Aorta Ring Assay
November 24th, 2009
Angiogenese, is het kiemen van de bloedvaten van de reeds bestaande vaatstelsel, verbonden aan zowel natuurlijke en pathologische processen. Hier laten we zien een aorta-ring-test die het mogelijk maakt angiogene potentiators en remmers direct worden toegevoegd aan aorta-ringen in cultuur. Kieming en uitgroei neovessel kan worden bepaald door het inspecteren van de aorta-ringen over een periode van 6-12 dagen.
Het algemene doel van de aortische ringtest is om een flexibel experimenteel systeem te bieden waarin bloedvaten ontspruiten uit hele stukken muizenaorta binnen een 3D-matrix. Dit wordt bereikt door eerst de thoracale aorta uit een muis te dissecteren en deze vervolgens zorgvuldig te reinigen van alle overgebleven omliggend weefsel. Plakken van de schone aorta of aortaringen worden in individuele putjes van een 48-wellsplaat geplaatst, elk met basaal matrixextract of BME gevormd tot koepels.
Een extra druppel BME omsluit de ring in een 3D-structuur. De matrix kan elk experimenteel reagens naar keuze bevatten. Na incubatie gedurende meerdere dagen kunnen bloedvaten worden waargenomen die ontspruiten uit aortaringen en kan het angiogenesepotentieel van testverbindingen worden beoordeeld.
Hallo, ik ben Karen Bein van het laboratorium van Dr. E Lewis in het Departement Klinische Biochemie aan de Beon Universiteit van de Negatieve in Be Sheva Israël. Vandaag laten we u een procedure voor de muis-aortische ringtest zien. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de effecten van verschillende materialen op bloedvatvorming te bestuderen.
Dus laten we beginnen. Om deze procedure te starten, laat het basement matrix extract of BME smelten op ijs of bij vier graden Celsius. Zodra het is ontdooid, blijf het BME koud houden om te voorkomen dat het weer stolt.
Op de dag van het experiment, euthanasie een muis van zes tot zeven weken oud door een standaard ketamine en xylazine injectie. Bloed snel door de halsslagaders, gevolgd door cervicale dislocatie. Begin de procedure door het dier af te vegen met 70% ethanol in een steriele laminaire stroomkap. Vervolgens, terwijl u werkt onder een dissectiemicroscoop, gebruik steriele forceps en dissectie schaar om een verticale incisie in de huid te maken en de buikwand te openen.
De incisie moet worden gemaakt om het bovenste borstbeen bloot te leggen waar de ribbenkast ook wordt doorgesneden en het diafragma wordt verwijderd. Ga verder met het voorzichtig wegduwen van alle organen totdat de thoracale aorta, die naast de wervelkolom ligt, volledig zichtbaar is. Voer dunne steriele pincetten tussen de aorta en de wervelkolom in. Spreid de pincetten open en til de aorta geleidelijk uit zijn bed, waarbij het thoracale segment wordt gescheiden van de rest van de aorta.
Nu de aorta is gescheiden, gebruik scherpe schaar om het los te snijden van de muis, beginnend aan het uiteinde, dat in de buurt is van de nierslagader en eindigend nabij het hart. Plaats de uitgesneden thoracale aorta in een petrischaal gevuld met koud steriele PBS. Nu de aorta is verwijderd, kunnen de aortaringen worden voorbereid met behulp van twee steriele pincetten en onder een binoculaire microscoop werken.
Reinig de thoracale aorta van omringende vetweefsel. Zorg ervoor dat u de aorta niet beschadigt en houd deze alleen aan de randen vast. De aorta moet herhaaldelijk worden ondergedompeld in de PBS bevattende petrischaal om uitdroging te voorkomen totdat deze eindelijk schoon is.
Nu de thoracale aorta schoon is, gebruik een chirurgisch mes en werk onder de binoculaire microscoop om de aorta gelijkmatig in een millimeterringen te snijden. Gebruik een liniaal onder het snijvlak als richtlijn en zorg ervoor dat u een nieuw mes gebruikt en het van tijd tot tijd vervangt om scherpte te behouden. De uiteinden van de aorta worden niet gebruikt. Na het snijden van elke ring, gebruik pincetten om deze voorzichtig over te brengen naar een nieuwe schaal met koud PBS.
Plaats alle ringen in dezelfde PBS bevattende plaat om ervoor te zorgen dat de test gerandomiseerd is. Aangezien elk segment van de aorta een ietwat ander angiogenetisch potentieel heeft, houd de ringen op ijs. Bereid vervolgens de testplaat voor met voorgekoelde pipettenpunten.
Voeg aan elke put in een 48-wellsplaat ongeveer een druppel van 150 microliters koud BME toe. De druppel stolt tot een koepel tijdens de beweging. De BME maakt transport van stoffen, chemotaxis van cellen en, het belangrijkste, celdifferentiatie en migratie mogelijk, wat leidt tot de vorming van nieuwe bloedvaten. De perimeterputten worden gevuld met PBS. Om uitdroging van de BME te voorkomen, laat de BME-druppel 20 tot 30 minuten stollen bij 37 graden Celsius. Nadat de BME is gestold, tilt u voorzichtig een aortaring uit de petrischaal op met behulp van pincetten om beschadiging te voorkomen. De ring moet in de druppel worden overgebracht die zich vormt tussen de uiteinden van de pincetten. Als gevolg van oppervlaktespanning van de vloeistof, plaats een enkele aortaring in het bovenste midden van elke koepel en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius. Bovenop elke ring voegt u nog eens 150 microliters BME toe en incubeert u gedurende 20 tot 30 minuten.
Bij 37 graden Celsius is de ring nu omhuld door BME en wordt de test uitgevoerd. Materialen kunnen aan de plaat worden toegevoegd om de test te starten. Supplementeer eerder bereid humaan endotheel serumvrij medium met of het experimentele materiaal of endotheelcelgroeisupplement als een positieve controle voor een negatieve controle.
Gebruik alleen medium. Voeg 500 microliters van het supplement medium toe aan elke put en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende zes tot 12 dagen. Tijdens deze incubatieperiode, bekijk de plaat onder de microscoop en kijk naar bloedvaten die uit de aorta ontspruiten en naar gevorderde, volwassen bloedvaten die worden geïdentificeerd door verdere vertakking van bloedvaten.
Als er uit het ringweefsel driedimensionaal bloedvaten ontspruiten, fotografeert u de ringen tussen dag zes en 12 onder een standaard fasecontrast stereomicroscoop. Daarnaast verzamelt u supernatanten op verschillende dagen tussen dag zes en 12 en bewaart u deze bij vier graden voor gebruik binnen een dag of Eloqua en bewaart u ze bij min 20 of min 80 voor toekomstig gebruik. De supernatanten kunnen worden geanalyseerd met behulp van verschillende technieken, zoals Eliza voor vgf of vetzuuranalyse voor stikstofmonoxideniveaus.
Deze beelden zijn 12 dagen na plaatsing van de ringen in de putjes en incubatie
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een aortaringassay die is ontworpen om angiogenesis te bestuderen door het ontspruiten van bloedvaten van muisaorta in een gecontroleerde omgeving mogelijk te maken. De assay maakt het mogelijk om direct angiogeneseremmende verbindingen toe te voegen om hun effecten op de uitgroei van nieuwe bloedvaten over een periode van dagen te beoordelen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Angiogenesis
- Vasculaire biologie
- Experimentele assays
Achtergrond
- Angiogenesis is cruciaal voor zowel fysiologische als pathologische processen.
- De aortaringassay biedt een model voor het bestuderen van bloedvatvorming.
- Begrip van angiogenesis kan leiden tot inzichten in verschillende ziekten.
- De assay maakt het mogelijk om verschillende verbindingen in een 3D-matrix te testen.
Doel van de studie
- Om een flexibel systeem te ontwikkelen voor het bestuderen van angiogenesis.
- Om de effecten van angiogenesepotentiators en -remmers te evalueren.
- Om vaatspruiting van aortaringen in vitro te observeren.
Gebruikte methoden
- Dissectie van de thoracale aorta van muizen.
- Bereiding van aortaringen en plaatsing in een 3D-matrix.
- Incubatie van aortaringen met experimentele reagentia.
- Observatie van de uitgroei van nieuwe bloedvaten over 6-12 dagen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle ontspruiting van bloedvaten uit aortaringen.
- Beoordeling van het angiogenesepotentieel van verschillende verbindingen.
- Demonstratie van de flexibiliteit van de assay voor verschillende experimentele omstandigheden.
- Inzichten in de mechanismen van angiogenesis.
Conclusies
- De aortaringassay is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van angiogenesis.
- Het maakt direct testen van angiogenesefactoren in een gecontroleerde omgeving mogelijk.
- Bevindingen kunnen bijdragen aan het begrip van vasculaire ontwikkeling en gerelateerde ziekten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
The aortic ring assay provides a physiologically relevant organotypic model for evaluating angiogenic and anti-angiogenic compounds in early discovery. By enabling direct compound testing in a 3D matrix with quantifiable neovessel outgrowth, it supports mechanistic de-risking of vascular targets and pathway validation. This assay bridges in vitro endothelial screens and in vivo models, improving predictive confidence in lead identification for cardiovascular, oncology, and ischemic disease programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by assessing compound effects on sprouting from intact aortic tissue.
- Operational Value: Enables functional validation of angiogenic targets using a native vascular explant system.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds with measurable effects on vessel formation in a disease-relevant context.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for dose-response screening of angiogenic modulators.
- Operational Value: Standardizes readouts through phase-contrast imaging and supernatant collection for biomarker analysis.
- Scalability Value: Supports 6-replicate testing per condition to address biological variability and ensure assay robustness.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance through use of murine aorta, reflecting in vivo-like angiogenic responses.
- Operational Value: Provides continuity from discovery to preclinical validation by enabling longitudinal monitoring of neovessel outgrowth.
- Risk Mitigation: Informs advancement decisions by identifying compounds with consistent pro- or anti-angiogenic activity across replicates.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, offering a functional readout that complements biochemical and cellular assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking compound treatment to phenotypic changes in vessel sprouting and maturation.
- Screening: Enables assay readiness through standardized BME embedding and randomized ring placement to minimize positional bias.
- Analytics: Generates quantitative outputs via image analysis of sprout length/branching and ELISA-based measurement of angiogenic factors in supernatants.
- Translational Research: Connects to preclinical work by modeling angiogenic responses in a tissue-contextual system.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for screening diverse compound libraries across therapeutic areas involving vascular pathology.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by observing direct effects on neovessel formation from native tissue.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized ring preparation, BME doming, and replicate testing.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early phenotypic validation of vascular activity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on angiogenic efficacy and specificity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine dissection and tissue handling under sterile conditions.
- Dependent on consistent BME quality and proper gelation at 37°C for dome formation.
- Necessitates standardized imaging protocols and blinded analysis to minimize observer variability.
- Involves optimization of compound dosing and incubation times based on solubility and stability in aqueous medium.
- Limited by biological variability between aortic segments, necessitating replicate testing for statistical confidence.
