Een techniek om tegelijkertijd Visualiseer virus-specifieke CD8 + T-cellen en virus-geïnfecteerde cellen In situ
13 augustus 2009
Een techniek combineert in situ tetrameer vlekken en in situ hybridisatie (ISTH) maakt visualisatie, in kaart brengen en analyseren van de ruimtelijke nabijheid van virus-specifieke CD8 + T-cellen om hun virus-geïnfecteerde targets, en de bepaling van de kwantitatieve relaties tussen deze immuun-effectoren en doelstellingen voor infecties resultaten.
Door het combineren van in situ hybridisatie en tetrakleuring in een techniek die bekend staat als ISTH, kunnen de relatieve aantallen en ruimtelijke relaties tussen virologisch antigeenspecifieke immuuneffectorcellen en virologisch geïnfecteerde cellen en weefsels worden bepaald. ISTH begint met het inbedden van vers SIV-geïnfecteerd weefsel in agros. Het weefsel wordt gesneden in 200 micron dikke secties met behulp van een vibrato en gekleurd voor virologisch antigeen.
Specifieke CD acht positieve cellen met behulp van fit C gelabelde MHC tetramers. Na het bevriezen worden deze gekleurde secties verder gesneden in acht micrometer dikke secties met behulp van een cryostat en in situ hybridisatie wordt uitgevoerd om virologisch geïnfecteerde cellen te lokaliseren. Confocale microscopie wordt gebruikt om de dubbelgekleurde secties te beelden en uiteindelijk de oorspronkelijke dikke secties te reconstrueren om de relatie tussen immuuneffector en doelcellen te onthullen.
Het gebruik van deze procedure voor het onderzoeken van vroege SIV-infectie is bewezen een goede voorspeller te zijn voor de ernst van de daaropvolgende ziekte. Hoi, ik ben Chinen Lee van de labboom van Ashley HA in het Departement van Microbiologie aan de Universiteit van Minnesota. Ik ben Pam Skinner, een assistent-professor in het Departement van Veterinaire Biomedische Wetenschappen aan de Universiteit van Minnesota.
Vandaag zullen we u een procedure laten zien voor instituut hybridisatie of ISTH voor kort. Naast het gebruik van inci teerkleuring gecombineerd met inci hybridisatie zoals we vandaag demonstreren, gebruiken we ook routinematig inci teerkleuring gecombineerd met immunohistochemie om de locatie, abundantie en eiwitexpressieprofiel van antigeenspecifieke CD acht T-cellen in situ te bepalen. U. Assistenten ons vandaag met de in situ u temerkleuring met de dikke secties zullen Dr. Heon Kim en Terry Matala zijn en assistenten ons met een dunne sectievoorbereiding en in situ u hybridisatie zullen zijn So laten we beginnen.
Om deze procedure te beginnen, koel de Vibram-bad met steriele PBSH tot twee graden Celsius. Stel de vibratorbladhoek in op 27 graden. Houd, waar mogelijk, vers weefsel gekoeld op ijs en begin de procedure binnen 24 uur na het oogsten van weefsels.
Om degradatie te minimaliseren, vergemakkelijkt de vibram ook het snijden van vers weefsel, verwijder bindweefsel en snijd het specimen met een scalpel in kleine stukken en plaats de stukken in een weiboot en bedek met 4% laagsmeltende Agros in PBS gesmolten bij ongeveer 40 graden Celsius. Zorg ervoor dat het weefsel in contact komt met de bodem van de schaal en duw weefselstukken naar beneden als ze drijven, bevries gedurende drie tot vijf minuten op ijs.
Hier wordt miltweefsel gebruikt, maar lymfeklier, vagina, baarmoederhals, baarmoeder of ander vers weefsel kan ook worden gebruikt met een scalpel. Snijd de agros rond het weefsel en gebruik pincetten om voorzichtig het ingebedde weefsel in de agros over te brengen naar de weefselblok. Ga verder door een Vibram weefselblok te coaten met Loctite lijm.
Verplaats het weefselstuk niet eenmaal het op de weefselblok is geplaatst. Laat het drogen gedurende ongeveer 10 minuten op ijs. Monteer vervolgens de weefselblok in de vibrator en snijd het weefsel in 200 micrometer dikke secties met behulp van een dood langzame voorwaartse snelheid en relatief hoge amplitude.
Gebruik een penseel om de gesneden secties over te brengen naar een gespecialiseerde weefselkamer in het putje van een 24 putjes weefselkweekplaat vooraf gevuld met een milliliter gekoelde PBSH. Plaats maximaal vier weefselsecties in elke weefselkamer. Label de monsters en zet het deksel vast op de plaat met een rubberen band om de weefselsecties te kleuren voor virale specifieke T-cellen.
ZI geconjugeerde tetramers worden eerst verdund in blokkeerbuffer tot nwt 0,5 microgram per milliliter. De oplossing wordt gepipetteerd in een 24 putjes plaat op een milliliter per putje. Het vers gesneden weefsel wordt overgebracht naar de plaat in de weefselkamers en wordt gedurende een nacht bij vier graden Celsius geschud.
Houd een lege put tussen weefselkamers met verschillende monsters om kruisbesmetting van oplossingen in de volgende stappen te voorkomen. In deze stap kan men antilichamen richten tegen extracellulaire of celoppervlakte-eiwitten. Voor het wassen, bereid een 24 putjes weefselkweekplaat voor met gekoelde PBSH na de primaire incubatie.
Gewassen twee keer door de weefselkamers over te brengen naar een vooraf gevulde plaat voor 20 minuten per keer, zorg ervoor dat het grootste deel van de vloeistof uit de weefselkamers wordt geleegd voordat ze worden overgebracht. Laat ook geen inhoud van één monster druppelen in een ander bij het verplaatsen van de weefselkamers en bewaak de secties in de weefselkamers om ervoor te zorgen dat ze niet aan de zijden vast komen te zitten. Fixeer de secties met vers 4% paraldehyd in PBS gedurende twee uur bij kamertemperatuur na de fixatie.
Gewassen twee keer met koud PBSH gedurende vijf minuten elke keer om het signaal van de tetramers te versterken. Incubeer de secties met konijn anti fitzy antilichamen in een verhouding van één tot 10.000 in blokkeerbuffer gedurende één tot drie dagen. In dit stadium kan men antilichamen tegen intracellulaire epitopen toevoegen.
Zorg ervoor dat de cellen worden gepermeabiliseerd en niet-specifieke sites worden geblokkeerd voorafgaand aan het toevoegen van het antilichaam. Antigeenretrieval kan ook nodig zijn na de tweede lange incubatie bedoeld om het signaal te versterken. Was de secties in PBSH drie keer gedurende minimaal 20 minuten en maximaal enkele uren per keer.
Voer een laatste incubatie uit met geschikte fluorescent gelabelde antilichamen. Bijvoorbeeld kan men geiten anti-konijn SI drie gebruiken om de konijn anti fitzy antilichamen te binden om de tetramer gekleurde cellen rood te laten fluoresceren. Als muis antilichamen worden gebruikt om eiwitten van belang zoals CD acht tegen te kleuren om killer T-cellen te visualiseren, kan men geiten anti-US Alexa 488 gebruiken om zich te binden aan de muis anti
Overzicht
Dit artikel presenteert een techniek genaamd in situ tetrameerkleuring gecombineerd met in situ hybridisatie (ISTH) voor het analyseren van de ruimtelijke relaties tussen virus-specifieke CD8+ T-cellen en hun doelwitten. Deze methode maakt de visualisatie en mapping van immuunresponsen in door virussen geïnfecteerde weefsels mogelijk, wat inzicht biedt in de uitkomsten van infecties.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Immunologie
- Virologie
- Celbiologie
Achtergrond
- Inzicht in de interactie tussen immuuncellen en virus-geïnfecteerde cellen is cruciaal voor de ontwikkeling van effectieve therapieën.
- CD8+ T-cellen spelen een belangrijke rol bij het beheersen van virale infecties.
- Huidige technieken voor het bestuderen van deze interacties missen vaak voldoende ruimtelijke resolutie.
- ISTH combineert twee kleuringsmethoden om de visualisatie van deze interacties te verbeteren.
Doel van de studie
- Om een methode te ontwikkelen voor het visualiseren van de nabijheid van CD8+ T-cellen tot virusgeïnfecteerde cellen.
- Om de relaties tussen immuuneffectoren en doelcellen te kwantificeren.
- Om de implicaties van deze relaties voor de uitkomst van de infectie te beoordelen.
Gebruikte methoden
- Inbedden van vers SIV-geïnfecteerd weefsel in agarose.
- Snijden van weefsel in secties voor kleuring.
- Gebruik van confocale microscopie voor het afbeelden van gekleurde secties.
- Reconstrueren van de oorspronkelijke dikke secties om celinteracties te analyseren.
Belangrijkste resultaten
- ISTH visualiseert effectief de ruimtelijke relaties tussen CD8+ T-cellen en virusgeïnfecteerde cellen.
- De techniek levert kwantitatieve gegevens over immuunresponsen.
- Bevindingen wijzen erop dat vroege interacties de ernst van de ziekte kunnen voorspellen.
- ISTH kan worden aangepast voor diverse weefseltypen buiten de milt.
Conclusies
- ISTH is een waardevol instrument voor het bestuderen van immuunresponsen bij virale infecties.
- De methode verdiept ons begrip van de dynamiek van T-cellen in situ.
- Toekomstige toepassingen kunnen bredere studies omvatten naar immuuninteracties bij verschillende ziekten.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Het begrijpen van de ruimtelijke dynamiek tussen virus-specifieke CD8+ T-cellen en geïnfecteerde doelcellen is van cruciaal belang voor het evalueren van de immunotherapeutische effectiviteit en het voorspellen van de uitkomst van infecties. De ISTH-methode maakt een kwantitatieve beoordeling van effector-tot-doelcel ratio's en ruimtelijke nabijheid mogelijk, waardoor mechanistische inzichten worden verkregen die doelwitvalidatie en de identificatie van lead-verbindingen bij antivirale ontwikkeling ondersteunen. Deze aanpak verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid door vroege immuuninteracties te koppelen aan het ziekteverloop, wat bijdraagt aan go/no-go beslissingen in preklinische pipelines.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door de interactie van antigeenspecifieke T-cellen met geïnfecteerde cellen in de weefselcontext te visualiseren.
- Operationele waarde: Levert ruimtelijk opgeloste, kwantitatieve gegevens over immuuneffectorpopulaties om de risico's van doelmechanismen te verminderen.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de triage van portfolio's door vroege E:T-ratio's te correleren met resultaten van de infectiecontrole.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gestandaardiseerde, reproduceerbare resultaten van de lokalisatie en abundantie van immuuncellen voor benchmarkanalyse van assays.
- Operationele waarde: Maakt de preparatie van gevalideerde weefselcoupes mogelijk voor daaropvolgende imaging- en analyseworkflows.
- Schaalbaarheid: Faciliteert hergebruik van het platform over verschillende weefseltypes en infectiemodellen voor vergelijkende screening.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Continuïteit: Slaat een brug tussen observaties uit discovery-onderzoek en preklinische validatie door de weefselarchitectuur en cellulaire relaties te behouden.
- Mechanische Risicoreductie: Verduidelijkt of de waargenomen immuunresponsen functioneel betrokken zijn bij targets in situ.
- Risico-gecorrigeerde Vooruitgang: Informeert beslissingen op basis van ruimtelijke en kwantitatieve immuunmetrieken in plaats van enkel op bulkmetingen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De ISTH-methode past binnen het continuüm van ontdekking naar preklinische fase door hypothesegestuurde analyse van interacties tussen immuuncellen en targets mogelijk te maken na de initiële identificatie van lead-verbindingen, maar vóór de bevestiging van de werkzaamheid in ziektemodellen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door de ruimtelijke colokalisatie van effectoren en targets aan te tonen.
- Screening: Levert assay-klare, kwantitatieve resultaten over immuuncelfrequenties en -distributie voor de evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Biedt meetbare E:T-ratio's en ruimtelijke distributiegegevens die een zij-aan-zij vergelijking van experimentele condities mogelijk maken.
- Translationeel Onderzoek: Beoudt de histologische getrouwheid om continuïteit mogelijk te maken van ex vivo analyse naar in vivo validatie.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar histologie-gebaseerd platform voor longitudinale immuunmonitoring over verschillende studies heen.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door de specificiteit van T-cellen direct te koppelen aan target-engagement in weefsel.
- Operationele waarde: Standaardiseert weefselverwerking en kleuring voor reproduceerbare ruimtelijke immuunprofilering.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroege immuunsignaturen te identificeren die voorspellend zijn voor de uitkomsten.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van kandidaten mogelijk op basis van functionele metrieken voor immuun-engagement.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in immunohistochemie, in situ hybridisatie en confocale microscopie.
- Afhankelijk van cryostaat-, vibratoom- en fluorescentie-beeldvormingsinfrastructuur.
- Vereist gestandaardiseerde protocollen voor weefselinbedding, coupesnijden en kleuring voor alle gebruikers.
- Moet rekening houden met weefselspecifieke optimalisatie van antigeen-retrieval en probe-penetratie.
- Beperkt door de beschikbaarheid van weefsel en de RNA-integriteit, in het bijzonder bij archief- of gedegradeerde monsters.
Veelgestelde vragen over biofarmaceutica
Chapters in this video
0:07
Title
1:07
Introduction
2:18
Preparation of Thick Fresh Tissue Sections
5:22
Staining the Thick Sections with Tetramers
10:11
Preparing Thin Sections
12:17
Acquiring Confocal Microscope Images
17:56
Representative Images of Simultaneous Visualization by ISTH of Immune Effectors and Targets in Tissue Sections
19:50
Conclusion
