Name: Geautomatiseerd systeem voor Single Molecule Fluorescentie metingen van Surface-geïmmobiliseerde biomoleculen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-02T16:05:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Leer een geautomatiseerde methode voor single molecule FRET-metingen van oppervlak-geïmmobiliseerde DNA-moleculen met behulp van een confocale microscoop. Deze techniek maakt gedetailleerde analyse van nucleïnezuurdynamica en enzyminteracties mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Chandran Sabanayagam voor zijn hulp bij de ontwikkeling van het systeem, Joshua Edel voor advies over het ontwerpen van de microfluïdische apparaat en de medewerkers van het Instituut Rowland aan de Harvard University voor de bewerking delen van de installatie. Wij erkennen nuttige discussies met leden van de groep Meller&#39;s op de Rowland Instituut en aan Boston University, en leden van T. Ha &#39;s groep UIUC voor nuttige informatie. Tot slot, we waarderen de financiële steun van de National Science Foundation (PHY-0701207) en het National Institute of Health (GM075893).

1 - Montage van de microfluïdische cel De microfluïdische cel is gemaakt door het fuseren van een patroon, 2 mm dik, polydimethylsiloxaan (PDMS) schijf naar een schone kwarts dekglas. De PDMS schijf bevat vier 30 ul rechthoekige kamers die worden benaderd door in-en uitlaat flexibel haarvaten verbonden met een buffer reservoir en een spuit pomp, respectievelijk voor de gecontroleerde stroom van buffer. De stroom cel is ondersteund op de achterzijde door een glazen raam en geplaatst op een custom-made cel houder met een watergekoelde thermo-element om de temperatuur te regelen. <ol><li> Om het patroon PDMS schijf, 10 delen siliconenelastomeer basis mengen met 1 deel verharder, goed mengen en laat ontgassing gedurende 1 uur in een vacuüm. </li><li> Giet het elastomeer mix op de microfluïdische cel mal. In ons geval is dit een 1 &quot;silicium wafer met vier stroken (1x10 4 x 1x10 3 x 300 urn) gemaakt van negatieve fotolak. Laat dit te genezen op een hete plaat bij 70 ° C gedurende twee uur. </li><li> Zorgvuldig verwijderen de uitgeharde PDMS schijf van de mal met behulp van een scheermesje. De zekering van de schijf naar een 1&#39;&#39;raam (met 8 x 2 mm-diameter van voorgeboorde gaten aan beide uiteinden van de kanalen) door plasma oxideren beide oppervlakken gedurende 30 seconden. De zekering van de ramen op de platte kant van de PDMS schijf (de kant zonder de kanalen). </li><li> Plaats een 2-inch lange flexibele fused silica capillaire buis door het gat elk glas venster tot aan het kanaal. Het inbrengen van een naald en vervolgens na met de capillaire kan dit proces vergemakkelijken. Sluit de glazen raam gaten met behulp van een snel uithardende siliconen gieten verbinding zoals Kwik-Cast. </li><li> Spoel de kanalen met ethanol en water, en een plasma-activeren van de cel, samen met een schone, 1-inch ronde quartz dekglas gedurende 30 seconden. We raden reinigen van deze dekglas met piranha *. De zekering van de dekglas aan de zijkant van de cel met de kanalen, het afdichten van de kamers. </li><li> Laat de gemonteerde cel om &#39;s nachts uitharden bij kamertemperatuur. </li></ol> * Piranha is een oplossing van H 2 O 2 en H 2 SO 4 in 1:2,5 proporties. Voor het reinigen van de dekglaasjes, dompel hen in piranha bij 90 ° C gedurende 20 minuten. 2 - Het activeren van de oppervlakte voor de molecule immobilisatie Voor nucleïnezuur studies, de eenvoudigste oppervlak immobilisatie regeling bestaat uit een eerste laag glas of kwarts dekglas met gebiotinyleerd bovine serum albumine (BSA) en vervolgens met streptavidine. Hierdoor kan de gebiotinyleerde monster worden geïmmobiliseerd met een hoge specificiteit voor dagen bij kamertemperatuur. <ol><li> Sluit de flexibele slang aan de haarvaten voor eenvoudige buffer injectie met een spuit en naald. </li><li> Injecteer een oplossing van 0,1 mg / ml gebiotinyleerd BSA in buffer A (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl, gefilterd met 0,02 micrometer filters) in het kanaal en incubeer gedurende tenminste 30 minuten. </li><li> Stroom 300-500 ul buffer A op een gratis gebiotinyleerd BSA te verwijderen uit het kanaal, zorg dat u eventuele luchtbellen in de kamer val. </li><li> Injecteer een oplossing van 0,1 mg / ml streptavidine in buffer A en incubeer gedurende 15 minuten. Herhaal dan Stap 3. </li><li> Stroming door een 3-5 pM oplossing van het gebiotinyleerde monster. Voer een oppervlakte scan om de dekking van fluorescerende moleculen te controleren. Indien nodig, verhoog de steekproef concentratie een betere dekking te krijgen. Incubeer gedurende 10 minuten en herhaal stap 3. </li></ol> De microfluïdische cel is gemonteerd op een gemotoriseerde xy podium waardoor grof (tot 25 mm) beweging met behulp van optisch gecodeerd DC-motoren, en fijn (1 nm) beweging met behulp van twee closed-loop piëzo-actuatoren (Physik Instrumente model M-014 of iets dergelijks). Dit kan zowel voor of na het activeren van de oppervlakte voor monster immobilisatie worden gedaan. 3 - Voorbereiden van de Imaging Buffer (IB) De IB bestaat uit een enzymatische zuurstof scavenging-systeem en een triplet quencher, zoals Trolox. Omdat de IB wordt doorgespoeld voortdurend &#39;s nachts, moet ten minste 10 ml worden voorbereid op voorhand. <ol><li> Bereid 10 ml 0,8% w / v D-glucose, ten minste 35 mM Tris-HCl pH 8,0 en 50 mM NaCl in gedeïoniseerd water. De hogere concentratie van de buffer is belangrijk om twee redenen: het oplossen van Trolox zal de oplossing verzuren, en de enzymatische reactie zal ook lager de pH van de oplossing in de tijd. Omdat deze oplossing heeft een lange houdbaarheid kan worden opgeslagen als een stamoplossing. </li><li> Los 5 mg van Trolox in de buffer bereid in stap 1 en door vortexen een paar minuten en dan schudden&gt; 10 min. Trolox is niet erg oplosbaar in water bij pH&gt; 7, dus wees niet te snel deze stap. Filtreer de oplossing met behulp van een 0,2 um filter en laat ontgassing in vacuum gedurende 10 minuten. </li><li> De voorbereiding van de &quot;gloxy&quot; enzymatische oplossing door het mengen van 60 ul water, 20 ul van 5X buffer A, 20 ul van catalase, 1 mg glucose-oxidase en 100 ul van 10 mg / ml BSA. Filtreer de oplossing met behulp van een 0,22 um filter centrifuge. </li><li> Meng de buffer van stap 2 met de &quot;gloxy&quot; oplossing uit stap 3 het vermijden van de vorming van luchtbellen. </li><li> Doorstroming van de IB via het kanaal met een constante snelheid van 5 pl / min met behulp van een mechanische pomp spuit met het debiet te controleren. Bubble argon gas in het IB reservoir tot atmosferische zuurstof te voorkomen dat opnieuw oplost in de buffer. </li></ol> Het oppervlak scannen, molecule lokalisatie en de verwerving van single molecule intensiteit sporen wordt bestuurd door een LabView programma dat geautomatiseerde gegevensverzameling een vergunningen. Het programma scant 20x20 um twee gebieden op 0,2 micrometer resolutie, met een snelheid van 0,1 micrometer / ms. De gegevens worden direct verwerkt de intensiteit van de gewogen locaties van alle pixels boven de achtergrond telt opbrengst. Zodra de geïmmobiliseerde moleculen worden gevonden, worden ze verplaatst een voor een in de confocale volume en de intensiteit van de donor en acceptor fluorofoor worden geboekt als een functie van de tijd totdat beide fluoroforen photobleach. Het podium is dan geprogrammeerd om te verhuizen naar een nieuwe oorsprong 100 um weg, en het scanproces wordt herhaald. 4 - representatieve resultaten Hieronder staan ​​een aantal beelden die de verzamelde microfluïdische cel voor oppervlakte-activatie en nadat ze gemonteerd op de microscoop klaar voor molecuul immobilisatie. Als het kanaal is succesvol geactiveerd, moet het oppervlak scans zijn vergelijkbaar met de scans hieronder afgebeeld met de emissie van de donor kleurstof (groen) en acceptor (rood) na directe donor excitatie. Deze moleculen worden verplaatst een voor een in het sonderen volume en de fluorescentie opgenomen na verloop van tijd totdat beide kleurstoffen photobleach, zoals in de single molecule sporen. Van sporen als deze kan men verkrijgen van de FRET efficiëntie, die informeert over de ogenblikkelijke donor-acceptor scheiding, die op zijn beurt wordt gebruikt om de structuur en de dynamica van moleculen van biologisch belang te verkennen. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig1tmb.jpg" alt="Figuur 1" border="0" /> Figuur 1: Microfluïdische cel met vier kanalen, elk met inlaat / uitlaat haarvaten. Gelieve <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig1.jpg">Klik hier</a> voor een grotere versie van figuur 1 te zien. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig2tmb.jpg" alt="Figuur 2" border="0" /> Figuur 2: Cel gemonteerd op de microscoop klaar voor metingen. Gelieve <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig2.jpg">Klik hier</a> voor een grotere versie van figuur 2 te zien. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig3tmb.jpg" alt="Figuur 3" border="0" /> Figuur 3: Instellingen voor sm-FRET metingen. Gelieve <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig3.jpg">Klik hier</a> voor een grotere versie van figuur 3 te zien. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig4tmb.jpg" alt="Figuur 4" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig5tmb.jpg" alt="Figuur 5" border="0" /> Figuren 4 en 5: Rode en groene kanaal van een scan van het oppervlak geïmmobiliseerde FRET moleculen blij met groene laser. Klik voor een grotere versie te zien van <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig4.jpg">figuur 4</a> , of <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig5.jpg">figuur 5</a> . <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig6tmb.jpg" alt="Figuur 6" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig7tmb.jpg" alt="Figuur 7" border="0" /> <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig8tmb.jpg" alt="Figuur 8" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig9tmb.jpg" alt="Figuur 9" border="0" /> Figuren 6, 7, 8 en 9: Intensiteit trajecten van de donor (groen) en acceptor (rood) fluoroforen gelabeld om een DNA-molecuul 8, 10, 16 en 18 baseparen van elkaar. Klik voor een grotere versie te zien van <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig6.jpg">figuur 6</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig7.jpg">figuur 7</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig8.jpg">figuur 8</a> , of <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig9.jpg">figuur 9</a> .

<ol><li>Selvin, P. R., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Techniques%2C+a+Laboratory+Manual%5BTitle%5D)+AND+%22CSHL+Press%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Techniques, a Laboratory Manual.</a> CSHL Press. , (2008).</li>
<li>Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+scanning+confocal+microscope+for+single+molecule+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Pys.+Letters%22%5BJournal%5D)">High-throughput scanning confocal microscope for single molecule analysis.</a> Applied Pys. Letters. , 84-87 (2004).</li>
<li>Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Fluorescence+resonance+energy+transfer+to+measure+distances+along+individual+DNA+molecules%3A+Corrections+due+to+nonideal+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Using Fluorescence resonance energy transfer to measure distances along individual DNA molecules: Corrections due to nonideal transfer.</a> J. Chem. Phys. 122, 61103-61105 (2004).</li>
<li>Echeverra, A., Aitken, C., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Oxygen+Scavenging+System+for+Improvement+of+Dye+Stability+in+Single-Molecule+Fluorescence+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments.</a> Biophysical Journal. 94, 1826-1835 (2008).</li>
<li>Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonblinking+and+long-lasting+single+molecule+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nonblinking and long-lasting single molecule fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).</li>
<li>Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+in+Surface-Tethered+Lipid+Vesicles+as+a+New+Tool+for+Single+Biomolecule+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy.</a> J. Phys. Chem. 105, 12165-12170 (2001).</li>
<li>Di Fiori, N., Meller, A. Article in preparation. , Forthcoming.</li>
</ol>

Hoewel de bovenstaande protocol is geoptimaliseerd voor ons eigen systeem en voor een specifieke keuze van kleurstoffen (TMR en ATTO647N), het is niet het enige bewezen methode. Onlangs is een alternatief zuurstof wegvangen bestaande uit protocatechuic zuur (PCA) / ​​protocatechuate-3 ,4-dioxygenase (PCD) laten zien dat de fotostabiliteit van bepaalde kleurstoffen vier te verhogen. Ook kunnen andere triplet-toestand quenchers, zoals β-mercapto-ethanol (BME) in plaats van Trolox worden gebruikt, hoewel deze misschien niet onderdrukken langdurig knipperen van sommige kleurstoffen, in het bijzonder Cy5 5. Hoewel de immobilisatie via biotine-streptavidine-gebiotinyleerde bovine serum albumine (BSA) is de beste keuze voor nucleïnezuren studies, is een polyethyleenglycol (PEG)-coating beter geschikt voor onderzoek van eiwitten, omdat het voorkomt dat niet-specifieke aanhechting 1. Bovendien kunnen sub-diffractie-beperkte grootte blaasjes worden gebruikt om de biomolecuul van belang in de gevallen waar het kan worden beïnvloed door oppervlakte-interacties 6 in te kapselen. In dit artikel hebben we gebruik gemaakt van een confocale opstelling uitgerust met siliconen lawine fotodiodes om de fluorescentie-intensiteit sporen te verwerven. Dit protocol werkt even goed met Total Internal Reflection fluorescentiemicroscopen (TIRF), uitgerust met CCD-camera&#39;s. Ongeacht de gebruikte microscopie, sm-FRET kunnen informeren over de ruimtelijke resoluties het naderen van de ångström wanneer de donor en acceptor signaal juist gecorrigeerd 7.

<table><tbody><tr><td>Gefuseerde silica capillairbuis</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP150375</td><td></td></tr><tr><td>Gefuseerde silica dekglasplaatje</td><td>Esco Products</td><td>R425000</td><td></td></tr><tr><td>Buisjes</td><td>Diba Industries</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotinylatie BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8549</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9085</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidine</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>0021122</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Elastomeer Kit</td><td>Dow Corning</td><td>3097366-1004</td><td>Siliconen elastomeer kit</td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Aldrich</td><td>238813</td><td></td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3155</td><td></td></tr><tr><td>Glucose-oxidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2133</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Kwik-Cast afdichtingsmiddel</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>Kwik-Cast</td><td>Siliconen gietcompound</td></tr></tbody></table>

geautomatiseerd systeem voor single molecule fluorescentie metingen van surface-geïmmobiliseerde biomoleculen

Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopie is op grote schaal gebruikt om de structuur en dynamiek van moleculen van biologische belang, zoals nucleïnezuren en eiwitten te bestuderen. Enkel molecuul FRET (sm-FRET) metingen op geïmmobiliseerd moleculen mogelijk lange opmerkingen van de systeem-effectief totdat beide kleurstoffen photobleach-wat resulteert in tijd-sporen die rapporteren over biomoleculaire dynamiek met een breed scala van tijdschalen van milliseconden tot minuten. Het vergemakkelijken van de overname van grote aantallen sporen voor statistische analyses, moet het proces worden geautomatiseerd en het monster milieu moeten strak worden geregeld over de hele meettijd (~ 12 uur). Dit wordt bereikt met behulp van een geautomatiseerde scanning confocale microscoop waarmee de ondervraging van duizenden enkele moleculen &#39;s nachts, en een microfluïdische cel die de gecontroleerde uitwisseling van buffer vergunningen, met beperkte zuurstofgehalte en zorgt voor een constante temperatuur gedurende de gehele meetperiode. Hier laten we zien hoe het microfluïdische apparaat samenstellen en hoe u het oppervlak voor DNA-immobilisatie te activeren. Dan leggen we uit hoe je een buffer te bereiden op de fotostabiliteit en levensduur van de fluoroforen te maximaliseren. Tot slot, laten we de stappen die betrokken zijn bij de voorbereiding van de setup voor de automatische acquisitie van tijdsopgeloste single molecule FRET sporen van DNA-moleculen.

In dit artikel beschrijven we hoe we krijgen FRET sporen van individuele DNA-moleculen geïmmobiliseerd op een oppervlak met behulp van een geautomatiseerde scanning confocale microscoop.

Geautomatiseerd systeem voor Single Molecule Fluorescentie metingen van Surface-geïmmobiliseerde biomoleculen

Fluorescentie-resonantie-energietransfer (FRET)-microscopie is op grote schaal gebruikt om de structuur en dynamiek van biologisch relevante moleculen te bestuderen, ...

Om de dynamiek van individuele moleculen over een langere periode te bestuderen, moeten de moleculen eerst in de ruimte worden gelokaliseerd. Dit doen we door ze te immobiliseren op het oppervlak van een microfluïdische cel. De procedure begint met de assemblage van de cel, die vier kamers bevat waarin de biomoleculen zullen worden gefixeerd.De kamers zijn via inlaat- en uitlaatcapillaren verbonden met de buitenkant. De cel wordt vervaardigd door een gestructureerde PDMS-schijf te versmelten met een kwartsdekglaasje. De geassembleerde cel wordt vervolgens op de fluorescentiemicroscoop gemonteerd en flexibele slangetjes worden op de capillairen aangesloten om een eenvoudige uitwisseling van oplossingen door de kamers mogelijk te maken; om het oppervlak eerst te activeren voor moleculaire immobilisatie wordt een oplossing van gebiotineerd BSA door een van de kanalen gestroomd.BSA zal absorberen aan de kamer. Voer vervolgens een streptavidine-oplossing over de oppervlakken, die op zijn beurt zal binden aan de biotine. Voer tot slot uw gebiotinyleerde oligonucleotide door, dat zal binden aan de streptavidine, waardoor het betreffende molecuul aan het oppervlak van het kwartsdikglas wordt verankerd.Een imagingbuffer, ontworpen om de stabiliteit van de levensduur en de intensiteit van de fluoroforen te maximaliseren, wordt gedurende de gehele acquisitieperiode met een constante snelheid door de kamer geleid. De geautomatiseerde opstelling scant verschillende secties van het oppervlak op moleculen die zowel donor- als acceptorfluoroforen bevatten, en verplaatst deze vervolgens één voor één naar het probeervolume om voor elk een tijdreeks van de fluorescentie-intensiteit te verkrijgen totdat beide fluoroforen fotobleken. Hallo, ik ben Nicholas Dfi van het laboratorium van professor Miller in de afdeling biomedische technologie aan de Boston University.Vandaag laten we u een procedure zien om single molecule F-sporen te verkrijgen van geïmmobiliseerde nucleïnezuren met behulp van een confocale opstelling. Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de dynamiek van nucleïnezuren en de interacties tussen nucleïnezuren en enzymen te bestuderen. Laten we beginnen.De microfluïdische cel wordt vervaardigd door een gestructureerde, twee millimeter dikke schijf van polydimethylsiloxaan (PDMS) te versmelten met een vers gereinigde kwarts dekglasplaat. Om de gestructureerde PDMS-schijf te maken, worden 10 delen silicone elastomeerbasis gemengd met één deel hardeningsmiddel; meng dit goed en ontgas het mengsel gedurende één uur in een vacuüm. Nadat de elastomeerbasis is ontgast, wordt deze voorzichtig in de mal voor de microfluïdische cel gegoten.Laat het elastomeermengsel twee uur lang uitharden op een warmteplaat bij 70 °C. Pel de PDMS-schijf na uitharding voorzichtig met een scheermesje van de mal. De PDMS-schijf bevat vier rechthoekige kamers van 30 µL.Versmelt de vlakke zijde van de PDMS-schijf, de zijde zonder de kanalen, op een glazen venster van één inch door beide oppervlakken gedurende 30 seconden plasma-oxideren. Het glazen venster bevat aan beide uiteinden van de kanalen acht gaatjes van twee millimeter die voorheen zijn geboord. Vervolgens wordt een flexibele capillairbuis van gesmolten silica met een lengte van twee inch door elk gat in het glazen venster ingevoegd.Voer hiervoor eerst een naald in en schuif vervolgens de capillaire buis door tot deze het kanaal bereikt. Afdichten van de gaten in het glazen venster met een snel uithardend siliconen gietcompound, zoals Quick Cast. Spoel de kanalen met ethanol en water nadat de cel en een vers met piranha-oplossing gereinigde cirkelvormige kwartsdraden van één inch gedurende 30 seconden plasma-geactiveerd zijn.Smelt het dekglas aan de zijkant van de cel die de kanalen bevat. De kamers zijn nu verzegeld. Laat de geassembleerde cel een nacht uitharden bij kamertemperatuur.Nadat het geassembleerde microfluïdische device een nacht heeft uitgehard, wordt het in een op maat gemaakte houder geplaatst en op de tafel van de confocale microscoop gemonteerd om te beginnen met het activeren van het oppervlak van de cel. Sluit voor molecuulimmobilisatie flexibele slangetjes aan op de capillairen van de cel om bufferinjectie met behulp van een spuit en een naald te vergemakkelijken. Injecteer nu een oplossing van 0,1 mg/mL gebiotineerd BSA in buffer A in het kanaal en incubeer dit gedurende ten minste 30 minuten.Na de incubatie van 30 minuten wordt er 300 tot 500 µL buffer A doorgevoerd om niet-geabsorbeerd gebiotinyleerd BSA uit het kanaal te verwijderen; let erbij op dat er geen luchtbellen in de kamer terechtkomen. Injecteer vervolgens een oplossing van 0,1 mg/mL STR din in buffer A en incubeer dit gedurende 15 minuten.Na de incubatiestroom van 15 minuten worden 300 tot 500 µL buffer A doorHet kanaal geleid om eventueel niet-geadsorbeerd strep din te verwijderen. Vermijd, zoals voorheen, het insluiten van luchtbellen in de kamer. Leid ten slotte een oplossing van drie tot vijf pM van het gebiotineerde monster door.Om de dekking van fluorescerende moleculen te controleren, wordt een oppervlaktescan uitgevoerd. Incubeer het gebiotinyleerde monster gedurende 10 minuten en herhaal de doorstroming van de buffer. Zoals eerder beschreven, bestaat de imaging-buffer of IB uit een enzymatisch zuurstofvrijmakend systeem en een triplet-quencher zoals trolox om de IB eerst op te lossen.Vijf milligram trol wordt opgelost in 10 milliliters glucosebuffer door een paar minuten te vortexen en minimaal 10 minuten te schudden. Filtreer de oplossing en laat deze 10 minuten ontgassen in vacuüm. Meng de TRO lock-oplossing voorzichtig met de Glocky-enzymatische oplossing, waarbij de vorming van luchtbellen wordt vermeden.Vul het reservoir met de IB-oplossing. Gebruik vervolgens een mechanische spuitpompe om de stroomsnelheid te regelen en laat de IB met een constante snelheid van 5 µL per minuut door het kanaal stromen; leid argon-gas in het IB-reservoir om te voorkomen dat atmosferische zuurstof in de buffer oplost. De oppervlaktescan, molecuul lokalisatie en acquisitie van intensiteitssporen van enkelvoudige moleculen worden aangestuurd door het LabVIEW-programma, dat gebieden van 20 bij 20 µm² scant met een resolutie van 0,2 µm en een snelheid van 0,1 µm per ms.De gegevens van de oppervlaktescan worden onmiddellijk verwerkt om de intensiteitsgewogen locaties van alle pixels boven de achtergrondtellingen te bepalen. Zodra de geïmmobiliseerde moleculen zijn gevonden, worden ze één voor één naar het confocale volume verplaatst en worden de intensiteiten van de donor- en acceptorfluorofoor geregistreerd als functie van de tijd totdat beide fluoroforen zijn gefotogebleekt. De tafel wordt vervolgens geprogrammeerd om naar een nieuw nulpunt te bewegen, 100 millimeter verderop, waarna het scanproces wordt herhaald.De geassembleerde MICROFLUID Excel wordt hier getoond. Dit zijn oppervlaktescans die individuele moleculen laten zien in de groene donor- en rode acceptorkanalen. Er worden enkele typische sporen van individuele moleculen getoond, waarbij de acceptorintensiteit in het rood en de donor in het groen is weergegeven.We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u single-molecule traces kunt verkrijgen van geïmmobiliseerde biomoleculen met behulp van een confocale opstelling. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om elke stap zorgvuldig uit te voeren en de tijd te nemen, aangezien dit een uitdagend experiment is. Dat is alles.Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

automated-system-for-single-molecule-fluorescence-measurements

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video laat zien experimenten met daarop volgende analyse van eiwit-eiwit interacties door het gebruik van micro-oppervlakken met een patroon. De aanpak biedt de mogelijkheid om eiwit interacties op te sporen in levende cellen en combineert een hoge doorvoer-mogelijkheden met de mogelijkheid te extraheren kwantitatieve informatie.

In-vivo detectie van eiwit-eiwit interacties op de Micro-oppervlakken met een patroon

Eiwit-eiwit-interacties worden in cellen met een ruimtelijke resolutie van nanometer gevisualiseerd door bimoleculaire fluorescentie-complementatie (BiFC) te combineren met fotogeactiveerde lokalisatiemicroscopie (PALM). Hier wordt het gebruik van BiFC-PALM beschreven voor het beeldvormen van Ras-Raf-interacties in U2OS-cellen voor het visualiseren van de nanoschalige clustervorming en diffusie van individuele Ras-Raf-complexen.

Fotogeactiveerde Localization Microscopie met Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC-PALM)

Hier wordt de bereiding van eiwit-gefunctionaliseerde planaire glas-ondersteunde lipide bilayers, de bepaling van eiwitmobiliteit binnen en de meting van eiwitdichtheden getoond. Een routekaart voor het bouwen van een ruisonderdrukte Total Internal Reflection microscoop wordt geschetst, die het mogelijk maakt om enkele bilayer-residente fluorochromen met hoge ruimtelijk-temporele resolutie te visualiseren.

Single Molecule Fluorescentie Microscopie op Ondersteunde Planar dubbellagen

We presenteren de opstelling en experimentele procedure om smFRET-gegevens te verkrijgen van grote donor-acceptor-netwerken met een TIRF-microscoop. De stapsgewijze analyse van deze metingen met de Bayesiaanse inferentiesoftware Fast-NPS levert hoog opgeloste structurele informatie op via de toepassing van aangepaste kleurstofmodellen.

Structurele Informatie van Single-molecule FRET experimenten met de Fast Nano-positioneringssysteem

Hier presenteren we een protocol om gegevens van de drie kleuren smFRET en haar analyse met een 3D ensemble verborgen Markov Model te verkrijgen. Met deze benadering kunnen wetenschappers kinetische informatie ophalen uit complexe eiwit systemen, met inbegrip van Allosterie of gecorreleerde interacties.

Met behulp van 3 Single-molecuul FRET te bestuderen de correlatie van eiwitinteractie

Hier presenteren we een protocol om te beoordelen van de labeling homogeniteit voor elke soort eiwit in een complexe eiwitSteekproef op het niveau van één molecuul.

Proteoom bestrijkende kwantificering van Labeling homogeniteit op het niveau van één molecuul

Dit artikel biedt stapsgewijze instructies voor het uitvoeren van volledig gecorrigeerde nauwkeurige FRET-metingen op individuele, vrij verspreidende biomoleculen met behulp van de open-source, goedkope smfBox, van inschakelen, via uitlijning en scherpstellen, tot gegevensverzameling en -analyse.

Nauwkeurige en nauwkeurige FRET-metingen met één molecuul uitvoeren met behulp van de Open-Source smfBox

Dit artikel presenteert een methode voor spatiotemporale analyse van mobiele, single-molecule Förster resonantie energieoverdracht (smFRET)-gebaseerde probes met behulp van widefield fluorescentiemicroscopie. De nieuw ontwikkelde softwaretoolkit maakt het mogelijk om smFRET-tijdsporen van bewegende sondes te bepalen, inclusief de juiste FRET-efficiëntie en de moleculaire posities, als functies van de tijd.

Geautomatiseerde tweedimensionale spatiotemporale analyse van mobiele fret-sondes met één molecuul

Hier wordt een protocol gepresenteerd om de binding, mobiliteit en assemblage van afzonderlijke moleculen op kunstmatige overvolle lipidemembranen uit te voeren en te analyseren met behulp van single-molecule total internal reflection fluorescence (smTIRF) microscopie.

Single-Molecule Diffusie en assemblage op polymeer-crowded lipide membranen

Hier presenteren we het protocol om de lokale flexibiliteit en dynamiek van biomoleculen te bestuderen met behulp van tijdopgeloste fluorescentie-anisotropie op het niveau van één molecuul in confocale microscopiemodus.

Tijdopgeloste fluorescentie-anisotropie van afzonderlijke moleculen voor het karakteriseren van lokale flexibiliteit in biomoleculen

Dit protocol beschrijft single-antibody labeling (SAL) om de nanoschaal ruimtelijke organisatie van plasmamembraaneiwitten op te lossen. Door cumulatieve antilichaam-epitoopinteracties op het niveau van één molecuul te benutten, brengt membraan SAL (mSAL) lokale epitoopverdelingen in kaart terwijl het tegelijkertijd het bindingsgedrag van antilichamen in de natuurlijke cellulaire omgeving vastlegt.

Single-molecule localisatiemicroscopie van membraaneiwitten met single-antibody labeling

Leer een geautomatiseerde methode voor single molecule FRET-metingen van oppervlak-geïmmobiliseerde DNA-moleculen met behulp van een confocale microscoop. Deze techniek maakt gedetailleerde analyse van nucleïnezuurdynamica en enzyminteracties mogelijk.

Geautomatiseerd systeem voor Single Molecule Fluorescentie metingen van Surface-geïmmobiliseerde biomoleculen

Meer video's verkennen