Name: Methoden voor de Studie van de zebravis bovenkaak Barbel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-23T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Leer chirurgische methoden voor het bestuderen van regeneratie in de zebravis bovenkaak barbel. Dit protocol toont amputatie, weefselpreparatie en histologische analyse voor ontwikkelingsbiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze methoden zijn ontwikkeld door EEL tijdens een onderzoek achter in het lab van JT ondersteuning werd verleend door de DePaul University Research Council en een NIH / NIDCR R01 toe te kennen aan JT (DE016678). Wij dankbaar erkennen de inspanningen van Caroline Hunter, dierverzorging technicus in de CMRC zebravis kernfaciliteit en Paulina Pawluczuk, onze undergraduate laborant.

Zebravis veeteelt Zebravis zijn ondergebracht en gefokt volgens standaard methoden 1. Voorbij het einde van de larvale periode kan het ontwikkelingsstadium van een zebravis worden gemeten door de standaard lengte (SL), of de rechte lijn afstand in millimeter van het anteriormost punt van de bovenlip naar de basis van de staartvin (posteriormost hypural plaat) 2. Op ongeveer een maand na de bevruchting (10-12 mm SL), de neus-en bovenkaak barbels verschijnen als transparant epitheel knoppen de buurt van de olfactorische pits en op de achterste hoeken van de maxillae, respectievelijk. Naarmate de zebravis rijpt, de barbelen te breiden naar smalle, snorhaar-achtige aanhangsels. Omdat de kaak barbeel is groter (2-3 mm) en gemakkelijker te manipuleren, ons protocol geldt alleen voor deze bijzondere aanhangsel; gelijksoortige technieken, kon echter worden aangepast aan de kleinere neus barbeel. Barbel Clipping <ol><li> Verdoof volwassen zebravissen op de gewenste fase (bv., 1.5-2.5 cm SL, ~ 3-6 maanden na de bevruchting) door onderdompeling in 0,015% MS-222 (ethyl-3-aminobenzoaat methaansulfonaat) gebufferd op pH 7,0 in het systeem water. Let op tot zwemmen bewegingen te stoppen en kieuwen ventilatie wordt traag en regelmatig. Afhankelijk van de grootte van de vis, complete narcose duurt ongeveer 2-5 minuten. </li><li> Met behulp van een aquarium visnet, transfer 1-3 vis op een tijd om een ​​opgevouwen stuk papier natte handdoek in een petrischaal. Met behulp van een stompe spatel, oriënteren de vissen, zodat ze parallel aan elkaar en linker laterale kant naar boven. Vouw een deel van de natte papieren handdoek over het caudale deel van de vis, die het gehele lichaam tot aan het operculum (kieuwdeksels) om de huid en kieuwen vochtig te houden tijdens de procedure. </li><li> Bekijk de Petri plaat onder de stereomicroscoop, met behulp van een lage-hoek invallende licht naar het hoofd gebied te verlichten. Focus op de onderkant van de linker maxillaire barbeel, die uitsteekt uit het achterste ventrale hoek van de bovenkaak (afb. 1). <img src="/files/ftp_upload/1558/1558fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1. </li><li> Strak pak de schacht van de barbeel iets distaal van de rand van de bovenkaak. Verhoog de barbeel as en steek de kaken van een fijne punt veer schaar net proximaal van de tang. De schaar kan worden aangeraakt om de tang voor stabiliteit. Schuif de bek van de schaar langs de schacht van de barbeel totdat de cutting edge benadert de rand van de bovenkaak. Sluit de schaar te snijden door de barbeel as. De geamputeerde barbeel, nog steeds greep in de tang, kan worden verwijderd voor fixatie of verdere observatie. </li><li> Onmiddellijk overdracht van de vis om een ​​kleine tank van het systeem schoon water (~ 500 ml) met daarin een druppel methyleenblauw aan oppervlakkige schimmelinfectie te controleren. Laat de vis om te herstellen &#39;s nachts. De volgende ochtend, de terugkeer van de vis aan de opvoeding systeem. Barbeel regeneratie is maximaal na 2 weken. </li></ol> Agar Inbedding van Matched Pairs Barbel <ol><li> Verzamel vissen door middel van passende euthanasie techniek en vast te stellen in een 50 mL buis van 4% paraformaldehyde-fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met agitatie bij 4 ° C gedurende de nacht. Het fixeermiddel volume moet ten minste tien keer het volume van het weefsel te zijn. Na fixatie, gooi paraformaldehyde afval in een goedgekeurde container en spoel het weefsel in een aantal veranderingen van PBS. </li><li> Bereid in een 250 ml glazen fles 150 ml van 2% agarose (T m ~ 37 ° C) in gedestilleerd water. Warmte met een magnetron of hete plaat, roeren periodiek totdat deze volledig opgelost. Equilibreren het gesmolten oplossing in een 50-60 ° C waterbad. </li><li> Monteer een standaard gelelektroforese rig door het plaatsen van een kleine pakking gel vorm (10 x 10 cm; ~ 100 ml gel volume) stevig tegen de zijkanten van de buffer kamer. Voeg 2-4 kleine getande sample kammen (4 x 1,5 mm). </li><li> Op een vlakke ondergrond, giet de gesmolten agarose in de mal om alleen betrekking hebben op de voet van de kammen, de vorming van zeer ondiepe putten. Onmiddellijk weer de overgebleven agarose in het warme water bad, dit zal later worden gebruikt om het weefsel (Steps 9-12) insluiten. Zet een lange glazen Pasteur pipet in de kolf aan de pipet houden aan de dezelfde temperatuur als de agarose. </li><li> Laat de gel uit te harden voor 20-30 minuten. Verwijder de kammen, verwijder vervolgens de gel mal met de geharde gel uit de buffer kamer. Stevig tape de open zijden van de gel vorm met laboratorium-tape, zodat de gel niet uitschuifbaar. Deze tape moet worden uitgebreid enkele millimeters over het oppervlak van de agar zodat extra agarose kunnen later worden toegevoegd (stap 13). </li><li> Plaats de gel vorm op het toneel van een stereomicroscoop. Magnify een lege goed en breng de randen in beeld. </li><li> Op het oppervlak van de agar grenzend aan het goed en pipetteer een druppel water of buffer met de vaste barbeel monsters (bv., regenereren en controle). Using gebogen insect pinnen, sleept u de vochtige specimens in de put en ze naar de bodem te duwen. Oriënteer de barbeel assen parallel aan elkaar en uitgelijnd met tegengestelde lange randen van de put. Oppervlaktespanning zal helpen houden het weefsel in stand. </li><li> Als u klaar bent om te verankeren, met een fijne pipet tip of de hoek van een laboratorium tissue om overtollig vocht te verwijderen uit de put. Werken snel, zodat er geen te laten het weefsel uitdrogen. </li><li> Met behulp van de verwarmde glazen Pasteur pipet voorzichtig pipet verse gesmolten agarose in en rond de monsters om de barbeel weefsel zegel op zijn plaats. Doe niet te veel. Voordat de agarose verhardt, maken last-minute aanpassingen met het insect pinnen. </li><li> Plaats een genummerde papieren exemplaar label naast de put en zet deze vast met een druppeltje agarose. </li><li> Herhaal stap 6 tot en met 10 voor elk putje van exemplaren. </li><li> Indien gewenst voor het imago van kalibratie, plaatst u een stuk papier met een bedrukt micrometer schaal (bijv. <a href="http://incompetech.com/graphpaper/multiwidth/">http://incompetech.com/graphpaper/multiwidth/</a> ) in de bodem van een lege goed. Strijk het papier glad naar de bodem van de put en dek deze af met warm agarose. </li><li> Nadat alle exemplaren zijn ingebed, zal het oppervlak van de gel te onregelmatig, met geharde druppels agarose. Plaats de gel op een vlakke ondergrond en voorzichtig giet extra gesmolten agarose tot de bovenkant is uniform. Gebruik de kleinste hoeveelheid agarose nodig is om een ​​glad oppervlak te verkrijgen; teveel agarose zal uitgezonden licht fotografie onduidelijk. Laat deze toplaag te harden. </li><li> De gel kan nu worden gefotografeerd op het podium van een stereomicroscoop het bruto morfologie record voor elke barbeel paar. Image kalibratie wordt verkregen door het fotograferen van de embedded micrometer schaal. </li><li> De hele gel kan worden opgeslagen gewikkeld in natte papieren handdoekjes en verzegeld in een plastic zakje bij 4 ° gedurende enkele weken. </li><li> Voor verdere analyse kan agar blokken met matched pair van barbels worden gesneden uit de gel met een scalpel of scheermesje en verwerkt voor paraffine histologie of cryosectioning door standaard methoden 3,4. Als alternatief kunnen individuele barbels worden ontleed uit de agarose met fijne naalden, gespoeld in water, en verwerkt voor andere downstream-toepassingen (bijvoorbeeld, hele-mount immunohistochemie of confocale microscopie). </li></ol>

<ol><li>Westerfield, M. Chapter 1 General Methods for Zebrafish Care. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 4th ed., Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).</li>
<li>Howe, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+length%3A+Not+quite+so+standard%5BTitle%5D)+AND+%22Fisheries+Research+%28Amsterdam%29%22%5BJournal%5D)">Standard length: Not quite so standard.</a> Fisheries Research (Amsterdam). 56, 1-7 (2002).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin+Embedding+Tissue+Samples+for+Sectioning%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Paraffin Embedding Tissue Samples for Sectioning.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 6, (2008).</li>
<li>Westerfield, M. Ch 8.3 Agar Embedding for Cryostat Sectioning of Embryos or Larvae. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 4th ed., Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).</li>
<li>Hansen, A., Reutter, K., Zeiske, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taste+bud+development+in+the+zebrafish%2C+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Taste bud development in the zebrafish, Danio rerio.</a> Dev Dyn. 223, 483-496 (2002).</li>
</ol>

De zebravis bovenkaak barbeel is een onderbenut weefsel systeem voor het bestuderen van de groei, het onderhoud en regeneratie van verschillende celtypes in de zebravis. Hoewel de barbeel aanhangsel heeft geen menselijke analoge, worden de celtypen die het bevat zeer goed geconserveerd, waardoor het mogelijk is voor de huid, klieren, melanocyten, de bloedsomloop vaten en zenuwen in een optisch heldere en anatomisch eenvoudige cilindrische structuur te bestuderen. Net als bij de goed bestudeerde staartvin, kan barbeel weefsel geïnduceerd worden om zich te vernieuwen door amputatie. Met behulp van de rand van de bovenkaak als een anatomisch oriëntatiepunt, kan de amputatie vliegtuig precies geplaatst worden, het vergemakkelijken van de meting van de barbeel hergroei. Voor een ervaren operator, elke ingreep duurt slechts enkele seconden. Het herstel is snel, en we hebben tot nu toe ontdekt geen korte of lange termijn effecten op vissen gedrag. Zebravissen met een maxillaire barbeel zwemmen, eten en ras zo goed als niet-chirurgische controles, en hebben vergelijkbare overleven tot de tijd van weefsel verzamelen, tot 6 maanden na de operatie. De fysiologische effecten van deze operatie zal naar verwachting minimaal omdat 1) de extraorale smaakpapillen aan boord van de barbeel zijn ook te vinden op vele andere delen van de vis epitheel, met inbegrip van de lippen, wangen en hoofd 5, en 2) differentiëren smaakpapillen op de regenererende barbeel binnen 72 uur (LeClair et al.., niet-gepubliceerde gegevens.) Hierdoor is de maxillaire barbeel een minimaal invasieve systeem voor het bestuderen van wondgenezing, revascularisatie, en reïnnervatie in het kader van een volwassen gewervelde dieren. Na chirurgische inductie van regeneratie, kan barbels worden verzameld met intervallen voor morfometrische meting en / of microscopische analyse van vaste weefsel. Handig is dat de kaak barbeel is ongeveer de lengte (2-3 mm) en diameter (100-200 mm) van een zebravis embryo, het vergemakkelijken van de toepassing van de vele standaard protocollen, zoals paraffine histologie, cryosectioning, hele-mount immunohistochemie, en in situ hybridisatie. Tezamen bieden deze kenmerken maken de maxillaire barbeel een zeer haalbaar in vivo model voor het bestuderen van weefselherstel en regeneratie.

Microscoop Equipment Een stereo ontleden microscoop met doorvallend en incidenten glasvezel-verlichting is nodig voor barbeel knippen en agar inbedding. Barbel Clipping <ul><li> Vis-systeem water </li><li> 2 zebravis kruising tanks </li><li> MS-222 (ethyl-3-aminobenzoaat methaansulfonaat; Sigma Chemical # E10521-10G) </li><li> steriele 120-mm Petri plaat </li><li> natte papieren handdoeken </li><li> stompe metalen spatel </li><li> Dumont # 55 Bio Inox pincet (Fine Science Tools # 11255-20) </li><li> Mini-Vannas veer schaar (Fine Science Tools # 15000-00) </li><li> methyleenblauw antischimmelmiddel (Drs. Foster &amp; Smith # CD-905781) </li><li> kleine aquarium visnet </li></ul> Tissue verzamelen en agar inbedding <ul><li> 4% paraformaldehyde in 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PF-PBS), in hoeveelheden verdeeld in 50 ml conische buizen en bevroren opgeslagen bij -20 ° C tot gebruik </li><li> 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (pH 7,27 tot 6) </li><li> 250 ml glazen kolf </li><li> 2% agarose in gedistilleerd water </li><li> standaard kleine agarosegelelektroforese rig (gel size = ~ 10 cm vierkant) </li><li> kleine getande elektroforese sample kam (comb afmeting 4 x 1,5 mm) </li><li> warm water bad (50-60 ° C) </li><li> laboratorium tape </li><li> zwart emaille insect pinnen, afmeting 000 (Fine Science Tools # 26.000-25) </li><li> 1-2 pin houders (Fine Science tools # 26.016-12) </li><li> 9-inch glas Pasteur pipet </li><li> pipet gloeilamp of pomp </li><li> laboratorium weefsel </li><li> kleine papieren etiketten </li><li> (Optioneel) afgedrukt calibratie schaal </li><li> natte papieren handdoeken </li><li> zip-sluiting plastic zak </li><li> scalpel / scheermesje (uit te snijden agar blokken) </li></ul>

methoden voor de studie van de zebravis bovenkaak barbel

Methods for the Study of the Zebrafish Maxillary Barbel

Barbelen zijn huid zintuiglijke aanhangsels gevonden in vissen, reptielen en amfibieën. De zebravis, Danio rerio, ontwikkelt twee paar barbels-een korte neus en een paar langere maxillaris paar. Barbeel weefsel bevat cellen van ectodermale, mesodermale en de neurale lijst oorsprong, waaronder de huid cellen, klieren, smaakpapillen, melanocyten, de bloedsomloop schepen en sensorische zenuwen. Tegenstelling tot de meeste volwassen weefsel, de bovenkaak barbeel is optisch helder, waardoor we aan de ontwikkeling en het onderhoud van deze types weefsel te visualiseren gedurende de hele levenscyclus. Deze video toont vroege ontwikkeling van de bovenkaak barbeel (vanaf ongeveer een maand na de bevruchting) en toont een chirurgische protocol om regeneratie te induceren in de volwassen aanhangsel (&gt; 3 maanden na de bevruchting). In het kort, is de linker maxillaire barbeel van een verdoofde vis verhoogd met steriele pincet net distaal van de caudale rand van de bovenkaak. Een fijne, steriele schaar de lente is gepositioneerd ten opzichte van de tang om de barbeel as cut op dit niveau, tot oprichting van een anatomische mijlpaal voor de amputatie vliegtuig. Regeneratieve groei kan worden gemeten ten opzichte van dit vlak, en in vergelijking met de contralaterale barbeel. Barbeel weefsel regenereert sneller, het bereiken van maximale hergroei binnen 2 weken na letsel. Technieken voor het analyseren van de geregenereerde barbeel ook ontleden en inbedding matched pairs van barbels (regenereren en controle) in de putjes van een standaard DNA elektroforese gel. Ingebedde monsters zijn gunstig gefotografeerd onder een stereomicroscoop voor bruto morfologie en morfometrie, en kan worden opgeslagen voor weken voorafgaand aan de downstream-toepassingen zoals paraffine histologie, cryosectioning, en / of hele berg immunohistochemie. Deze methoden stellen de maxillaire barbeel als een roman in vivo tissue systeem voor het bestuderen van de regeneratieve capaciteit van meerdere celtypen in de genetische context van de zebravis.

De zebravis bovenkaak barbeel is een integumentary zintuig met ectodermale, mesodermale en de neurale lijst derivaten. Belangrijker nog is dat de volwassen barbeel regenereren na proximale amputatie. Deze video introduceert maxillaire barbeel ontwikkeling en demonstreert een chirurgische protocol voor regeneratie te induceren, gevolgd door de collectie, inbedding en stroomafwaarts beeldvorming van barbeel exemplaren.

Methoden voor de Studie van de zebravis bovenkaak Barbel

Baarddraden zijn sensorische huiduitsteeksels die voorkomen bij vissen, reptielen en amfibieën. De zebravis, Danio rerio, ontwikkelt twee paren baarddraden: een korte nasale...

Marbles zijn een heterogene verzameling sensorische structuren die voorkomen bij amfibieën, reptielen en vissen. De zebravissen ontwikkelt twee paren marbles: een kleiner neuspaar en een groter maxillair paar. Deze transparante aanhangsels kunnen worden gebruikt om de ontwikkeling, het behoud en de regeneratie van verschillende celtypen van de zebravissen te bestuderen.Deze video introduceert de ontwikkeling van de maxillaire marmer en demonstreert een chirurgisch protocol om regeneratie te induceren. De baarden worden enkele dagen of weken later verzameld, gevolgd door dissectie en inbedding van de regeneraten en controles. Hallo, ik ben Elizabeth LeClair van het LeClair Lab aan de DePaul University en ik ben Ya Chesky van het Northwestern University Feinberg School of Medicine and Children's Memorial Research Center.Vandaag laten we u enkele procedures zien voor het bestuderen van de maxillaire kraakbeen van de zebravis. We gebruiken deze procedures om de groei en ontwikkeling van het kraakbeen van de zebravis te bestuderen. Laten we beginnen.Ongeveer 30 tot 40 dagen na de bevruchting verschijnt de maxillaire barbell als een transparante epitheliale knop nabij de posterieure ventrale hoek van de maxilla. Naarmate de zebravis volwassen wordt, strekt de barbell zich uit tot een smal snorhaarachtig aanhangsel van enkele millimeters lang. De volgroeide barbell bevat verschillende belangrijke celtypen, waaronder pigmentcellen, kliercellen, smaakpapillen, bloedvaten en gemyeliniseerde zenuwen.Bovenal is het marmer transparant in alle stadia van de ontwikkeling. Net als andere organen van de zebravis kan de maxillaire snorbaard regenereren na een proximale amputatie. In deze sectie demonstreren we een procedure om de snorbaard aan de basis van de maxilla af te knippen.Dit zou ook een unilaterale ectomie kunnen worden genoemd. Bereid op de dag van de operatie twee kleine tanks met viswater voor, één voor anesthesie en één voor het herstel. De anesthesietank bevat 0,015% trica gebufferd tot pH 7,0.In het viswater bevat de herstelbak vissen, water en een druppel methyleenblauw om schimmelinfecties te beheersen. Anestheseer één tot drie volwassen zebravissen door immersie in de trica-bak; observeer tot de zwembewegingen stoppen en de kieuventilatie traag en regelmatig wordt. Afhankelijk van de grootte van de vis kan volledige anesthesie twee tot vijf minuten duren.Gebruik een aquariumvisnet om de vissen over te brengen naar een stuk nat keukenpapier in een Petrischaal. Richt de vissen met een stompe spatel zodanig dat ze parallel aan elkaar liggen. Vouw, met de linker laterale zijde naar boven, een deel van het keukenpapier over de vissen om ze vochtig te houden.Bekijk vervolgens de Petrischaal onder de stereomicroscoop met behulp van laaghoekig invallend licht om de kop te verlichten. Focus met een fijne pincet op de basis van de linker maxillaire knikker. Pak de schacht van de knikker stevig vast, net distaal van de rand van de maxilla.Til de knikker op en plaats een fijngepunts veerschaar vlak proximaal van de pincet voor stabiliteit. De schaar kan de pincet of alternatief de bodem van de petrischaal raken. Schuif de kaken van de schaar langs de schacht van de knikker tot de snijkant de rand van de maxilla nadert.Snijd door de marmeren schacht en verwijder het geamputeerde marmer. Dit weefsel kan afzonderlijk worden gefixeerd en geanalyseerd. Breng de vis na de operatie over naar het herstelreservoir.Laat de vissen enkele uren tot een nacht herstellen en plaats ze vervolgens terug in het kweeksysteem. Wacht één tot twee weken tot de regeneratie van de baardgraten is voltooid. In de volgende sectie laten we zien hoe u gefixeerd weefsel van de baardgraten voorbehandelt voor analyse.Deze procedure begint met marmers die zijn verzameld en gefixeerd dagen, weken of maanden na de operatie. Spoel het gefixeerde weefsel in een gebufferde zoutoplossing en dissecteer het geregenereerde marmer weg van de linkerzijde van de kop. Vergeet de rechterbaard niet, die dient als controle voor tijdelijke opslag.Pipette elk bij elkaar passend paar knikkers in een druppel saline op een Petri-schaal. Dek af met een deksel en laat op de werkbank staan terwijl u weggaat. Bereid uw gel door 150 milliliters van 2%agros te verhitten tot het volledig is opgelost.Equilibreer de oplossing in een waterbad van 50 tot 60 °C. Zet vervolgens een standaard gel-elektroforese-opstelling klaar en voeg één tot vier kleine kammen toe aan de monsters. Giet de gesmolten agarose op een vlakke ondergrond in de gelvorm, waarbij precies genoeg wordt toegevoegd om enkele zeer ondiepe putjes te vormen.Plaats de resterende aros onmiddellijk terug in het warme waterbad. Steek een lange glazen Pasteurpipet in zodat de pipet dezelfde temperatuur bereikt als de aros. Nadat de gel is afgekoeld, verwijdert u de kammen en vervolgens de gelvorm.Om de gel stevig te bevestigen, plakt u beide zijden af met laboratoriumtape in uw favoriete kleur. De tape moet enkele millimeters boven het oppervlak van de agarose uitsteken, zodat er later extra agarose kan worden gegoten. Plaats de gelmal op de tafel van een stereomicroscoop. Vergroot een lege put en stel de randen scherp.Pipetteer de knikkers met behulp van handvatten voorzien van gebogen insectenspelden vanuit de petrischaal op het geloppervlak naast het putje. Sleep de knikkers in het putje en duw ze naar de bodem. Lijn de halters parallel aan elkaar en tegen de lange randen van het putje uit. Gebruik vóór het inbedden een fijne pipette of laboratoriumdoekjes om overtollige vloeistof te verwijderen.Voeg met de verwarmde glazen pipet voorzichtig vers gesmolten agros rondom het weefsel toe. Breng laatste aanpassingen aan voordat de agros uithardt en vul het putje niet te veel. Noteer het specimennummer door in de nabijheid een klein genummerd papiertje toe te voegen.Nadat alle specimens zijn ingebed, wordt het bovenoppervlak van de gel gladgestreken door een dunne laag aros over de bovenkant te gieten. Gebruik zo weinig mogelijk, zodat de gel transparant blijft voor fotografie. Zodra de gel is uitgehard, kan deze onder een stereomicroscoop worden gefotografeerd om de grootte en vorm van elk knikkerpaar vast te leggen en morfometrische metingen te verzamelen voor verdere analyse.Agarblokjes met bijpassende paren knikkers kunnen met een scalpel of scheermesje uit de gel worden gesneden. Deze kunnen vervolgens met standaardmethoden worden verwerkt voor paraffinehistologie of cryosectie. Alternatief kunnen individuele knikkers met fijne, in water gespoelde naalden uit de agar worden gedisseceerd en vervolgens worden verwerkt voor andere downstream-toepassingen, zoals whole mount immunohistochemie of confocale microscopie.Ten slotte kan de gehele gel in een zak worden afgesloten en koel worden bewaard. De specimens blijven gedurende enkele weken houdbaar. We hebben u zojuist laten zien hoe u de ontwikkelende en regenererende maxillaire staaf kunt observeren en analyseren.Het is een nieuw systeem in zebravis, dus er valt nog veel te ontdekken. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

methods-for-the-study-of-the-zebrafish-maxillary-barbel

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Time-lapse confocale beeldvorming is een techniek nuttig voor het karakteriseren van embryonale ontwikkeling. Hier beschrijven we de methode karakteriseren craniofaciale morfogenese in wildtype en PDGFRA, Smad5 en SMO mutant embryo's.

Het analyseren Craniofacial Morphogenesis in zebravis behulp 4D confocale microscopie

Omdat veel zebravismodellen van neurologische en niet-neurologische ziekten worden bestudeerd in de volwassen vissen dan het embryo / larven ontwikkelden we een kwantitatieve dwarslijn regeneratieve test die kan worden toegepast bij de zebravis ziektemodellen volwassene. De test betrokken resolutie bij de 1) neuromast en 2) individuele haar cel niveaus.

Een test voor laterale lijn Regeneration in Adult zebravis

De zebravis embryo is een uitstekend model voor ontwikkelingsbiologie onderzoek. Tijdens de embryogenese, zebravissen ontwikkelen met een dooier massa, die driedimensionale uitdagingen voor monster observatie en analyse presenteert. Dit protocol beschrijft hoe twee-dimensionale platte mount voorbereidingen van ganse berg in situ (WISH) gekleurd zebravis embryo exemplaren maken.

Flat Mount Voorbereiding voor observatie en analyse van de zebravis embryo Exemplaren gekleurd door Whole Mount<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie

Finite Element Analysis is een veelgebruikt hulpmiddel om de mechanische prestaties van structuren onder belasting te onderzoeken. Hier passen we het toe op het modelleren van de biomechanica van de bek van de zebravis.

Het bouwen van Finite Element modellen te onderzoeken zebravis Jaw biomechanica

Dit manuscript beschrijft werkwijzen voor elektrofysiologische opnames van spinale neuronen van zebravis embryo's en larven. Het preparaat handhaaft neuronen in situ en vaak gaat om minimale dissectie. Deze werkwijzen maken het elektrofysiologisch onderzoek van verschillende spinale neuronen van de initiële elektrische prikkelbaarheid overname door de vroege larvale stadia.

zebravis<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Voorbereiding voor elektrofysiologische registraties van Spinal sensorische en motorische neuronen

Het doel van dit protocol is te wijzigen van de doordringendheid van dodelijke skelet mutant fenotypen in zebrafish door selectief fokken. Dodelijke mutanten naar volwassenheid kunnen niet worden gekweekt en zelf gefokt, dus dit protocol beschrijft een methode voor het bijhouden en selecteren doordringendheid door meerdere generaties nakomelingen testen.

Zebravis dodelijke skelet Mutant doordringendheid verschuiven door nakomelingen testen

Dit manuscript beschrijft een eenvoudige methode om stress gedrag in volwassen zebravis te meten. De aanpak maakt gebruik van de aangeboren tendens dat zebravis de voorkeur aan de onderste helft van een tank, wanneer in een stressvolle toestand. Wij beschrijven ook methodes om de analyse met farmacologie te koppelen.

Gedrags benaderingen voor het bestuderen van aangeboren stress in zebravis

Optische helderheid is een groot voordeel voor celbiologisch en fysiologisch werk bij zebravissen. Robuuste methoden voor het meten van celgroei bij individuele dieren worden beschreven die nieuwe inzichten mogelijk maken in hoe de groei van skeletspieren en naburige weefsels worden geïntegreerd met de groei van het hele lichaam.

Real-time en herhaalde meting van skeletspiergroei in individuele levende zebravissen die worden blootgesteld aan veranderde elektrische activiteit

Dit protocol beschrijft het oogsten en visualiseren van elasmoid schubben van zebravissen tijdens in vivo regeneratie. Bovendien wordt de ex vivo cultuur van deze schubben tot 7 dagen na de oogst gepresenteerd.

Zebravis Scale Regeneratie In Toto en Ex Vivo Kweek van Schubben

Het hier beschreven protocol presenteert een eenvoudige en gemakkelijk te volgen procedure voor het kleuren en ontleden van craniofaciale kraakbeenderen in een 5 dagen oude zebravislarve. Het kan worden gebruikt om de anatomie, vorm en grootte van deze structuren onder verschillende ontwikkelingsomstandigheden te bestuderen.

Dissectie van Zebravis craniofaciale weefsels bij kleuring met Alcian Blue

Dit werk beschrijft een protocol voor het kwantificeren van de vorm van craniofaciaal kraakbeen met behulp van vrije software (tpsDigs2, MorphoJ en PAST) om veranderingen in gezichtsstructuur bij zebravislarven te meten.

Morfometrische analyses van vorm: De analysesoftware-toolbox voor craniofaciale vormkwantificatie bij zebravissen

Leer chirurgische methoden voor het bestuderen van regeneratie in de zebravis bovenkaak barbel. Dit protocol toont amputatie, weefselpreparatie en histologische analyse voor ontwikkelingsbiologisch onderzoek.

Methoden voor de Studie van de zebravis bovenkaak Barbel

Meer video's verkennen