Visualiseren van Single-molecule DNA-replicatie met fluorescentiemicroscopie
October 9th, 2009
Dit protocol laat een eenvoudige single-molecule fluorescentie microscopie technieken voor het visualiseren van DNA-replicatie door individuele replisomes in real time.
Bij deze techniek worden glasdeksels gefunctionaliseerd met een mengsel van inerte en biotine peg-moleculen. Er wordt een stromingscel gemaakt met dit gefunctionaliseerde oppervlak en geplaatst op een turfmicroscoop. Biotinyleerde rollende cirkelsjablonen worden aan het oppervlak bevestigd met behulp van multivalente streptavidin.
Wanneer de substraten worden gerepliceerd door toevoeging van repli zone-eiwitten en nucleotiden, wordt het resulterende dubbelstrengs DNA uitgebreid met gelaagd stroming en in realtime geïmaged met behulp van een inter-colleterende kleurstof. Hoi, ik ben Nathan Tanner van het laboratorium van Antoine Van Ian in het Department of Biological Chemistry and Molecular pharmacology bij Harvard Medical School. Ik ben Joe Laro ook van het Van Noian-lab.
Vandaag laten we je een procedure zien voor fluorescentiebeeldvorming van DNA-replicatie in realtime op het niveau van enkele moleculen. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om gecoördineerde DNA-synthese-activiteiten van individuele replicatiecomplexen te bestuderen. Dus laten we beginnen.
Om deze procedure te starten, koppelt u het biotinyleerde staartoligo aan het M 13 eenstrengs DNA door een tienvoudige overmaat oligo in TBS-buffer toe te voegen, te verwarmen tot 65 graden Celsius, en vervolgens de heatblock uit te zetten om langzaam af te koelen om de primer goed te annelen. Nu de prime M 13 klaar is, voegt u het toe aan een mengsel van 64 nanomolar T zeven DNA-polymerase en T zeven replicatiebuffer bevattende D NDP's en magnesiumchloride en incubeert u de reactie bij 37 graden Celsius gedurende 12 minuten. Aan het einde van de incubatie, blus met 100 millimolar EDTA.
Zuiver vervolgens het opgevulde product DNA met fenol isoamylalcohol chloroform, extractie en dialyseer in TE-buffer of andere geschikte opslagbuffer, extraheer elke organische fase terug om eventueel restant geprimed te herstellen. M 13 na dialyse bepaal de DNA-concentratie met UV-vis spectrofotometer. Eén iteratie van sjabloonvoorbereiding kan genoeg nanomolare concentratie van sjabloon maken voor honderden tot duizenden eenmoleculaire experimenten.
Nu het DNA klaar is, gaat u verder met het voorbereiden van de gefunctionaliseerde deksels. Het te repliceren DNA wordt bevestigd aan glazen deksels gefunctionaliseerd met Amil Lane, de Oxy-groep van de Amil bindt aan het glas en laat een amin over voor binding van biotinyleerde peg-moleculen. Deze coating helpt om niet-specifieke binding aan het oppervlak te verminderen.
Plaats de glazen deksels in kleurvaten en vul de vaten met ethanol sonicate. Gedurende 30 minuten, spoel de vaten uit en vul met één molair kaliumhydroxide. Soniceer gedurende 30 minuten en herhaal beide wasbeurten. Voor de eerste functionalisatiereactie moeten alle sporen van water worden verwijderd.
Vul de kleurvaten met aceton en sonicate gedurende 10 minuten. Leeg de vaten en vul opnieuw met aceton. Voeg vervolgens het sine-reagens toe aan de vaten en schud gedurende twee minuten.
Blus vervolgens met een groot overschot aan water. Droog vervolgens de deksels door ze 30 minuten in de oven te bakken bij 110 graden Celsius. Bereid vervolgens het PEG-mengsel voor op ongeveer 0,2% gewicht per volume door geïnfiltreerd peg te gebruiken, inclusief een glazen deksel spacer die de deksels zal scheiden, pipetteer 100 microliter op een droge siloized deksel.
Plaats een tweede deksel erop. Incubeer de deksels gedurende drie uur in de PEG-oplossing. Schei vervolgens elk paar deksels en was uitgebreid met water.
Zorg ervoor dat de deksels gefunctionaliseerde zijde omhoog blijven, want slechts één zijde zal worden bedekt met peg. Droog ten slotte de deksels af met perslucht en bewaar ze onder vacuüm in een droge staat, de oppervlakken blijven minimaal een maand stabiel. Dus tientallen deksels kunnen in een batch worden gemaakt en naar behoefte worden gebruikt.
Nu de deksels klaar zijn, kan men de stromingskamer voor het eenmoleculaire experiment samenstellen. Begin door 20 tot 25 milliliter blokkeringsbuffer met BSA in een droge staat te plaatsen om eventuele luchtbellen te verwijderen voor latere stappen. Verdun vervolgens 25 microliter streptavidin in 100 microliter PBS en spreid de oplossing over het oppervlak van een gefunctionaliseerd PEG-deksel. Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur om streptavidin aan het oppervlak te laten binden aan biotine, terwijl u andere delen van de kamer voorbereidt.
Terwijl het deksel wordt geïncubeerd, snijdt u een stuk dubbelzijdig plakband met achterkant aan beide kanten zodat het overeenkomt met de grootte van de kwartsplaat die wordt gebruikt om de stromingskamer samen te stellen. Markeer de positie van de sleuven voor de buisjes op het plakband met een potlood, zodat een omtrek van de stromingskamer op het plakband kan worden getekend. Na het markeren van de gaten, maakt u een rechthoek van twee millimeter breed rond de markeringen.
Deze rechthoek zal dienen als stromingskanaal, dus zorg ervoor dat u rechte zijden maakt en ruimte laat rond de inlaat en uitlaat van de buis. Knip vervolgens het gemarkeerde plakband langs de getekende omtrek, maak rechte schone sneden om ervoor te zorgen dat er geen lijm in het kanaal steekt. Reinig de kwartsplaat grondig met aceton om lijm te verwijderen van de stromingscelconstructie die in eerdere experimenten is gebruikt.
Vind de beste uitlijning van de kanaalomtrek. Verwijder een kant van de kleefstofrug en plaats het plakband voorzichtig op de rechtbank. Zorg ervoor dat u het plakband goed uitlijnt, omdat de inlaat- en uitlaatgaten geblokkeerd moeten blijven.
Bereid vervolgens de buisjes voor, snijd lengte van 0,76 millimeter buis voor de inlaat en uitlaat van de stromingskamer. Het helpt om het uiteinde van de buis op ongeveer 30 graden hoek te snijden, zodat de buis niet plat tegen de bodem van de kamer drukt. Hang de buisjes op testbuisrekken voor gemakkelijke bevestiging aan de
Overzicht
Dit protocol toont een eenvoudige enkel-molecuul fluorescentie-microscopietechniek voor het visualiseren van DNA-replicatie door individuele replisomen in real time. De methode stelt onderzoekers in staat om de gecoördineerde activiteiten van DNA-synthese op het niveau van enkele moleculen te bestuderen.
Belangrijke onderdeels van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Biologische Chemie
- Moleculaire Farmacologie
Achtergrond
- Enkel-molecuul fluorescentie-microscopie biedt inzicht in DNA-replicatie.
- Begrip van replisome-dynamica is cruciaal voor het bestuderen van DNA-synthese.
- Deze techniek maakt gebruik van gefunctionaliseerde oppervlakken voor verbeterde beeldvorming.
- Real-time observatie van DNA-replicatie kan complexe biologische processen onthullen.
Doel van het onderzoek
- Om DNA-replicatie door individuele replisomen te visualiseren.
- Om een protocol voor real-time beeldvorming van DNA-synthese te ontwikkelen.
- Om de studie van replikatiecomplexactiviteiten te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Functionalisatie van glasdekjes met biotin-peg-moleculen.
- Creatie van een flowcel voor enkel-molecuulexperimenten.
- Bevestiging van biotinylerende rolling circle-sjablonen aan het oppervlak.
- Real-time beeldvorming met behulp van intercaleerbare kleurstoffen tijdens DNA-replicatie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van DNA-replicatieprocessen.
- Demonstratie van de effectiviteit van het protocol in real-time beeldvorming.
- Inzichten in de coördinatie van individuele replikatiecomplexen.
- Establering van een betrouwbare methode voor toekomstige studies.
Conclusies
- Het protocol maakt gedetailleerde observatie van DNA-replicatie mogelijk.
- Het biedt een basis voor verder onderzoek naar DNA-synthesedynamiek.
- Enkel-molecuultechnieken kunnen ons begrip van moleculaire biologie verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This single-molecule DNA replication assay provides direct visualization of replisome dynamics, enabling mechanistic de-risking of therapeutic targets involved in DNA synthesis. By quantifying replication rate and processivity at the individual molecule level, the method supports target validation and lead identification in oncology and antiviral programs where replication fidelity is a key determinant of drug response. The approach enhances predictive confidence in early discovery by linking molecular mechanism to functional output, informing go/no-go decisions before substantial investment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by directly observing replication complex activity and coordination.
- Operational Value: Supports biological de-risking through quantitative measurement of replication rate and processivity as functional readouts of target engagement.
- Scientific Value: Clarifies pathway-specific effects of perturbations on DNA synthesis machinery, improving target confidence.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces validated biological systems with defined replication kinetics for downstream compound screening.
- Operational Value: Delivers standardized, quantitative outputs (rate in bp/s, processivity in kb) enabling assay reproducibility and cross-laboratory comparability.
- Scientific Value: Facilitates screening readiness by providing a sensitive, real-time readout of replication inhibition or stimulation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems where dysregulated replication contributes to pathology, such as in cancer or viral infection models.
- Operational Value: Ensures translational continuity from discovery through preclinical validation by maintaining consistent mechanistic readouts.
- Scientific Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by linking target modulation to measurable changes in replication dynamics.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, providing mechanistic insights that bridge biochemical and phenotypic screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing real-time activities of individual replication complexes under defined conditions.
- Screening: Enables assay readiness through quantitative, real-time measurements of DNA synthesis that are amenable to high-content analysis and compound library screening.
- Analytics: Generates precise measurements of replication rate (bp/s) and processivity (kb) via linear regression and exponential fitting of single-molecule trajectories, enabling objective comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing a functional readout of replication fidelity that correlates with cellular proliferation and genome stability phenotypes.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform capability for evaluating replication-targeting agents across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in DNA synthesis pathways through direct observation.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility via surface-functionalized flow cells and real-time imaging protocols that minimize variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by delivering early, mechanism-based efficacy signals that reduce late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on their effects on replication dynamics, supporting capital-efficient advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-molecule fluorescence microscopy, surface functionalization, and DNA biochemistry.
- Needs a fluorescence microscope with sensitive camera, laminar flow control, and intercalating dye compatibility for real-time visualization.
- Demands cross-team standardization of surface preparation, flow cell assembly, and imaging parameters to ensure data comparability.
- Involves adaptation considerations for different template designs, protein concentrations, and buffer conditions to optimize molecule density and signal-to-noise.
- Practical limitations include the need to manage photo damage at high laser power and challenges in resolving high-density replication events without dilution or lower surface coverage.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
0:42
Introduction
1:11
Preparing the DNA Replication Template
5:46
Assembling the Flow Chamber
2:44
Preparing Functionalized Coverslips
10:03
Single-Molecule Replication Experiment
13:18
Single Molecule DNA Replication Data Analysis and Representative Results
15:00
Conclusion
