Geautomatiseerd systeem voor Single Molecule Fluorescentie metingen van Surface-geïmmobiliseerde biomoleculen

Om de dynamiek van individuele moleculen over een langere periode te bestuderen, moeten de moleculen eerst in de ruimte worden gelokaliseerd. Dit doen we door ze te immobiliseren op het oppervlak van een microfluïdische cel. De procedure begint met de assemblage van de cel, die vier kamers bevat waarin de biomoleculen zullen worden gefixeerd.

De kamers zijn via inlaat- en uitlaatcapillaren verbonden met de buitenkant. De cel wordt vervaardigd door een gestructureerde PDMS-schijf te versmelten met een kwartsdekglaasje. De geassembleerde cel wordt vervolgens op de fluorescentiemicroscoop gemonteerd en flexibele slangetjes worden op de capillairen aangesloten om een eenvoudige uitwisseling van oplossingen door de kamers mogelijk te maken; om het oppervlak eerst te activeren voor moleculaire immobilisatie wordt een oplossing van gebiotineerd BSA door een van de kanalen gestroomd.

BSA zal absorberen aan de kamer. Voer vervolgens een streptavidine-oplossing over de oppervlakken, die op zijn beurt zal binden aan de biotine. Voer tot slot uw gebiotinyleerde oligonucleotide door, dat zal binden aan de streptavidine, waardoor het betreffende molecuul aan het oppervlak van het kwartsdikglas wordt verankerd.

Een imagingbuffer, ontworpen om de stabiliteit van de levensduur en de intensiteit van de fluoroforen te maximaliseren, wordt gedurende de gehele acquisitieperiode met een constante snelheid door de kamer geleid. De geautomatiseerde opstelling scant verschillende secties van het oppervlak op moleculen die zowel donor- als acceptorfluoroforen bevatten, en verplaatst deze vervolgens één voor één naar het probeervolume om voor elk een tijdreeks van de fluorescentie-intensiteit te verkrijgen totdat beide fluoroforen fotobleken. Hallo, ik ben Nicholas Dfi van het laboratorium van professor Miller in de afdeling biomedische technologie aan de Boston University.

Vandaag laten we u een procedure zien om single molecule F-sporen te verkrijgen van geïmmobiliseerde nucleïnezuren met behulp van een confocale opstelling. Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de dynamiek van nucleïnezuren en de interacties tussen nucleïnezuren en enzymen te bestuderen. Laten we beginnen.

De microfluïdische cel wordt vervaardigd door een gestructureerde, twee millimeter dikke schijf van polydimethylsiloxaan (PDMS) te versmelten met een vers gereinigde kwarts dekglasplaat. Om de gestructureerde PDMS-schijf te maken, worden 10 delen silicone elastomeerbasis gemengd met één deel hardeningsmiddel; meng dit goed en ontgas het mengsel gedurende één uur in een vacuüm. Nadat de elastomeerbasis is ontgast, wordt deze voorzichtig in de mal voor de microfluïdische cel gegoten.

Laat het elastomeermengsel twee uur lang uitharden op een warmteplaat bij 70 °C. Pel de PDMS-schijf na uitharding voorzichtig met een scheermesje van de mal. De PDMS-schijf bevat vier rechthoekige kamers van 30 µL.

Versmelt de vlakke zijde van de PDMS-schijf, de zijde zonder de kanalen, op een glazen venster van één inch door beide oppervlakken gedurende 30 seconden plasma-oxideren. Het glazen venster bevat aan beide uiteinden van de kanalen acht gaatjes van twee millimeter die voorheen zijn geboord. Vervolgens wordt een flexibele capillairbuis van gesmolten silica met een lengte van twee inch door elk gat in het glazen venster ingevoegd.

Voer hiervoor eerst een naald in en schuif vervolgens de capillaire buis door tot deze het kanaal bereikt. Afdichten van de gaten in het glazen venster met een snel uithardend siliconen gietcompound, zoals Quick Cast. Spoel de kanalen met ethanol en water nadat de cel en een vers met piranha-oplossing gereinigde cirkelvormige kwartsdraden van één inch gedurende 30 seconden plasma-geactiveerd zijn.

Smelt het dekglas aan de zijkant van de cel die de kanalen bevat. De kamers zijn nu verzegeld. Laat de geassembleerde cel een nacht uitharden bij kamertemperatuur.

Nadat het geassembleerde microfluïdische device een nacht heeft uitgehard, wordt het in een op maat gemaakte houder geplaatst en op de tafel van de confocale microscoop gemonteerd om te beginnen met het activeren van het oppervlak van de cel. Sluit voor molecuulimmobilisatie flexibele slangetjes aan op de capillairen van de cel om bufferinjectie met behulp van een spuit en een naald te vergemakkelijken. Injecteer nu een oplossing van 0,1 mg/mL gebiotineerd BSA in buffer A in het kanaal en incubeer dit gedurende ten minste 30 minuten.

Na de incubatie van 30 minuten wordt er 300 tot 500 µL buffer A doorgevoerd om niet-geabsorbeerd gebiotinyleerd BSA uit het kanaal te verwijderen; let erbij op dat er geen luchtbellen in de kamer terechtkomen. Injecteer vervolgens een oplossing van 0,1 mg/mL STR din in buffer A en incubeer dit gedurende 15 minuten.

Na de incubatiestroom van 15 minuten worden 300 tot 500 µL buffer A doorHet kanaal geleid om eventueel niet-geadsorbeerd strep din te verwijderen. Vermijd, zoals voorheen, het insluiten van luchtbellen in de kamer. Leid ten slotte een oplossing van drie tot vijf pM van het gebiotineerde monster door.

Om de dekking van fluorescerende moleculen te controleren, wordt een oppervlaktescan uitgevoerd. Incubeer het gebiotinyleerde monster gedurende 10 minuten en herhaal de doorstroming van de buffer. Zoals eerder beschreven, bestaat de imaging-buffer of IB uit een enzymatisch zuurstofvrijmakend systeem en een triplet-quencher zoals trolox om de IB eerst op te lossen.

Vijf milligram trol wordt opgelost in 10 milliliters glucosebuffer door een paar minuten te vortexen en minimaal 10 minuten te schudden. Filtreer de oplossing en laat deze 10 minuten ontgassen in vacuüm. Meng de TRO lock-oplossing voorzichtig met de Glocky-enzymatische oplossing, waarbij de vorming van luchtbellen wordt vermeden.

Vul het reservoir met de IB-oplossing. Gebruik vervolgens een mechanische spuitpompe om de stroomsnelheid te regelen en laat de IB met een constante snelheid van 5 µL per minuut door het kanaal stromen; leid argon-gas in het IB-reservoir om te voorkomen dat atmosferische zuurstof in de buffer oplost. De oppervlaktescan, molecuul lokalisatie en acquisitie van intensiteitssporen van enkelvoudige moleculen worden aangestuurd door het LabVIEW-programma, dat gebieden van 20 bij 20 µm² scant met een resolutie van 0,2 µm en een snelheid van 0,1 µm per ms.

De gegevens van de oppervlaktescan worden onmiddellijk verwerkt om de intensiteitsgewogen locaties van alle pixels boven de achtergrondtellingen te bepalen. Zodra de geïmmobiliseerde moleculen zijn gevonden, worden ze één voor één naar het confocale volume verplaatst en worden de intensiteiten van de donor- en acceptorfluorofoor geregistreerd als functie van de tijd totdat beide fluoroforen zijn gefotogebleekt. De tafel wordt vervolgens geprogrammeerd om naar een nieuw nulpunt te bewegen, 100 millimeter verderop, waarna het scanproces wordt herhaald.

De geassembleerde MICROFLUID Excel wordt hier getoond. Dit zijn oppervlaktescans die individuele moleculen laten zien in de groene donor- en rode acceptorkanalen. Er worden enkele typische sporen van individuele moleculen getoond, waarbij de acceptorintensiteit in het rood en de donor in het groen is weergegeven.

We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u single-molecule traces kunt verkrijgen van geïmmobiliseerde biomoleculen met behulp van een confocale opstelling. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om elke stap zorgvuldig uit te voeren en de tijd te nemen, aangezien dit een uitdagend experiment is. Dat is alles.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.