Invriezen en ontdooien van menselijke embryonale stamcellen
24 december 2009
Sinds James Thomson et al. ontwikkelde een techniek in 1998 te isoleren en HES groeien in de cultuur, hebben vriescellen voor later gebruik en ontdooien en uitbreiden van cellen van een ingevroren voorraad belangrijk geworden procedures uitgevoerd in routine hES celkweek. Omdat hES-cellen zijn zeer gevoelig voor de stress van het invriezen en ontdooien, speciale aandacht genomen. Hier laten we zien de juiste techniek voor het snel ontdooien van hES cellen van vloeibare stikstof voorraden, plating ze op de muis embryonale feeder-cellen, en langzaam invriezen voor langdurige opslag.
Hoi, ik ben Leah Kent van STEM Gen. Vandaag gaan we laten zien hoe u menselijke embryonale stamcellen ontdooit en invriest. Laten we beginnen.
Om menselijke embryonale stamcellen te ontdooien, wordt een cryovial uit vloeibare stikstof gehaald en snel ontdooid. In een waterbad van 37 °C wordt de celsuspensie vanuit het cryovial overgebracht naar een conische buis, verdund met menselijk ES-celcultuurmedium en gecentrifugeerd. Om een klein celpellet te vormen, wordt het supernatant vervolgens verwijderd en wordt het celpellet in de buis resuspendeerd met vers menselijk ES-celcultuurmedium voordat het wordt uitgeplaat op één well van een six-well celkweekplaat die vooraf is geprepareerd met een bestraalde meth-feederlaag.
Eén dag voorafgaand aan het ontdooien van menselijke ES-cellen wordt een feederlaag van bestraalde embryonale muis fibroblasten geplaatst in een mediumcultuur. Medium in één putje van een met gelatine gecoate six-well tissue culture plate. Incubeer de plaat overnight bij 37 °C en 5% CO2.
Zorg ervoor dat alle benodigde apparatuur en reagentia gereedstaan om een efficiënte en succesvolle ontdooiing te garanderen. Voordat de menselijke ESL uit de vloeibare stikstof wordt gehaald: gebruik een metalen pincet om een cryovial met menselijke E ESL uit de opslagtank met vloeibare stikstof te verwijderen.
Rol het vial gedurende drie tot vijf seconden tussen met handschoenen beklede handen. Verwijder de rijp door de informatie op het etiket van het vial met een metalen pincet af te krabben. Dompel het vial onder in een waterbad van 37 °C.
Wrijf het flaconnetje voorzichtig heen en weer en observeer de voortgang van het ontdooien regelmatig maar kort door het flaconnetje tegen het licht te houden om de grootte van het ijskristal te bepalen. Dompel de dop van het flaconnetje niet onder in het waterbad, omdat dit de cellen zou kunnen contamineren.
Wanneer er slechts een klein ijskristal overblijft, dompel het vial in ethanol om het te steriliseren in een steriele biologische veiligheidskabinet en breng de inhoud van het cryovial direct over naar de bodem van een conische buis van 15 milliliter. Voeg langzaam vier milliliter humaan ES-celkweekmedium toe aan de buis.
Schud de buis voorzichtig heen en weer om de cellen continu te mengen terwijl het nieuwe medium aan de buis wordt toegevoegd. Centrifugeer de menselijke E es-cellen gedurende vijf minuten bij 200 Gs terwijl de cellen in de centrifuge zitten. Haal de eerder geprepareerde meth-feederplaat uit de incubator van 37 °C en label deze met de juiste menselijke ESL-informatie, zoals cellijn, passagenummer en ontdooidatum.
Aspireer het kweekmedium van de MEF en voeg één milliliter PBS toe aan de well. Breng de gepelletteerde humane E ESL terug naar de biologische veiligheidskabinet en aspireer voorzichtig het supernatant. Pas op dat u de celpellet niet aspireert, maar verwijder zoveel mogelijk supernatant, aangezien deze oplossing DMSO uit het vriesmedium bevat.Resus.
Resuspendeer het pellet zeer voorzichtig door 2,5 milliliter humaan ESL-kweekmedium toe te voegen. Gebruik een glazen pipette van vijf milliliter en aspireer, door drie tot vier keer te pipetteren, de PBS uit de MEF-feeder-well. Voeg vervolgens langzaam alle 2,5 milliliter van de humane ES-cel-suspensie toe aan de voorbereide well van de zes-well plaat.
Plaats de plaat in de incubator bij 37 °C en schuif de plaat voorzichtig van voor naar achter en van links naar rechts om de cellen gelijkmatig over de well te verspreiden. Dit voorkomt dat de kolonies zich in het midden concentreren. Draai de plaat niet in een cirkelvormige beweging.
Laat de cellen de volgende dag na het ontdooien gedurende de nacht hechten bij 37 °C en 5% carbon dioxide. Verwijder het medium samen met eventuele drijvende cellen en voeg 2,5 milliliters vers human ES cell culture medium toe aan de well.
Incubeer de platen gedurende de nacht bij 37 °C en 5% CO2 en zet de cultuur voort tot de kolonies klaar zijn om over te zaaien. Het protocol voor het invriezen van humane ES-cellen begint met gezonde, middelgrote humane ES-celkolonies die zijn gekweekt op een plaat met zes putjes. Na incubatie van de cultuur met collagenase IV-enzym worden de kolonies afgeschraapt met een glazen pipet van 5 mL, opgevangen in een conische buis en gecentrifugeerd om een los cellpellet te vormen.
Nadat het supernatant is afgezogen, wordt de celpellet geresuspendeerd. Eerst met menselijk ES-celcultuurmedium en vervolgens verdund met twee x cryopreservatie-medium. De cellen worden gelijkmatig verdeeld in aliquots van één milliliter en ingevroren in cryovials.
Terwijl de cellen in de centrifuge zitten, labelt u de cryovials in de veiligheidskabinet met het passagesnummer van de cellijn en de vriesdatum. De gebruikelijke dichtheid voor het invriezen van humane E es-cellen is één well cellen uit een zes-well plaat per cryovial. Wanneer de humane E ESL zijn gecentrifugeerd, brengt u de buis terug naar het biologische veiligheidskabinet.
Aspireer het supernatant uit de buis. Wees voorzichtig om de losjes samengepakte celpellet niet te verstoren. Resuspendeer de celpellet met de juiste hoeveelheid menselijke ESL-kweekmedium.
Medium 0,5 milliliters van menselijke ESL-kweekmedium per cryovial. Pipetteer zeer voorzichtig, aangezien menselijke E es-cellen beter herstellen wanneer ze worden ingevroren in relatief grote koloniestukken; voeg langzaam, terwijl de buis voorzichtig wordt geschud, de juiste hoeveelheid twee x menselijk E es-celvriesmedium toe aan de cellen.
Zodra het invriesmedium is toegevoegd en door zeer voorzichtig één tot twee keer kortstondig te pipetteren is gemengd, wordt er één milliliter van de celsuspensie aan elk cryovial toegevoegd. Plaats de vials in een isopropanol-invriescontainer en zet deze gedurende de nacht in een vriezer van -80 °C. De cellen zullen in de isopropanol-invriescontainer met een snelheid van 1 °C per minuut invriezen. Op de volgende dag.
Breng de bevroren vials snel over naar een opslagtank met vloeibare stikstof met behulp van een metalen pincet. Op de eerste dag nadat menselijke ES-cellen zijn ontdooid, kunnen de kleine kolonies transparant lijken en moeilijk zichtbaar zijn onder de microscoop. Aangezien menselijke ES-cellen net ontdooid zijn, hebben ze de neiging om vrij langzaam te prolifereren.
Het kan een paar dagen in cultuur duren voordat ze verschijnen als gevestigde kolonies. We hebben u zojuist laten zien hoe u menselijke embryonale stamcelculturen ontdooit en invriest. Dat is alles.
Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.
Overzicht
Dit artikel demonstreert de juiste technieken voor het ontdooien en invriezen van humane embryonale stamcellen (hES-cellen). Er wordt nadruk gelegd op het belang van zorgvuldige hantering tijdens deze processen om de levensvatbaarheid van de cellen en een succesvolle kweek te waarborgen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Celbiologie
- Stamcelonderzoek
- Celkweektechnieken
Achtergrond
- Menselijke embryonale stamcellen (hES) zijn gevoelig voor stress door invriezen en ontdooien.
- Juiste technieken zijn cruciaal voor het behoud van de celviabiliteit.
- Ontdooi- en invriesprocedures zijn routinehandelingen in hES-celkweek.
- Deze technieken maken langdurige opslag en later gebruik van hES-cellen mogelijk.
Doel van de studie
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor het ontdooien van hES-cellen uit vloeibare stikstofvoorraden.
- Om het vriesproces voor langdurige opslag van hES-cellen te schetsen.
- Om ervoor te zorgen dat onderzoekers hES-cellen efficiënt kunnen hanteren zonder hun levensvatbaarheid in gevaar te brengen.
Gebruikte methoden
- Het ontdooien van hES-cellen in een waterbad van 37°C.
- Centrifugatie om een celpellet te vormen en resuspensie in cultuurmedium.
- Het uitplaten van cellen op een feederlaag van bestraalde embryonale muis fibroblasten.
- Het invriezen van cellen in cryovials met een gecontroleerde koelsnelheid in een isopropanolcontainer.
Belangrijkste resultaten
- Succesvol ontdooien en uitplaten van hES-cellen leidde tot levensvatbare kolonies.
- Correcte vriestechnieken behielden de celintegriteit voor toekomstig gebruik.
- De cellen vertoonden een trage proliferatie na het ontdooien, wat zorgvuldige monitoring vereiste.
- Er werden gedetailleerde protocollen opgesteld voor zowel de ontdooi- als de vriesprocessen.
Conclusies
- Naleving van de beschreven protocollen waarborgt een hoge levensvatbaarheid van hES-cellen.
- Zorgvuldige behandeling tijdens het ontdooien en invriezen is essentieel voor een succesvolle celkweek.
- Deze technieken zijn van vitaal belang voor onderzoekers die werken met hES-cellen.
Veelgestelde Vragen
Relevantie voor de Industrie
Betrouwbare cryopreservatie en herstel van menselijke embryonale stamcellen vormen de basis voor het onderhoud van pluripotente celbanken in workflows voor regeneratieve geneeskunde en ziektemodellering. Een correcte techniek minimaliseert het verlies aan levensvatbaarheid tijdens vries-dooi-cycli, wat bijdraagt aan een consistente experimentele reproduceerbaarheid en uitval in vroege stadia van targetvalidatie vermindert. Deze procedures maken langetermijnopslag en toegang op aanvraag tot genetisch stabiele hES-cellijnen mogelijk voor downstream screening en mechanistische studies.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Waarborgt de beschikbaarheid van genetisch gekarakteriseerde hES-cellen voor het onderzoek naar ziekterelevante pathways en de functie van therapeutische targets.
- Operationele waarde: Vermindert de noodzaak voor continue kweek, waardoor het risico op contaminatie en de arbeidslast bij het onderhoud van stamcellen worden verlaagd.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert gestandaardiseerd, levensvatbaar startmateriaal voor assay-kwalificatie en compound-screening in pluripotente celgebaseerde modellen.
- Operationele waarde: Maakt batch-tot-batch consistentie in celbereidheid mogelijk, wat de reproduceerbaarheid van assays over verschillende screeningcampagnes verbetert.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt de generatie van gedifferentieerd nageslacht uit ontdooide hES-cellen voor ziektemodellering en preklinisch onderzoek naar werkzaamheid.
- Operationele waarde: Faciliteert de schaalbare expansie van clonale lijnen voor toxicologische studies en veiligheidsfarmacologisch onderzoek.
Integratie van pipeline en workflow
Cryopreservatie integreert in het ontdekkingscontinuüm door het mogelijk maken van het banken van cellijnen tussen de fasen van targetvalidatie, assayontwikkeling en preklinische evaluatie, waardoor de genetische integriteit voor longitudinale studies behouden blijft.
- Ontdekkingsbiologie: Onderhoudt hES-cellijnen voor hypothesetoetsing in studies naar pluripotente differentiatie en padmodulatie.
- Screening: Waarborgt een consistente celviabiliteit en plating-efficiëntie voor betrouwbare screening van compound-bibliotheken.
- Analytiek: Genereert kwantificeerbare resultaten via hechtings-efficiëntie en kolonievorming na ontdooiing als viabiliteitsmetrieken.
- Translationeel onderzoek: Maakt de productie van gedifferentieerde cellen uit gebankte hES-lijnen mogelijk voor de generatie van preklinische modellen.
- Bedrijfbrede herbruikbaarheid: Vestigt een herbruikbare infrastructuur voor cellenbanken die toepasbaar is over meerdere projecten en therapeutische gebieden.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid in celgebaseerde assays door geminimaliseerde genetische drift en verlies van levensvatbaarheid.
- Operationele waarde: Een gestandaardiseerd, schaalbaar cryopreservatieprotocol vermindert de variabiliteit in celhandling tussen verschillende locaties.
- Strategische waarde: Verlaagt het risico op verlies van cellijnen, wat zorgt voor ononderbroken projecttijdlijnen en kapitaalefficiëntie.
- Impact op de portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk door toegang te garanderen tot gevalideerde hES-lijnen voor go/no-go-beslissingen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in steriele technieken en het onderhoud van stamcelculturen.
- Afhankelijk van toegang tot vloeibare stikstofopslag, 37°C waterbaden, centrifuges en biologische veiligheidskasten.
- Vereist gestandaardiseerde etikettering en documentatie voor traceerbaarheid over celpassages en vriesdata.
- Overwegingen voor adaptatie omvatten feeder-vrije systemen of gedefinieerde matrices, hoewel het protocol uitgaat van feederlagen van muis embryonale fibroblasten.
- Praktische beperkingen omvatten een vertraging in proliferatie na het ontdooien en gevoeligheid voor snelle temperatuurschommelingen tijdens de hantering.
