Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen van menselijke fibroblasten herprogrammeren met de Stemgent Human TF lentivirus Set
December 8th, 2009
Tonen we het protocol voor het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke somatische cellen met behulp van lentivirus-gemedieerde levering van de menselijke factoren Oct4, Sox2, NANOG, en Lin28. Pluripotentie werd bevestigd door morfologie en de aanwezigheid van embryonale stamcellen (ES) cel-specifieke merkers.
Hallo, mijn naam is Brad Hamilton. Ik ben een wetenschapper hier in de afdeling onderzoek en ontwikkeling hier bij STEM Gen. Vandaag laten we je een procedure zien voor het herprogrammeren van menselijke fibroblasten met behulp van door lentivirus geleverde herprogrammeringsfactoren.
Deze procedure kan worden gebruikt om zowel IPS-cellen te genereren als om het herprogrammeringsproces te bestuderen. IPS-cellen lijken qua morfologie, proliferatie en het vermogen om te differentiëren en naar alle weefseltypen van het lichaam op ES-cellen. Menselijke IPS-cellen hebben een duidelijk voordeel ten opzichte van ES-cellen omdat ze belangrijke eigenschappen van ES-cellen vertonen zonder het ethische dilemma van het vernietigen van een embryo om de cellen te verkrijgen.
De generatie van patiëntspecifieke IPS-cellen omzeilt een belangrijke hindernis voor gepersonaliseerde regeneratieve geneeskunde therapieën door de mogelijkheid van immuunafwijzing van niet-autologe getransplanteerde cellen te elimineren. Dus laten we beginnen. Op verschillende punten in dit protocol vervang je het medium van de zich ontwikkelende IPSC of geïnduceerde pluripotente stamcellen met met geconditioneerd medium.
Het bereiden van dit medium duurt zes dagen. Begin dus minimaal een week voordat je je experiment wilt beginnen. Om te beginnen zaai je elke put van een zes.
Putten plaat met twee keer 10 tot de vijfde cf een met geconditioneerd medium. Meth feeder cellen in twee milliliters met geconditioneerd groeimedium. Incubeer overnacht bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. De volgende dag verander je het medium naar menselijk E-S-I-P-S celkweekmedium.
Incubeer overnacht bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Verzamel het supernatant en vervang het elke 24 uur gedurende vier dagen door vers medium. Filtreer het supernatant door een 0,22 micrometer filter.
Suppleer het verzamelde supernatant met 15 nanogram per milliliter van BFGF basis fibroblast groeifactor. Je zult ongeveer 16 milliliters met geconditioneerd medium eindigen, bewaar elk dag verzamelde supernatant apart bij vier graden SIUs. Meth geconditioneerd medium kan worden bewaard gedurende één tot twee weken bij vier graden Celsius of gedurende verschillende maanden bij min 20 graden Celsius.
Nu je hebt verzekerd dat je met geconditioneerd medium klaar zal zijn wanneer je het nodig hebt, laten we het hebben over het voorbereiden van de cellen. De eerste taak bij het genereren van IPSC is om lentivirussen te gebruiken om menselijke voorhuidcellen of BJ-cellen te transduceren met vier transcriptiekenmerken van stamcellen. Om voor te bereiden zaai je BJ-cellen op een dichtheid van een keer 10 tot de vijfde cellen per put van een zesputtenplaat en kweek ze.
De cellen in twee milliliters groeimedium overnacht bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide op dezelfde dag. Begin met het voorbereiden van met gecoate plaatjes door twee milliliters van 0,1% gelatine verdund in water toe te voegen aan een zesputtenplaat en overnacht in te kweken bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. De gelatine coat de putten en dient als matrix voor deze.
Nu zijn de BJ-cellen klaar voor lentivirale transductie om het virus voor transductie voor te bereiden. Suppleer twee milliliters vers medium met zes microgram per milliliter van polybrein en vier lentivirussen die elk een van de menselijke transcriptiefactoren uitdrukken. T vier, SO twee nanog en lin 28, zodat elk op dezelfde multipliciteit van infectie of MOI zit.
Deze lentivirussen zijn allemaal opgenomen in de menselijke herprogrammeringsfactor lentivirus set. Om de transductie uit te voeren, vervang je eenvoudigweg het BJ-celgroeimedium door het medium dat het virus bevat. Schud voorzichtig de plaat zodat het medium gelijkmatig de bodem bedekt.
Incubeer overnacht bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide op dezelfde dag. Verwijder een flesje van cf een met gecoate feeder cellen uit vloeibare stikstof en ontdooi het. Verwijder de gelatine oplossing van de met gecoate feeder plaatjes, die nu gelatine gecoat zijn om elk.
Put toe te voegen van 0,2 keer 10 tot de vijfde cellen in twee milliliters met gecoat groeimedium. Incubeer de MES overnacht bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. De volgende dag de BJ-cellen losmaken met 0,05% trypsine EDTA en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 200 Gs.
Na centrifugatie aspireer je het supernatant en suspendeer je de cellen in groeimedium. Verwijder het medium van de met gecoate feeder plaat en voeg twee milliliters per put van de BJ-cel suspensie toe. De BJ-cel concentratie moet ongeveer vijf keer 10 tot de vierde cellen per put zijn.
Incubeer overnacht bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. 24 uur na het rekken van de BJ-cellen op de met gecoate feeder plaat vervang je het medium door menselijk E-S-I-P-S dat is embryonaal stam of geïnduceerde pluripotente stamcelkweekmedium. Vervolg met het verversen van het medium elke 24 uur gedurende zeven dagen.
Op dag zeven vervang je het ES-celkweekmedium door twee milliliters met gecoat medium. De met gecoate feeder cellen hebben de oplosbare factoren geleverd die nodig zijn om IPS-cellen te laten groeien. Maar nu moeten we meer van deze factoren toevoegen om de cultuur gezond te houden.
Met gecoat medium bevat alle oplosbare factoren die worden uitgescheiden door met gecoat feeder cellen. Incubeer overnacht bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Selecteer door de microscoop een celkolonie. Onderscheiden door een kleine compacte koepelvormige uiterlijk in een verse 24-wel plate die je 24 uur eerder hebt voorgekookt met ccf een met gecoat feeder cellen. Rekken de geselecteerde kolonie in menselijk E-S-I-P-S kweekmedium.
Medium gesupplementeerd met 10 micromolar stammolecuul Y 2 7 6 3 2. Een afhankelijke kinase remmer. Verander het kweekmedium zonder supplementering met stammolecuul Y 2 7 6 3 2 elke 24 uur gedurende de eerste zeven dagen.
Na zeven dagen verander je medium naar met gecoat. Voortzetting van de cellen tot ze typische menselijke ES-celmorfologie vertonen. Zoek naar kleine, compacte koepel
Overzicht
Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol voor het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) uit humane fibroblasten met behulp van lentivirale vectoren. Het proces omvat de levering van belangrijke transcriptiefactoren, en de resulterende pluripotente cellen worden gekenmerkt door hun morfologie en specifieke markers.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Stamceldonderzoek
- Celreprogrammering
- Regeneratieve geneeskunde
Achtergrond
- Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) delen eigenschappen met embryonale stamcellen (ESC's).
- iPSC's kunnen worden gegenereerd uit somatische cellen zonder ethische bezwaren geassocieerd met ESC's.
- Patiëntspecifieke iPSC's kunnen gepersonaliseerde geneeskunde verbeteren door het risico op immuunafstoting te verminderen.
- Het protocol maakt gebruik van lentivirale vectoren om reprogrammeringsfactoren te introduceren.
Doel van het onderzoek
- Om een betrouwbare methode te demonstreren voor het genereren van iPSC's uit humane fibroblasten.
- Om inzicht te geven in het reprogrammeringsproces en de toepassingen ervan in de regeneratieve geneeskunde.
- Om de pluripotentie van gegenereerde cellen te bevestigen door middel van morfologische en moleculaire karakterisering.
Gebruikte methoden
- Bereiding van met voorwaardelijke medium voor iPSC-kweek.
- Lentivirale transductie van humane voorhuidschilfers met reprogrammeringsfactoren.
- Kweek en onderhoud van iPSC's onder specifieke omstandigheden.
- Karakterisering van pluripotentiemarkers in de afgeleide celkolonies.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle generatie van iPSC's met een morfologie vergelijkbaar met ESC's.
- Expressie van pluripotentiemarkers bevestigd in de afgeleide kolonies.
- Protocol maakt efficiënte productie van patiëntspecifieke iPSC's mogelijk.
- Aangetoond potentieel voor gebruik in gepersonaliseerde regeneratieve therapieën.
Conclusies
- Het protocol genereert effectief iPSC's uit humane fibroblasten.
- iPSC's vertonen belangrijke kenmerken van pluripotentie, waardoor ze waardevol zijn voor onderzoek en therapie.
- Deze methode biedt een basis voor toekomstige studies in de regeneratieve geneeskunde.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Generation of patient-specific induced pluripotent stem cells (iPSCs) from human fibroblasts enables disease modeling and target validation without ethical constraints of embryonic stem cells. This approach supports mechanistic de-risking in early discovery by providing a renewable, genetically matched human cell system for pathway interrogation and phenotypic screening. The lentiviral delivery of defined transcription factors offers a scalable, reproducible method to produce iPSCs for downstream assay development and preclinical evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in a human genetic context using iPSCs derived from patient fibroblasts.
- Operational Value: Provides a renewable source of pluripotent cells for consistent target engagement and pathway modulation studies.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by confirming target relevance in a disease-relevant human system prior to lead identification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized iPSC-derived cells suitable for assay preparation and compound screening workflows.
- Operational Value: Enables production of uniform cell colonies with defined morphology and marker expression for reproducible assay performance.
- Scalability: Lentiviral transduction allows for consistent iPSC generation across multiple wells and plates, supporting medium-to-high throughput screening preparation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Patient-specific iPSCs bridge discovery and preclinical validation by maintaining genetic fidelity to the donor.
- Mechanistic De-risking: Expression of pluripotency markers (TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4, Oct4, Sox2, Nanog) confirms cellular identity, reducing ambiguity in downstream differentiation and toxicity studies.
- Predictive Confidence: Morphological and molecular characterization of iPSC colonies enables go/no-go decisions based on pluripotency fidelity before preclinical investment.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, providing a human-relevant system for mechanistic insight and assay readiness.
- Discovery Biology: Lentiviral reprogramming supports hypothesis testing by generating iPSCs that reflect patient-specific genetics for target validation.
- Screening: Produces conditioned medium and feeder-independent iPSC colonies suitable for assay standardization and compound testing.
- Analytics: Enables quantification of pluripotency via marker expression (alkaline phosphatase, surface and nuclear markers) to assess reprogramming efficiency and consistency.
- Translational Research: Patient-derived iPSCs support continuity into preclinical models by preserving genetic background for disease-relevant differentiation.
- Enterprise Reuse: The Stemgent Human TF Lentivirus Set provides a reusable platform for iPSC generation across multiple projects and cell lines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through confirmed pluripotency and reduction of mechanistic ambiguity in human cells.
- Operational Value: Standardization of iPSC production via lentiviral transduction and defined culture conditions (meth conditioned medium, Y-27632).
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions via early biological de-risking, reducing late-stage failure risk in regenerative medicine programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets using patient-specific iPSC models that predict clinical translatability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in viral transduction, stem cell culture, and immunofluorescence characterization.
- Dependent on lentiviral vector infrastructure and biosafety protocols for handling reprogramming factors.
- Necessitates standardized feeder cell preparation and conditioned medium production for consistent iPSC maintenance.
- Adaptation to alternative fibroblast sources may require optimization of transduction efficiency and selection conditions.
- Practical limitations include variability in reprogramming efficiency based on cell passage, donor variability, and MOI titration needs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
0:09
Introduction
1:05
Preparing Mouse Embryonic Fibroblast (MEF) Conditioned Medium
2:39
Transducing Human-Foreskin-Fibroblast (BJ) Cells with Stem-Cell-Specific Transcription Factors
6:33
Selecting and Passaging Induced Pluripotent Stem Cell Colonies
9:43
Representative Results: Induced Pluripotent Stem Cell Colonies Morphologically Resemble Stem-Cells and Express Markers of Pluripotency
7:33
Staining Resulting Colonies for Markers of Pluripotency
11:07
Conclusion
