. Voor dit doel pre-warme 20 ml van EGM-2 tot 37 ° C in een waterbad en voor te bereiden twee 25 ml pipetten. </li><li> Verwijder de complete medium met behulp van een 25 ml pipet en voeg verse, voorverwarmde aangevuld met EGM-2 zo snel mogelijk. De cellen moeten niet worden overgelaten zonder medium voor meer dan een minuut om uitdrogen te voorkomen. Plaats terug in de couveuse en herhaal screening de kolf dagelijks. </li><li> Feed van de cellen te vervangen door 30% van de middelgrote door vers aangevuld EGM-2 twee keer per week. </li></ol> DAG 14-28: <ol><li> Typische kolonies met kasseien morfologie zou moeten verschijnen rond dag 12. Markeer de bovenkant buitenzijde van de buis om de positie van elke kolonie te geven. Laat de kolonies te groeien tot en met dag 28, tenzij enkele cellen beginnen te los te maken. Eens, hebben de primaire kolonies geïdentificeerd kunnen ze geoogst worden tussen de 14 en 28 dagen, afhankelijk van hun grootte. </li></ol> B.) ECFC OOGST <ol><li> Pre-warm 5 ml trypsine 0,05% / EDTA, 20 ml PBS en 5 ml verse aangevuld EGM-2. </li><li> Volledig verwijderen van medium van de kolf in een Falcon buis (let er dan op het oppervlak van de kolf niet te beschadigen eventuele kolonie te raken) en was voorzichtig cellen met 10 ml voorverwarmd PBS. </li><li> Voeg 5 ml trypsine / EDTA en incubeer gedurende 5 minuten in de incubator. De cellen mogen niet worden blootgesteld aan trypsine voor meer dan 7 min, omdat het giftig wordt. Grondig te tikken op de zijkanten van de kolf helpt de cellen los te. Quench trypsine protease-activiteit door het toevoegen van ongeveer 10 ml van de bewaarde gebruikte kweekmedium. </li><li> Verwijder de celsuspensie in een 50 ml Falcon buis. Was de kolf eenmaal met 10 ml PBS, die daarna wordt toegevoegd aan de geoogste celsuspensie. Centrifugeer de celsuspensie op 300 g voor 7 min bij 4 ° C om de cellen te verzamelen en verwijder de trypsine. Verwijder het supernatant en onmiddellijk resuspendeer de celpellet in 1 ml PBS. Te houden op het ijs. </li><li> Te bepalen aantal cellen, zoals beschreven in een protocol Jove door R. Ricardo en K. Phelani 5. </li></ol> C.) ECFC EXPANSION <ol><li> Supplement 500 ml EGM-2, zoals beschreven in A 1.1). Pre-warm tot 37 ° C in een waterbad. </li><li> Voor ongeveer 2500 cm 2 cultuur ruimte voor te bereiden een ofwel 11 T220 (225 cm 2) of 15 T175 (175 cm 2) of een vier-lagen cel als fabriek (CF-4; Nunc, Naperville, IL; <a href="http://www.nuncbrand.com/">http://www.nuncbrand . com</a> ). Daarnaast moet u twee verse vent-caps en een speciale steriele trechter in de laminaire stroming bank. </li><li> Om zaad ECFCs op een start cel dichtheid van 100 c / cm 2 berekening van het aantal cellen is noodzakelijk. Voor een CF-4 252.800 cellen geresuspendeerd in 500 ml vers EGM-2 en gegoten in de CF-4 met behulp van de steriele trechter. Sluit een vent met de ontluchting-cap en kantel de CF-4 tot en met een lengte zijde, waardoor een gelijke verdeling van het medium tussen alle vier meel. Dan tilt de kamer terug en open het deksel van de vent-cap. Plaats CF-4 in de broedstoof. </li><li> Verandering van 20% van het medium ten minste eenmaal per week tot CF-4 is samenvloeiend. </li><li> Oogst cellen zoals beschreven in B.) met behulp van 70 ml trypsine / EDTA en ongeveer 200 ml PBS. </li></ol> Representatieve resultaten Met behulp van deze isolatiemethode zagen we een primaire kolonie formatie op dag 12. In een eerdere studie in staat waren om een gemiddelde van 4,0 ± 0,8 ECFC-kolonies uit elke ml van perifeer bloed te herstellen. ECFCs 4 toonde een typische kasseien uiterlijk. Na de grootschalige expansie, met een seeding dichtheid van 100 cellen / cm 2, kregen we&gt; 1 x 10 8 cellen in een totaal van ongeveer 30 dagen vanaf 3 mannelijke en 1 vrouwelijke vrijwilligers (leeftijd tussen 26 en 50 jaar). ECFC gekweekt onder deze omstandigheden bleken te zijn proliferatieve, functionele en genomically stabiel. 4 Bovendien cellen kunnen worden opgeslagen (in 10% DMSO) in vloeibare stikstof voor verder gebruik. 3,4

<ol><li>Solovey, A., Lin, Y., Browne, P., Choong, S., Wayner, E., Hebbel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+activated+endothelial+cells+in+sickle+cell+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Circulating activated endothelial cells in sickle cell anemia.</a> N Engl J Med. 337, 1584-1590 (1997).</li>
<li>Yoder, M. C., Mead, L. E., Prater, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+endothelial+progenitor+cells+via+clonal+analysis+and+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cell+principals%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals.</a> Blood. 109, 1801-1809 (2007).</li>
<li>Schallmoser, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+large-scale+expansion+of+functional+mesenchymal+stem+cells+from+unmanipulated+bone+marrow+without+animal+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid large-scale expansion of functional mesenchymal stem cells from unmanipulated bone marrow without animal serum.</a> Tissue Eng Part C Methods. 14, 185-196 (2008).</li>
<li>Reinisch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+large-scale+expanded+endothelial+colony-forming+cells+function+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo.</a> Blood. , (2009).</li>
<li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+and+Determining+the+Viability+of+Cultured+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Counting and Determining the Viability of Cultured Cells.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
</ol>

Deze nieuwe isolatie en uitbreiding methode is een eenvoudig en efficiënt proces dat is efficiënter en minder tijdrovend door het vermijden van elke cel scheiding (geen dichtheidsgradiënt nodig) en minder duur dan conventionele technieken. Door gebruik te maken pHPL contact met runderen antigenen en vermeende daaropvolgende xenoimmunization is uitgesloten. Gedurende de periode van cultuur kleine stolsels kunnen vormen, veroorzaakt door de pHPL. Gebaseerd op onze ervaring van deze stolsels geen effect kolonie vorming en ...

<table><tbody><tr><td>Endothelial basal Medium-2</td><td>Lonza Inc.</td><td></td><td>500ml</td></tr><tr><td>EGM-2 SingleQuots</td><td>Lonza Inc.</td><td></td><td>EGF, hFGF-B, VEGF, IGF-1, hydrocortison, ascorbinezuur</td></tr><tr><td>conserveermiddelvrije heparine</td><td>Biochrom AG</td><td></td><td>10U/ml per EGM-2</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>2mM per EGM-2</td></tr><tr><td>penicilline en streptomycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>100U/mL penicilline en&lt;br/&gt;100&amp;#x03BC;g/mL streptomycine per&lt;br/&gt;EGM-2</td></tr><tr><td>trypsine/1mM EDTA </td><td>Invitrogen</td><td></td><td>7ml voor T75-fles&lt;br/&gt;70ml voor CF-4</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vierlaagse cell factory (CF-4) </td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steriele trechter</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T75cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; kweekfles (met geventileerde dop)</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 mL vacutainerbuizen (conserveermiddelvrije natriumheparine) </td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>vooraf gevuld met 108 IU/6ml&lt;br/&gt;conserveermiddelvrije natriumheparine</td></tr><tr><td>50ml Falcon-buizen</td><td>Falcon BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5ml Stripetts</td><td>Costar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25ml Stripetts</td><td>Costar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Squeezer</td><td>Costar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>steriel filter met poriegrootte 0,2</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>2x 500ml per EGM-2</td></tr></tbody></table>

isolatie en grootschalige expansie van volwassen humane endotheelcellen kolonievormende progenitor cellen

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

Deze paper introduceert een nieuwe recovery strategie voor de endotheliale kolonievormende progenitor cellen (ECFCs) van heparine, maar anders ongemanipuleerde volwassen menselijk perifeer bloed binnen een gemiddelde van 12 dagen. Na de grootschalige expansie&gt; 1x10 8 ECFCs kan worden verkregen voor verdere tests. Bij voorkeur door gebruik te maken pHPL het contact van menselijke cellen met bovine serum antigenen kunnen worden uitgesloten. Door flow cytometrie en immunohistochemie de geïsoleerde cellen kan worden gekarakteriseerd als ECFC en hun in vitro functionaliteit om vasculaire vorm als structuren kunnen worden getest in een Matrigel assay. Verder deze cellen kunnen subcutaan worden geïnjecteerd in een muismodel voor functionele, perfusie schepen in vivo te vormen. Na een lange termijn uitbreiding en cryopreservatie proliferatie, functie en genomische stabiliteit lijken te worden behouden. 3,4 Dit dier-eiwit vrij isolatie en uitbreiding methode is gemakkelijk toepasbaar op een grote hoeveelheid ECFCs te genereren.

Endotheliale kolonievormende progenitor cellen (ECFCs) zijn een veelbelovend instrument om vasculaire homeostase en reparatie te bestuderen.<sup&gt; 1,2</sup&gt; Dit artikel introduceert een nieuwe dier-serum vrije methode voor de isolatie en de uitbreiding van ECFC van gehepariniseerd volwassen humaan perifeer bloed met gepoolde humane bloedplaatjes lysaat (pHPL) het verminderen van het risico van anti-bovine immunisatie.

Isolatie en grootschalige expansie van volwassen humane endotheelcellen kolonievormende Progenitor Cellen

Dit artikel introduceert een nieuwe herstelstrategie voor endotheelkolonie-vormende progenitorcellen (ECFC's) uit gehepariniseerde maar verder onbehandelde volwassen...

Door het totaalbloed simpelweg te kweken in een geoptimaliseerd medium zonder dierlijk serum. In een kolf van 75 vierkante centimeter hechten E CFC's zich aan het kolfoppervlak, waardoor de meeste rode en witte bloedcellen worden verwijderd. Was de kolf op dag één en elimineer de resterende cellen door het totale medium op dag vijf te vervangen.Blijf om de dag koloniën screenen, of indien gewenst drie keer per week. De eerste koloniën zouden rond dag 12 zichtbaar moeten zijn. Hallo, mijn naam is Nicole Hoffman van het laboratorium op de Stem Cell Research Unit van de Medical University grots.Vandaag laten we u een vereenvoudigd proces zien voor de isolatie en expansie van endotheelkolonie-vormende progenitorcellen of ECFC uit perifeer bloed van volwassen mensen. In ons laboratorium gebruiken we dit proces om de functie en biologie van ECFC in vitro en in vivo te bestuderen. Laten we beginnen.Deze sectie begint met de bereiding en filtersterilisatie van endotheliaal groeimedium twee, dat zal worden gebruikt voor het kweken van de EFC's. Verwarm 20 milliliters medium voor in een waterbad van 37 °C. Neem vijf milliliters perifeer bloed van een volwassen mens af uit de cubitale vene in

isolation-large-scale-expansion-adult-human-endothelial-colony

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit protocol beschrijft de isolatie en de daaropvolgende expansie van mesenchymale stromale cellen en endotheelcellen kolonievormende cellen zonder het gebruik van dierlijke serum op autologe paren te genereren voor experimentele transplantatie doeleinden.

Isolatie en dierlijk serum vrije expansie van de mens navelstreng Afgeleid Mesenchymale stromale cellen (MSC&#39;s) en Endotheliale Colony Forming progenitor cellen (ECFCs)

Endotheliale kolonievormende cellen (ECFCs) in omloop zijn endotheelcellen met robuuste klonale proliferatie potentieel dat intrinsieke weer te...

Fenotypische en functionele karakterisering van endotheliale Colony Forming Cellen uit menselijk navelstrengbloed

This video demonstrates a technique for isolating induced neural progenitor cells (iNPCs) derived from adult human fibroblasts. It outlines the steps involved in isolating the iNPC colonies and culturing them in laminin-coated multi-well plate wells in the presence of suitable culture media that facilitate the continued proliferation and expansion of the iNPC population.

Isolating Induced Neural Progenitor Cell Colonies Derived From Adult Human Fibroblasts

We beschrijven een betrouwbare methode om primaire tumorspecifieke endotheelcellen te isoleren en te kweken van genetisch gemanipuleerde muismodellen.

Isolatie en Cultuur Uitbreiding van Tumor-specifieke endotheelcellen

Dit protocol maakt de betrouwbare generatie en karakterisering van endotheliale cellen uit bloeduitgroei (BOEC's) mogelijk vanuit een klein volume volwassen perifeer bloed. BOEC's kunnen worden gebruikt als een surrogaat voor endotheelcellen van patiënten met vasculaire aandoeningen en als een substraat voor de generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen.

Generatie en cultuur van Blood uitgroei endotheelcellen van de humane perifere bloed

Endotheliale voorlopercellen (EPC's) zijn cruciaal betrokken zijn bij de vorming van nieuwe bloedvaten van ischemische weefsels. Deze werkwijze beschrijft de isolatie van humane EPC uit perifeer bloed, maar ook de identificatie van het trekkende bieden tegen sera van patiënten die hartchirurgie ondergaan.

Isolatie van endotheliale cellen van gezonde vrijwilligers en hun trekkende Potential Beïnvloed door Serum monsters na Hartchirurgie

Het doel van dit protocol is te isoleren van endotheliale voorlopercellen van bloed van de navelstreng. Enkele van de toepassingen zijn het gebruik van deze cellen als een biomarker voor het identificeren van patiënten met cardiovasculaire risico, behandeling van ischemische ziekten, en creëren weefsel-engineered vasculaire en hart ventiel construeert.

Isolatie van endotheliale voorlopercellen van menselijke navelstrengbloed

Endotheliale cellen van de tumor zijn belangrijke determinanten van de communicatie van de tumor en het verloop van de ziekte. Hier, wordt een protocol voor de isolatie van zuiver en levensvatbare endotheliale cellen van menselijke colorectaal carcinoom en normale dikke darm moet worden gebruikt in drugsonderzoek testen en pathogenese beschreven.

Isolatie van menselijke endotheliale cellen van normale Colon en colorectaal carcinoom - een verbeterde Protocol

Hier presenteren we een protocol om precies te vormen hemogenic endoteel van menselijke pluripotente stamcellen in een feeder-en xeno-vrije voorwaarde. Deze methode zal hebben brede toepassingen in ziektemodel lering en screening voor therapeutische verbindingen.

Hemogenic endoteel differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen in een voeder-en xeno-vrije gedefinieerde voorwaarde

Driedimensionaal co-Culture spheroid-systeem voor angiogenese is ontworpen om de fysiologische angiogenese na te bootsen. Co-Culture sferoïden worden gevormd door twee humane vasculaire celprecursoren, ecfcs en MSCS, en ingebed in collageen gel. Het nieuwe systeem is effectief voor het evalueren van angiogene modulatoren en verschaft relevantere informatie aan de in vivo studie.

Driedimensionaal angiogenese-assay systeem met co-Culture Spheroids gevormd door endotheliale kolonie vormende cellen en mesenchymale stamcellen

Hier wordt een eenvoudig protocol gepresenteerd voor de gerichte differentiatie van hemogene endotheelcellen van menselijke pluripotente stamcellen in ongeveer 1 week.

Gerichte differentiatie van hemogene endotheelcellen uit menselijke pluripotente stamcellen

Leer een dierlijk-serumvrije methode voor de isolatie en grootschalige expansie van endotheliale kolonievormende progenitorcellen (ECFC) uit volwassen menselijk perifeer bloed. Dit protocol minimaliseert het risico op immunisatie en ondersteunt onderzoek naar vasculaire homeostase en reparatie.

Isolatie en grootschalige expansie van volwassen humane endotheelcellen kolonievormende Progenitor Cellen

Meer video's verkennen