Name: Het gebruik van SC1 (Pluripotin) naar Mesc Zelfvernieuwing Ondersteuning bij de afwezigheid van LIF (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-18T17:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Leer het gebruik van SC1 (Pluripotin) om zelfvernieuwing van muizenembryonale stamcellen te ondersteunen zonder LIF. Deze kosteneffectieve methode biedt een waardevol alternatief voor stamcelonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen dr. Sheng Ding van het Scripps Research Institute en Dr Hongkui Deng van de Universiteit van Peking bedanken voor hun hulp en richting.

1. Voorbereiding van de MEF feeder platen <ol><li> Een dag voor het kweken van embryonale stamcellen, dooi een flacon van bestraalde E14.5 CF-1 MEF feeder-cellen (zie onze procedure voor het ES-cellen ontdooien). </li><li> Het bord van de MEF feeder-cellen bij een dichtheid van 10.000 cellen / putje in een 12 wells plaat. Incubeer de cellen gedurende de nacht bij 37 ° C en 5% CO 2. MEF cel media: DMEM aangevuld met 10% ES-PBS, 1X glutamine en 1X niet-essentiële aminozuren. </li></ol> 2. Onderhoud van Self-Vernieuwing van muis ES cellen <ol><li> Maak de ES-cellen met behulp van trypsine. Zaad van de cellen bij een dichtheid van 50.000 cellen / goed op de vooraf bereide MEF feeder platen in de groei media (Knockout MEM aangevuld met 15% KSR, 4 mM L-glutamine, 0,1 mM niet-essentiële aminozuren en 1X BME), aangevuld met SC1 op de gewenste concentratie (gebruikten we 100 nM, 300 nM, en 1 uM). We hebben ook nog een positieve controle goed, dat werd aangevuld met 1000 μ / ml LIF. Incubeer de cellen gedurende de nacht bij 37 ° C en 5% CO 2. </li><li> Cultuur de cellen bij 37 ° C en 5% CO 2 voor 3-4 dagen per passage. Refresh media om de 48 uur. </li><li> Passage cellen 1:10-tot-1:15 met trypsine om een ​​soortgelijke dichtheid als de eerste seeding dichtheid te behouden. Na vijf passages, kunnen de cellen worden onderzocht voor de expressie van de typische pluripotentie markers met behulp van immunocytochemie. </li></ol> 3. Immunocytochemische Onderzoek van pluripotentie Markers <ol><li> Was de cellen voorzichtig drie keer met PBS. </li><li> Fixeer de cellen met 500 pi van fixatief gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Was de cellen voorzichtig drie keer met PBS. </li><li> Blokkeer niet-specifieke binding met 500 ul blokkeerbuffer gedurende een uur bij kamertemperatuur. </li><li> Incubeer de cellen met 250 pi van de specifieke primaire antilichaam (wij gebruikten NANOG, Sox2, SSEA1, en Oct4 op de volgende verdunningen: 1:500, 1:2000, 1:500 en 1:500) </li><li> Was de cellen voorzichtig drie keer met PBS. </li><li> Incubeer de cellen met 250 ul van secundaire antilichaam voor twee uur bij kamertemperatuur, waardoor uit de buurt van licht (wij gebruikten ezel anti-muis-geconjugeerd met Alexa Fluor ® 555 bij 1:2000 en ezel anti-konijn geconjugeerd met Alexa Fluor ® 488 op 1 : 2000). </li><li> Was de cellen voorzichtig drie keer met PBS. </li><li> Voeg DAPI (eindconcentratie 1 ug / ml) tot de laatste wassen en incubeer 5 minuten kernen te visualiseren. </li><li> Analyseer de cellen onder een fluorescentiemicroscoop. </li></ol> 4. Representatieve resultaten: 1. Morfologie resultaten: Muis ES-cellen (ESC R1) werden gekweekt op MEF feeder cellen in de aanwezigheid van een van beide LIF of SC1 om zelf-vernieuwing te ondersteunen in een ongedifferentieerde staat. Na de tweede passage, kan onderscheid worden waargenomen in cellen zonder LIF of SC1 (negatieve controle) en na vijf passages in wezen geen ongedifferentieerde kolonies werden waargenomen. LIF (positieve controle) behandeld kolonies bleven in een ongedifferentieerde staat gedurende de 5 cel passages. Cellen behandeld met SC1 bij concentraties van 300 nM of 100 nM ook ongedifferentieerde bleef na vijf passages, maar de cellen behandeld met 1 uM SC1 ervaren celdood na de vierde passage. (Fig. 2 van de app note) Tabel 1 geeft een overzicht van de morfologische waarnemingen. 2. Expressie van pluripotentie Markers Muis ES-cellen gedurende vijf passages waren vastgesteld en onderzocht door middel van immunocytochemie voor SSEA1, Oct4, NANOG en Sox2. Marker uitdrukking was gelijk aan cellen behouden in LIF. (Fig 3 en 4 van app noot) <img src="/files/ftp_upload/1550/1550fig2a.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1: Morfologie vergelijking van de cellen die gehandhaafd in LIF of SC1. Geen verschil in morfologie waargenomen. <img src="/files/ftp_upload/1550/1550fig2c.jpg" alt="Figuur 2 en 3" /> Figuur 2 en Figuur 3: NANOG, SSEA1, Sox2 en Oct4 kleuring van ES-cellen onderhouden met SC1 of LIF (fig 4 van ca. noot). Cellen gehandhaafd in SC1 Toon vergelijkbaar pluripotentie marker expressie aan cellen behouden in LIF. Tabel 1 <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td></td><td> Negatieve controle </td><td> LIF positieve controle </td><td> SC1 1uM </td><td> SC1 300 nM </td><td> SC1 100 nM </td></tr><tr><td> 1e Passage </td><td> Normale ES-cel morfologie </td><td> Normale ES-cel morfologie </td><td> Normale ES-cel morfologie </td><td> Normale ES-cel morfologie </td><td> Normale ES-cel morfologie </td></tr><tr><td> 2e Passage </td><td> Sommige gedifferentieerde morfologie </td><td> Normaal ES celmorfologie </td><td> Normale ES-cel morfologie </td><td> Normale ES-cel morfologie </td><td> Normale ES-cel morfologie </td></tr><tr><td> 3e Passage </td><td> Meerderheid van de gedifferentieerde cellen </td><td> Normale ES-cel morfologie </td><td> Normale ES-cel morfologie </td><td> Normale ES-cel morfologie </td><td> Normale ES-cel morfologie </td></tr><tr><td> 4e Passage </td><td> Geen ESC kolonies </td><td> Normale ES-cel morfologie </td><td> Celdood waargenomen </td><td> Normale ES-cel morfologie </td><td> Normale ES-cel morfologie </td></tr><tr><td> 5e Passage </td><td> gedifferentieerd </td><td> Normale ES-cel morfologie </td><td> Celdood waargenomen </td><td> Normale ES-cel morfologie </td><td> Normale ES-cel morfologie </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Williams, R. L., Hilton, D. J., Pease, S., Willson, T. A., Stewart, C. L., Gearing, D. P., Wagner, E. F., Metcalf, D., Nicola, N. A., Gough, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+leukaemia+inhibitory+factor+maintains+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 336, 684-687 (1988).</li>
<li>Ying, Q. L., Wray, J., Nichols, J., Batlle-Morera, L., Doble, B., Woodgett, J., Cohen, P., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453, 519-523 (2008).</li>
<li>Chen, S., Do, J. T., Zhang, Q., Yao, S., Yan, F., Peters, E. C., Scholer, H. R., Schultz, P. G., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+of+embryonic+stem+cells+by+a+small+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acat.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Self-renewal of embryonic stem cells by a small molecule.</a> Proc. Natl. Acat. Sci. USA. 103, 17266-17271 (2006).</li>
</ol>

De auteurs van dit artikel zijn in dienst van Stemgent dat de reagentia en instrumenten gebruikt in dit artikel oplevert.

De kleine molecule SC1 kan worden gebruikt om zelf-vernieuwing te onderhouden met een ongedifferentieerde staat in de muis ES-cellen. Bij gebruik op een niet-geteste cellijn, echter, moet worden getitreerd tot de optimale concentratie te bepalen. Bijvoorbeeld, we getest drie concentraties op de muis ES-cellijn ESC R1. 100 nM en 300 nM waren de concentraties in staat om de muis ES cellen te ondersteunen, maar een 1 uM concentratie giftig. SC1 kan ook worden gebruikt onder feeder-vrije omstandigheden.

<table><tbody><tr><td>SC1</td><td>Stemgent</td><td>04-0011</td><td></td></tr><tr><td>LIF</td><td>EMD Millipore</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>SSEA-1 antilichaam</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>21702</td><td></td></tr><tr><td>Nanog antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab21603</td><td></td></tr><tr><td>Sox2 antilichaam</td><td>Chemicon International</td><td>Ab5603</td><td></td></tr><tr><td>Oct4 antilichaam</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-5279</td><td></td></tr></tbody></table>

het gebruik van sc1 (pluripotin) naar mesc zelfvernieuwing ondersteuning bij de afwezigheid van lif

The use of SC1 (Pluripotin) to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

Muis embryonale stamcellen (ES)-cellen zijn conventioneel gekweekt met Leukemie-remmende factor (LIF) om zelf-vernieuwing te behouden.<sup&gt; 1</sup&gt; Echter, LIF is duur en activering van de LIF/JAK/STAT3 pad is niet absoluut nodig is om de zelf-vernieuwing status te behouden.<sup&gt; 2</sup&gt; De SC1 kleine molecuul kan een economisch alternatief voor LIF worden. SC1 functies door dubbele remming van Ras-GAP en ERK1.<sup&gt; 3</sup&gt; Illustratie van het werkingsmechanisme is het een nuttig instrument om de fundamentele moleculaire mechanisme van zelf-vernieuwing te bestuderen. Hier laten we zien de procedure voor het kweken van muizen ES-cellen in de aanwezigheid van SC1 en laten zien dat ze in staat zijn om zelf-vernieuwing te behouden in de afwezigheid van LIF. Cellen gekweekt met SC1 toonde vergelijkbare morfologie in vergelijking met cellen die onderhouden met LIF. Beide tentoongesteld typische muis ES morfologie na vijf passages. Expressie van typische pluripotentie markers (Oct4, Sox2, NANOG en SSEA1) werd waargenomen na vijf passages in de aanwezigheid van SC1. Bovendien, SC1 veroorzaakte geen openlijke toxiciteit op de muis ES-cellen.

SC1 functies door dubbele remming van Ras-GAP en ERK1. We testten de functie van SC1 in de ondersteuning van muis ES-cel zelf-vernieuwing in de afwezigheid van LIF en liet zien dat SC1 in staat is om zelf-vernieuwing van de muis ES-celculturen te behouden.

Het gebruik van SC1 (Pluripotin) naar Mesc Zelfvernieuwing Ondersteuning bij de afwezigheid van LIF

embryonale stamcellen (ES-cellen) van muizen worden conventioneel gekweekt met Leukemia Inhibitory Factor (LIF) om zelfvernieuwing te behouden.1 Echter is LIF duur en ...

Hoi, ik ben Sarah NAU van het STEM Gen Laboratory in Boston. Vandaag laten we u een procedure zien voor het behouden van de zelfvernieuwing van embryonale stamcellen van muizen in aanwezigheid van het kleine molecuul C one. Embryonale stamcellen worden normaal gesproken gekweekt in aanwezigheid van leukemia inhibitory factor om de zelfvernieuwing te behouden.L is echter duur. Daarom bieden we hier een economisch alternatief: het kleine molecuul SC one. In het laatste deel van de video tonen we een vergelijking van de expressie van pluripotentiemarkers tussen cellen gekweekt in L en cellen gekweekt in SC one.Laten we beginnen. Ontdooi één dag voordat de embryonale stamcellen worden gekweekt een vial met bestraalde feeder-cellen. Zaai de feeder-cellen uit met een dichtheid van 10 000 cellen per well.Incubeer de cellen in een plaat met 12 putjes gedurende de nacht bij 37 °C met 5% CO2. Plateer de ES-cellen de volgende dag op de MEF-feederlaag door de cellen uit te zaaien met een dichtheid van 50.000 cellen per putje op de voorbereide feederplaten in groeimedium aangevuld met SC1 in de gewenste concentratie; wij hebben 100 nM, 300 nM en 1 µM gebruikt.Als controle voegen we een well toe die is aangevuld met 1000 µg/mL LIF. Incubeer de cellen vervolgens gedurende de nacht bij 37 °C en 5% CO₂.Vernieuw de volgende dag het medium voor continue kweek. Vernieuw het medium elke 48 uur en pas de cellen elke drie tot vier dagen in een verhouding van 1:10 over om een vergelijkbare dichtheid als de initiële uitzaaidichtheid te behouden. Na vijf passages kunnen we nu de expressie van typische pluripotentiemarkers controleren met behulp van immunochemie om de immunochemie van stamcellen te starten.Begin met het voorzichtig drie keer wassen van de cellen met PBS. Fixeer de cellen met 500 µL 4% paraformaldehyd gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Nadat de cellen nog drie keer zijn gewassen in PBS, wordt aspecifieke binding geblokkeerd met 500 µL blokkeringsbuffer gedurende één uur bij kamertemperatuur.Voeg vervolgens 250 µL van het primaire antilichaam toe aan de cellen en laat deze een nacht incuberen bij 4 °C. In dit experiment incuberen we met nano SOX2, SSEA1 en OCT4-antilichamen. Na een volgende reeks wasstappen worden de cellen gedurende twee uur bij kamertemperatuur geïncubeerd met 250 µL van het met fluorescente kleurstof geconjugeerde secundaire antilichaam, waarbij ze uit het licht worden gehouden; was de cellen voor de laatste maal en voeg DAPI toe aan de laatste wasstap tot een eindconcentratie van 1 µg/mL.Incubeer de cellen vervolgens vijf minuten om de kernen te kleuren. Analyseer de cellen tot slot onder een fluorescentiemicroscoop. Hier worden brightfield-beelden getoond van muis ES-cellen die zijn gekweekt op feeder-cellen in aanwezigheid van ofwel LIF of SC one om zelfvernieuwing in een ongedifferentieerde staat te behouden.Hier worden muis ES-cellen getoond die gedurende vijf passages zijn onderhouden. De cellen werden gefixeerd en via immunocytochemie onderzocht op SSEA one, OCT four, nano en SOX two. De marker-expressie van cellen die in C one werden onderhouden, was vergelijkbaar met die van cellen die in LIF werden onderhouden.We hebben zojuist gedemonstreerd hoe het kleine molecuul SC one kan worden gebruikt om zelfvernieuwing in embryonale stamcellen van muizen te behouden. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat SC one getitreerd moet worden om de optimale concentratie te bepalen voordat het op een niet-geteste cellijn wordt toegepast. Dat is alles.Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

the-use-sc1-pluripotin-to-support-mesc-self-renewal-absence

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We beschrijven een fluorescentie reporter test om snel te identificeren en karakteriseren genen die muis embryonale stamcellen onderhoud en zelfvernieuwing te reguleren.

Oct4GiP Reporter Assay van genen die muis embryonale stamcellen Onderhoud en Zelfvernieuwing Regel Studie

Muis embryonale fibroblasten kunnen met lage efficiëntie worden gereprogrammeerd tot geïnduceerde pluripotente stamcellen door de geforceerde expressie van transcriptiefactoren Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc. De zeldzame tussenproducten van de herprogrammeringsreactie worden via FACS geïsoleerd door middel van labeling met antilichamen tegen celoppervlaktemarkers Thy-1.2, Ssea-1 en Epcam.

Celoppervlaktemerker Mediated Zuivering van iPS Cell Intermediates van een Herprogrammeerbare muismodel

Hier presenteren we een kwantitatief en schaalbaar protocol voor het uitvoeren van gerichte kleine molecuulschermen voor kinase-regulatoren van de naïeve-primed pluripotente transitie.

Een eenvoudige methode om Kinases te identificeren die de embryonale stamcelpluripotency reguleren door middel van high-throughput inhibitor screening

Eiwitten vaak meerdere domeinen die verschillende cellulaire functies kunnen uitoefenen. Gene knock-outs (KO) beschouw dit niet als functionele diversiteit. Hier melden wij een recombinatie-gemedieerde cassette uitwisseling (RMCE) gebaseerde structuur-functie benadering KO embryonale stamcellen waarmee de moleculaire dissectie van verschillende functionele domeinen of varianten van een eiwit.

Structuur-functie studies in muis embryonale stamcellen gebruiken recombinase-gemedieerde cassette uitwisseling

Dit protocol beschrijft de herprogrammering van de primaire vruchtwater vloeistof en membraan mesenchymale stamcellen in geïnduceerde pluripotente stamcellen met gebruikmaking van een niet-integratie van episomal in volledig chemisch gedefinieerde voorwaarden. Procedures van extractie, cultuur, herprogrammering en karakterisering van de resulterende geïnduceerde pluripotente stamcellen door strenge methoden zijn gedetailleerd.

Herprogrammering van de primaire vruchtwater en membraan cellen pluripotent in Xeno-vrij voorwaarden

Wij beschreven twee chemische-gebaseerde protocollen voor het kweken van muis embryonale stamcellen in detail. Deze nieuwe methode maakt gebruik van synergetische mechanismen ter bevordering van Tet-gemedieerde oxidatie (door vitamine C) en onderdrukken van DOVO synthese van 5-methylcytosine (door PD0325901) om DNA hypomethylation en pluripotent van muis embryonale stamcellen te onderhouden.

Een alternatieve cultuur methode om Genomic Hypomethylation van muis embryonale stamcellen met MEK-remmer PD0325901 en vitamine C

Presenteren we een protocol voor snelle, efficiënte en bulk chemische terugkeer van conventionele lineage-primer menselijke pluripotente stamcellen (hPSC) in een epigenomically-stable naïef voor inplanting epiblast-achtige pluripotente staat. Deze methode resulteert in verminderde lineage-primer genexpressie en duidelijke verbetering gestuurde multilineage differentiatie over een breed repertoire van conventionele hPSC lijnen.

Chemische terugkeer van conventionele menselijke pluripotente stamcellen naar een naïef-achtige toestand met verbeterde Multilineage differentiatie potentie

Hier is een protocol om genetische interacties te identificeren door middel van een verhoogde kopie nummer suppressor scherm in Saccharomyces cerevisiae. Deze methode stelt onderzoekers in staat om te identificeren, klonen, en testen suppressors in kortstondige gist mutanten. We testen het effect van de toename van het kopieeraantal van SIR2 op de levensduur in een autofagie null mutant.

Een suppressor scherm voor de karakterisering van genetische links reguleren chronologische levensduur in Saccharomyces cerevisiae

We presenteren hier een methode die het gebruik van chemische epigenetische wissing combineert met mechanosensing-gerelateerde signalen om efficiënt pluripotente cellen van zoogdieren te genereren, zonder de noodzaak van gentransfectie of retrovirale vectoren. Deze strategie is daarom veelbelovend voor translationele geneeskunde en vertegenwoordigt een opmerkelijke vooruitgang in stamcelorganoïde technologie.

Een strategie in twee stappen die epigenetische modificatie en biomechanische signalen combineert om pluripotente cellen van zoogdieren te genereren

De Protease Fluorescent Detection Kit is ontworpen voor de meting van de protease-activiteit met behulp van fluorometrie. Het is ook geschikt voor de detectie van sporen van protease besmetting. De methode is gebaseerd op de proteolytische hydroysis van een eigen formulering van een FITC-gelabelde caseïne substraat.

Gebruik van de Protease Fluorescerende Detection Kit om Protease activiteit te bepalen

Leer het gebruik van SC1 (Pluripotin) om zelfvernieuwing van muizenembryonale stamcellen te ondersteunen zonder LIF. Deze kosteneffectieve methode biedt een waardevol alternatief voor stamcelonderzoek.

Het gebruik van SC1 (Pluripotin) naar Mesc Zelfvernieuwing Ondersteuning bij de afwezigheid van LIF

Meer video's verkennen