Montage, laden, en uitlijning van een Analytical Ultracentrifuge Sample Cell
5 november 2009
De analytische ultracentrifuge (AUC) monster cel houdt monster en referentie-buffer en tijdens de experimenten en wordt blootgesteld aan een hoog vacuüm en rotor met snelheden tot 60.000 tpm. Deze video zal aantonen aan de strenge aandacht voor detail nodig is voor de montage, laden en afstemming van deze zeer belangrijke component van een AUC experiment.
Hallo, ik ben Andrea Balbo. Ik werk in de Peter Shucks-groep bij de National Institutes of Health. In deze video gaan we u onze procedures demonstreren voor de assemblage, belasting en rotoruitlijning van een analytische ultracentrifuge monstercel.
Laten we beginnen.Verzameld. Hier zijn de componenten van een analytische ultracentrifuge monstercel Gestapeld in het celhuis is een 12 millimeter dubbele sector houtskoolveld, epon middelpunt dat tussen twee vensterassemblages zal worden ingeklemd. Elke vensterassemblage bestaat uit een vensterpakking, een venstervoering en een venster dat in de vensterhouder wordt gehouden.
Deze stukken worden vervolgens naar binnen geschoven in het celhuis door hun sleutelbanen uit te lijnen met de sleutel die zich in de huishoudingsvat, een huishoudingspakking en vervolgens een schroefring bevindt. De monstercel wordt gesloten met een koppeldruk van tussen 120 en 140 inch pond. Na het laden van uw monster in referentie twee huishoudingsplugpakkingen en een huishoudingsplugverzegelde de laaddeopeningen van de cel om scanningartefacten, lekken en breuk tijdens experimenten te voorkomen, is het van vitaal belang dat alle componenten schoon, droog, stof, vrij en in de best mogelijke staat zijn, vaak worden onderzocht en worden vervangen wanneer nodig. U hebt ook het volgende nodig, een analytische ultracentrifuge, titanium vier-gats rotor, een laboratoriumweegschaal, een koppelsleutel met een leesbare wijzerplaat en een koppelstandaat, een tegengewicht en tegengewichtsgewichten, een kruiskopschroevendraaier, een paar pincetten, een 200 microliter pipetter uitgerust met een lange taps toelopende pipettetip, uitlijningsgereedschappen en spincoat-smeermiddel.
We beginnen met de constructie van de monstercel door twee vensterassemblages samen te stellen. Plaats eerst een vensterpakking op de bodem van de vensterhouder. Plaats vervolgens de venstervoering, of soms wordt het een vensterkussen genoemd, in de vensterhouder, zodat de opening van de voering tegenover de sleutelbaan van de houder op een lichte hoek staat.
Plaats vervolgens het venster in de houder en lijn het scribeermerk op het venster uit met de sleutelbaan van de vensterhouder. Druk voorzichtig op de randen aan beide zijden van het venster. Om een goede afdichting en nauwkeurige twerking van de monstercel te garanderen, bedekken we lichtjes de huishoudingspakking in de schroefring.
Met spincoat-smeermiddel, spreid een zeer kleine hoeveelheid spincoat tussen uw duim en wijsvinger. Bekleed de schroefringdraden met een dunne, onzichtbare film van spincoat. Bekleed eveneens de huishoudingspakking.
Veeg eventueel zichtbaar smeermiddel af. Om de monstercelsamenstelling te beginnen. Schuif één vensterassemblage met het venster naar boven naar u toe in het celhuis door de sleutelbaan uit te lijnen met de huissleutel.
Lijn de sleutelbaan van het middelpunt uit met de huissleutel en laat deze voorzichtig op de vensterassemblage in de behuizing vallen. Gebruik nooit een soort gereedschap om het middelpunt in de celbehuizing te duwen. Dit kan permanent schade aan het middelpunt veroorzaken, wat resulteert in lekkende opslagexperimenten.
Draai de tweede vensterassemblage zodat het venster naar het middelpunt kijkt en van u af. Lijn de sleutelbaan uit met de huissleutel en schuif deze bovenop het middelpunt. Plaats de huishoudingspakking erop.
Vervolgens een schroefring zodat het woord uit zichtbaar is. Gebruik je vingers. Vervolgens een uitlijningsgereedschap, draai de schroefring met de hand vast.
Soms glijdt het middelpunt niet gemakkelijk in de behuizingsvat. U kunt het eerst uitlijnen en vervolgens de tweede vensterassemblage erop plaatsen. Door zachte neerwaartse druk op de vensterassemblage uit te oefenen.
U kunt beide tegelijkertijd in de celbehuizing schuiven. Op deze manier vermijden we direct op het middelpunt te drukken. Nu is een goed moment om de cel te controleren op stof, pluisjes en vingerafdrukken.
U zult ook Newton-ringen opmerken die aangeven dat er nog steeds lucht tussen het middelpunt en de vensters is. Deze verdwijnen na het torseren met de schroefring omhoog en het woord uit zichtbaar. Plaats de monstercel helemaal naar binnen in de cel.
Torque colette van het koppelstandaat. Houd de cel op zijn plaats door constante druk op de hendel van het koppelstandaat uit te oefenen. In een continue beweging, tors de schroefring tot tussen 120 en 140 inch pond.
Laat de hendel van het koppelstandaat los en verwijder voorzichtig de monstercel. We laden routinematig een volume van 400 microliter in elk sector van de 12 millimeter middelpunt. Gebruik een 200 microliter pipetter om de monstercel te positioneren met de laaddeopeningen boven en het woord uit op de schroefring zichtbaar.
Schuif de pipettetip halverwege in de linker middelpuntsector door de laaddeopeningen en giet langzaam 200 microliter referentieoplossing. Herhaal eens om in totaal 400 microliter te bereiken met behulp van dezelfde pipettetip en dezelfde techniek voorzichtig en langzaam. Vul de rechter middelpuntsector met 400 microliter monstersoplossing.
Het is van essentieel belang om de volumes van referentie- en monstersoplossingen zo dicht mogelijk bij elkaar te matchen. Door de pipettetip stevig op de pipetter te passen, langzaam oplossingen te laden en af te geven, het laden van luchtbellen te vermijden en dezelfde pipettetip voor beide oplossingen te gebruiken. Alles helpt bij het gelijk houden van de volumes om de cel te verzegelen.
Plaats twee rode huishoudingsplugpakkingen stevig in elke laaddeopening en zorg ervoor dat ze voorzichtig tussen het middelpunt en de aluminium behuizing zijn gepositioneerd. Bedek elke laaddeopening met een huishoudingsplug en draai deze met een kleine platte kopschroevendraaier vast. Voordat u de rotor laadt, moet u ervoor zorgen dat het tegengewicht en de cel die tegenover het tegengewicht zullen staan binnen 0,5 gram van elkaar in gewicht zijn.
Begin met een balans op nul. Weeg eerst een monster
Overzicht
Deze video toont de assemblage, het laden en de uitlijning van een analytische ultracentrifuge (AUC) monstercel, wat cruciaal is voor AUC-experimenten. De nadruk ligt op de juiste behandeling en voorbereiding van de monstercelcomponenten om nauwkeurige resultaten te garanderen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Analytische ultracentrifugatie
- Biofysische methoden
- Technieken voor monstervoorbereiding
Achtergrond
- De AUC monstercel is essentieel voor het uitvoeren van experimenten bij hoge rotorsnelheden.
- Het bestaat uit meerdere componenten die met precisie moeten worden geassembleerd.
- Het handhaven van netheid en juiste uitlijning is cruciaal om experimentele artefacten te voorkomen.
- Het begrijpen van het assemblageproces is van vitaal belang voor onderzoekers die AUC gebruiken.
Doel van de studie
- Om een gedetailleerde gids te bieden over het assembleren en laden van een AUC monstercel.
- Om de belangrijkheid van zorgvuldige voorbereiding in AUC-experimenten te benadrukken.
- Om ervoor te zorgen dat onderzoekers het proces nauwkeurig kunnen repliceren.
Gebruikte methoden
- Assemblage van vensterassemblages en het middelstuk in de monstercel.
- Toepassing van torque om de monstercelcomponenten vast te zetten.
- Het laden van referentie- en monsteroplossingen in de cel.
- Het balanceren van de monstercel met een tegengewicht voor nauwkeurige metingen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle assemblage van de AUC monstercel gedemonstreerd in de video.
- Correcte laadtechnieken zorgen voor minimale bellen en gelijke volumes.
- Tegengewichtaanpassingen zijn cruciaal voor nauwkeurige rotorprestaties.
- Visuele indicatoren, zoals Newton's ringen, helpen bij het beoordelen van de assemblagekwaliteit.
Conclusies
- Aandacht voor detail in de assemblage van de monstercel is essentieel voor AUC-experimenten.
- Het volgen van de beschreven procedures kan de betrouwbaarheid van het experiment verbeteren.
- Regelmatige onderhoud en inspectie van componenten worden aanbevolen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Proper assembly and alignment of analytical ultracentrifuge sample cells are critical for generating reliable biophysical data on protein size, shape, purity, and oligomerization states. Meticulous sample cell preparation minimizes experimental artifacts, ensuring data integrity for target validation and mechanistic studies in early drug discovery. This procedural rigor supports predictive confidence in downstream screening and lead optimization workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables precise determination of protein oligomerization states and protein-protein interactions, directly informing target validation hypotheses.
- Operational Value: Provides label-free, solution-based assessment of macromolecular properties under near-native conditions.
- Predictive Value: Reduces mechanistic ambiguity in target de-risking by delivering quantitative sedimentation coefficients and shape parameters.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers hydrodynamic size and shape data essential for assay buffer formulation and stability screening.
- Operational Value: Ensures sample integrity and monodispersity, critical for reproducible biochemical and cell-based assays.
- Platform Integration: Supports biophysical characterization of purified targets prior to high-throughput screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables assessment of protein complex formation and conformational changes relevant to disease mechanisms.
- Operational Value: Supports lot-to-lot consistency checks of recombinant proteins used in preclinical models.
- Translational Continuity: Bridges biophysical target characterization with functional assays in disease-relevant systems.
Pipeline & Workflow Integration
The analytical ultracentrifuge sample cell workflow integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification, providing biophysical readouts that inform go/no-go decisions based on target behavior and stability.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of target oligomerization and interaction networks, enabling biological de-risking prior to assay development.
- Screening: Ensures target monodispersity and stability, directly impacting assay readiness and data quality in screening campaigns.
- Analytics: Generates quantitative sedimentation coefficient and molecular weight measurements that allow comparison of protein states under varying conditions.
- Translational Research: Connects purified target biophysics to functional validation in preclinical models through consistent material quality.
- Enterprise Reuse: Represents a standardized, reusable capability for biophysical characterization across multiple targets and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target properties, reduction of mechanistic ambiguity, and improved target validation rigor.
- Operational Value: Standardized sample preparation, reproducibility across runs, and scalability across laboratories.
- Strategic Value: Better-informed go/no-go decisions, reduced failure rates due to target instability, and improved capital efficiency in early discovery.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted target prioritization based on biophysical de-risking data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in biophysical techniques and precision handling of optical components.
- Dependent on analytical ultracentrifuge instrumentation, torque wrenches, alignment tools, and cleanroom-compatible sample handling.
- Necessitates cross-team standardization of cleaning, assembly, and torque application protocols.
- Involves adaptation considerations for different sample types, buffer conditions, and centerpiece geometries.
- Limited by component fragility; windows and centerpieces are susceptible to damage from particulates, improper torque, or misalignment.
