Montage, laden, en uitlijning van een Analytical Ultracentrifuge Sample Cell
5 november 2009
De analytische ultracentrifuge (AUC) monster cel houdt monster en referentie-buffer en tijdens de experimenten en wordt blootgesteld aan een hoog vacuüm en rotor met snelheden tot 60.000 tpm. Deze video zal aantonen aan de strenge aandacht voor detail nodig is voor de montage, laden en afstemming van deze zeer belangrijke component van een AUC experiment.
Hallo, ik ben Andrea Balbo. Ik werk in de Peter Shucks-groep bij de National Institutes of Health. In deze video gaan we u onze procedures demonstreren voor de assemblage, belasting en rotoruitlijning van een analytische ultracentrifuge monstercel.
Laten we beginnen.Verzameld. Hier zijn de componenten van een analytische ultracentrifuge monstercel Gestapeld in het celhuis is een 12 millimeter dubbele sector houtskoolveld, epon middelpunt dat tussen twee vensterassemblages zal worden ingeklemd. Elke vensterassemblage bestaat uit een vensterpakking, een venstervoering en een venster dat in de vensterhouder wordt gehouden.
Deze stukken worden vervolgens naar binnen geschoven in het celhuis door hun sleutelbanen uit te lijnen met de sleutel die zich in de huishoudingsvat, een huishoudingspakking en vervolgens een schroefring bevindt. De monstercel wordt gesloten met een koppeldruk van tussen 120 en 140 inch pond. Na het laden van uw monster in referentie twee huishoudingsplugpakkingen en een huishoudingsplugverzegelde de laaddeopeningen van de cel om scanningartefacten, lekken en breuk tijdens experimenten te voorkomen, is het van vitaal belang dat alle componenten schoon, droog, stof, vrij en in de best mogelijke staat zijn, vaak worden onderzocht en worden vervangen wanneer nodig. U hebt ook het volgende nodig, een analytische ultracentrifuge, titanium vier-gats rotor, een laboratoriumweegschaal, een koppelsleutel met een leesbare wijzerplaat en een koppelstandaat, een tegengewicht en tegengewichtsgewichten, een kruiskopschroevendraaier, een paar pincetten, een 200 microliter pipetter uitgerust met een lange taps toelopende pipettetip, uitlijningsgereedschappen en spincoat-smeermiddel.
We beginnen met de constructie van de monstercel door twee vensterassemblages samen te stellen. Plaats eerst een vensterpakking op de bodem van de vensterhouder. Plaats vervolgens de venstervoering, of soms wordt het een vensterkussen genoemd, in de vensterhouder, zodat de opening van de voering tegenover de sleutelbaan van de houder op een lichte hoek staat.
Plaats vervolgens het venster in de houder en lijn het scribeermerk op het venster uit met de sleutelbaan van de vensterhouder. Druk voorzichtig op de randen aan beide zijden van het venster. Om een goede afdichting en nauwkeurige twerking van de monstercel te garanderen, bedekken we lichtjes de huishoudingspakking in de schroefring.
Met spincoat-smeermiddel, spreid een zeer kleine hoeveelheid spincoat tussen uw duim en wijsvinger. Bekleed de schroefringdraden met een dunne, onzichtbare film van spincoat. Bekleed eveneens de huishoudingspakking.
Veeg eventueel zichtbaar smeermiddel af. Om de monstercelsamenstelling te beginnen. Schuif één vensterassemblage met het venster naar boven naar u toe in het celhuis door de sleutelbaan uit te lijnen met de huissleutel.
Lijn de sleutelbaan van het middelpunt uit met de huissleutel en laat deze voorzichtig op de vensterassemblage in de behuizing vallen. Gebruik nooit een soort gereedschap om het middelpunt in de celbehuizing te duwen. Dit kan permanent schade aan het middelpunt veroorzaken, wat resulteert in lekkende opslagexperimenten.
Draai de tweede vensterassemblage zodat het venster naar het middelpunt kijkt en van u af. Lijn de sleutelbaan uit met de huissleutel en schuif deze bovenop het middelpunt. Plaats de huishoudingspakking erop.
Vervolgens een schroefring zodat het woord uit zichtbaar is. Gebruik je vingers. Vervolgens een uitlijningsgereedschap, draai de schroefring met de hand vast.
Soms glijdt het middelpunt niet gemakkelijk in de behuizingsvat. U kunt het eerst uitlijnen en vervolgens de tweede vensterassemblage erop plaatsen. Door zachte neerwaartse druk op de vensterassemblage uit te oefenen.
U kunt beide tegelijkertijd in de celbehuizing schuiven. Op deze manier vermijden we direct op het middelpunt te drukken. Nu is een goed moment om de cel te controleren op stof, pluisjes en vingerafdrukken.
U zult ook Newton-ringen opmerken die aangeven dat er nog steeds lucht tussen het middelpunt en de vensters is. Deze verdwijnen na het torseren met de schroefring omhoog en het woord uit zichtbaar. Plaats de monstercel helemaal naar binnen in de cel.
Torque colette van het koppelstandaat. Houd de cel op zijn plaats door constante druk op de hendel van het koppelstandaat uit te oefenen. In een continue beweging, tors de schroefring tot tussen 120 en 140 inch pond.
Laat de hendel van het koppelstandaat los en verwijder voorzichtig de monstercel. We laden routinematig een volume van 400 microliter in elk sector van de 12 millimeter middelpunt. Gebruik een 200 microliter pipetter om de monstercel te positioneren met de laaddeopeningen boven en het woord uit op de schroefring zichtbaar.
Schuif de pipettetip halverwege in de linker middelpuntsector door de laaddeopeningen en giet langzaam 200 microliter referentieoplossing. Herhaal eens om in totaal 400 microliter te bereiken met behulp van dezelfde pipettetip en dezelfde techniek voorzichtig en langzaam. Vul de rechter middelpuntsector met 400 microliter monstersoplossing.
Het is van essentieel belang om de volumes van referentie- en monstersoplossingen zo dicht mogelijk bij elkaar te matchen. Door de pipettetip stevig op de pipetter te passen, langzaam oplossingen te laden en af te geven, het laden van luchtbellen te vermijden en dezelfde pipettetip voor beide oplossingen te gebruiken. Alles helpt bij het gelijk houden van de volumes om de cel te verzegelen.
Plaats twee rode huishoudingsplugpakkingen stevig in elke laaddeopening en zorg ervoor dat ze voorzichtig tussen het middelpunt en de aluminium behuizing zijn gepositioneerd. Bedek elke laaddeopening met een huishoudingsplug en draai deze met een kleine platte kopschroevendraaier vast. Voordat u de rotor laadt, moet u ervoor zorgen dat het tegengewicht en de cel die tegenover het tegengewicht zullen staan binnen 0,5 gram van elkaar in gewicht zijn.
Begin met een balans op nul. Weeg eerst een monster
Overzicht
Deze video demonstreert de assemblage, het laden en de uitlijning van een monstercel voor een analytische ultracentrifuge (AUC), wat cruciaal is voor AUC-experimenten. Er wordt nadruk gelegd op de juiste behandeling en voorbereiding van de componenten van de monstercel om nauwkeurige resultaten te garanderen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Analytische ultracentrifugatie
- Biofysische methoden
- Technieken voor monstervoorbereiding
Achtergrond
- De AUC-monstercel is essentieel voor het uitvoeren van experimenten bij hoge rotorsnelheden.
- Deze bestaat uit meerdere componenten die met precisie geassembleerd moeten worden.
- Het behouden van reinheid en een juiste uitlijning is cruciaal om experimentele artefacten te voorkomen.
- Inzicht in het assemblageproces is essentieel voor onderzoekers die AUC gebruiken.
Doel van de studie
- Om een gedetailleerde handleiding te bieden voor het assembleren en laden van een AUC-monstercel.
- Om het belang van een zorgvuldige voorbereiding bij AUC-experimenten te benadrukken.
- Om ervoor te zorgen dat onderzoekers het proces nauwkeurig kunnen repliceren.
Gebruikte methoden
- Montage van raamstellingen en het middenstuk in de monstercel.
- Aanbrengen van een koppel om de componenten van de monstercel vast te zetten.
- Laden van referentie- en monsteroplossingen in de cel.
- Balanceren van de monstercel met een contragewicht voor nauwkeurige metingen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle assemblage van de AUC-monstercel zoals gedemonstreerd in de video.
- Correcte laadtechnieken zorgen voor minimale beluchtingsbubbels en gelijke volumes.
- Aanpassingen van het contragewicht zijn cruciaal voor nauwkeurige rotorprestaties.
- Visuele indicatoren, zoals Newton-ringen, helpen bij het beoordelen van de assemblagekwaliteit.
Conclusies
- Aandacht voor detail bij de assemblage van de monstercel is essentieel voor AUC-experimenten.
- Het volgen van de beschreven procedures kan de betrouwbaarheid van de experimenten verhogen.
- Regelmatig onderhoud en inspectie van de componenten worden aanbevolen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Correcte assemblage en uitlijning van monstercellen voor analytische ultracentrifugatie zijn essentieel voor het genereren van betrouwbare biofysische gegevens over de grootte, vorm, zuiverheid en oligomerisatietoestanden van eiwitten. Een nauwkeurige voorbereiding van de monstercel minimaliseert experimentele artefacten, waardoor de data-integriteit voor targetvalidatie en mechanistische studies in de vroege fase van geneesmiddelenontwikkeling wordt gewaarborgd. Deze procedurele striktheid ondersteunt het voorspellend vertrouwen in downstream screening- en lead-optimalisatieworkflows.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt een precieze bepaling van proteïnoligomerisatie-toestanden en eiwit-eiwitinteracties mogelijk, wat direct bijdraagt aan hypothesen voor targetvalidatie.
- Operationele waarde: Biedt een labelvrije, in oplossing gebaseerde beoordeling van macromoleculaire eigenschappen onder bijna-natuurlijke condities.
- Voorspellende waarde: Vermindert mechanische ambiguïteit bij het verlagen van risico's bij targets door kwantitatieve sedimentatiecoëfficiënten en vormparameters te leveren.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert gegevens over hydrodynamische grootte en vorm die essentieel zijn voor de formulering van assaybuffers en stabiliteitsonderzoek.
- Operationele waarde: Waarborgt monsterintegriteit en monodispersiteit, wat cruciaal is voor reproduceerbare biochemische en celgebaseerde assays.
- Platformintegratie: Ondersteunt de biofysische karakterisering van gezuiverde targets voorafgaand aan high-throughput screeningcampagnes.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om de vorming van eiwitcomplexen en conformationele veranderingen te beoordelen die relevant zijn voor ziekte-mechanismen.
- Operationele waarde: Ondersteunt controles van lot-tot-lot consistentie van recombinante eiwitten die worden gebruikt in preklinische modellen.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen de biofysische karakterisering van targets en functionele assays in ziekte-relevante systemen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De workflow van de monstercel van de analytische ultracentrifuge is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van doelwitvalidatie tot lead-identificatie, en biedt biofysische resultaten die go/no-go-beslissingen informeren op basis van het gedrag en de stabiliteit van het doelwit.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetesten van target-oligomerisatie en interactienetwerken, waardoor biologische risico's kunnen worden beperkt vóór de ontwikkeling van assays.
- Screening: Waarborgt de monodispersiteit en stabiliteit van het target, wat een directe impact heeft op de assay-gereedheid en de datakwaliteit in screeningscampagnes.
- Analytica: Genereert kwantitatieve metingen van de sedimentatiecoëfficiënt en het molecuulgewicht, waardoor eiwittoestanden onder verschillende omstandigheden kunnen worden vergeleken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt de biofysica van gezuiverde targets met functionele validatie in preklinische modellen door middel van een consistente materiaalkwaliteit.
- Enterprise-hergebruik: Vertegenwoordigt een gestandaardiseerde, herbruikbare capaciteit voor biofysische karakterisering over meerdere targets en projecten heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende zekerheid over doeleigenschappen, vermindering van mechanistische ambiguïteit en een verbeterde striktheid bij de validatie van targets.
- Operationele waarde: Gestandaardiseerde monstervoorbereiding, reproduceerbaarheid tussen runs en schaalbaarheid over verschillende laboratoria.
- Strategische waarde: Beter geïnformeerde go/no-go-beslissingen, lagere faalkansen door target-instabiliteit en een verbeterde kapitaalefficiëntie in de vroege fase van discovery.
- Impact op de portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering van targets op basis van biofysische de-riskinggegevens.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in biofysische technieken en precieze hantering van optische componenten.
- Afhankelijk van analytische ultracentrifuge-instrumentatie, momentsleutels, uitlijningsinstrumenten en cleanroom-compatibele monsterhandeling.
- Necessiteert cross-team standaardisatie van protocollen voor reiniging, assemblage en het aanbrengen van het koppelmoment.
- Omvat overwegingen voor adaptatie aan verschillende monstertypes, buffercondities en centerpiece-geometrieën.
- Beperkt door de fragiliteit van componenten; vensters en centerpieces zijn gevoelig voor schade door particulate, onjuist koppelmoment of verkeerde uitlijning.
