Name: Extractie met een hoog molecuulgewicht Genomic DNA uit bodems en sedimenten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-10T20:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Leer een betrouwbare methode voor het isoleren van hoogmoleculair genomisch DNA uit bodemmonsters. Deze techniek maakt gedetailleerd onderzoek naar microbiële diversiteit en metabolisch potentieel in verschillende bodemlagen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen graag de Canadese Stichting voor Innovatie, de British Columbia Kennis Development Fund, Genome British Columbia en de British Columbia Ministerie van Bossen en Range bedanken voor de ondersteuning van lopende studies van de bosbodem productiviteit. SL werd ondersteund door een beurs van de TULA basis gefinancierd Centrum voor Microbiële diversiteit en evolutie.

Deel I: Extractie van DNA Procedure 1. 8 uur nodig zijn, voor de verwerking van zes monsters met uitzondering van de kwantificering van DNA. Voordat u begint met de winning, dan moet u vooraf-chill mortier, de stamper en spatel in een -20 ° C vriezer of met behulp van vloeibare stikstof. Ook pre-chill 50 ml buisjes met 20 ml chloroform isoamylalcohol (24:1) op ijs. Zet de hybridisatie oven voor op 65 ° C te verwarmen. Controleer CTAB oplossing, als het warm is gekristalliseerd tot 60 ° C om de kristallen te smelten. Vul de denaturering oplossing en extractie buffer door het toevoegen van de laatste ingrediënten net voordat je de extractie (zie recept hieronder) te starten. Voeren al extractieprocedures in een zuurkast. 2. Bereid de denatureren buffer en extractie buffer. Opmerking: Om de DNA-opbrengst te maximaliseren, is het essentieel om precies te maken buffers volgens de instructies. 3. Breng 2 g van de bodem in een pre-gekoelde mortel. Let op: bodem verzameld in het veld moeten worden bevroren op droog ijs voor transport en opgeslagen bij -80 ° C. Ontdooien en zeef bodem met behulp van een 2 mm zeef voor DNA-extractie. U kunt de basisbedrag van de grond tot 10 g. 4. Voeg 1 ml van de denaturering oplossing voor de bodem. 5. Freeze en maal de bodem in vloeibare N 2 met behulp van een stamper tot aan de bodemdeeltjes kijken poederachtige en homogeen is. Herhaal het invriezen en slijpen tweemaal. Let op: Houd de grond bevroren monster tijdens het malen, met behulp van vloeibare stikstof genoeg om volledig te dekken het grondmonster. Lichte smelten tijdens het slijpen is aanvaardbaar. 6. Overdracht van de grond grond om een ​​50 ml conische buis met behulp van een pre-gekoelde spatel. Opmerking: De begane grond monster kan worden opgeslagen bij -80 ° C op dit punt, indien nodig. 7. Voeg 9 ml extractie buffer. Aan de oplossing en bodem, vortex kort bij een lage snelheid mix. Opmerking: Om de buffer homogeen is, is het warm bij 60 ° C gedurende 10-15 minuten vóór gebruik. Houd de rest van de buffer bij 60 ° C gedurende de extractie. Vortex op snelheid 8 (op een schaal waar 10 is het maximum). 8. Incubeer 40 min bij 65 ° C in een hybridisatie oven. Tijdens de incubatie, continu draaien de buizen op de laagste snelheid, of voorzichtig omkeren van de buizen om de 10 minuten. Let op: horizontaal Plaats de buis in een hybridisatie oven om buffer aan de bodem contact over een groot oppervlak. De oplossing kan er een beetje stroperig tijdens de incubatie. 9. Centrifugeer bij 1800 x g, gedurende 10 minuten bij 10 - 14 ° C. Overdracht supernatans in de pre-gekoelde 50 ml conische buis met 20 ml chloroform-isoamylalcohol (24:1), te houden op ijs. Opmerking: Als u supernatant transfer, pas dan op dat van de organische laag (onderste laag) verstoren. Laat 1-2 ml supernatant als het nodig is om alleen schone supernatant te verzamelen. Je ziet vaak een beige laag (ongeveer 1-3 mm dik) op de top van het supernatant. Niet storen deze laag bij het ophalen van het supernatant. Probeer de tip glijden langs de buiswand om breuk van deze beige laag te voorkomen. Als het supernatant is te troebel, herhaal dan de chloroform-isoamylalcohol extractie nog een keer op het supernatant. Gebruik geen plastic wegwerp pipetten bij het overbrengen van chloroform, zoals chloroform zal het plastic smelten. Gebruik een glazen pipet, of een glas maatcilinder, of giet chloroform in 50 ml conische buizen. 10. Pak de bodem pellets twee keer; 10,1. Voeg 5 ml extractie buffer om de bodem te pellets, meng met 1 ml tip gevolgd door een korte vortexen bij lage snelheid. Let op: Schud en meng de buffer voor gebruik. 10,2. Incubeer bij 65 ° C gedurende 10 min in hybridisatie oven. Centrifugeer bij 1800 x g, gedurende 10 minuten bij 10 - 14 ° C. Overdracht supernatant aan de buis bij stap 9. Houd de tube met de verzamelde supernatant en chloroform-isoamylalcohol op het ijs tijdens de extractie. Opmerking: Zorg ervoor dat u de supernatant toevoegen aan dezelfde buis zonder kruising tussen het mengen van de monsters. 10,3. Herhalen 9.1 en 9.2 nog een keer. 11. Met behulp van een roterende plaat, heel voorzichtig rots de buis die de verzamelde supernatans (14-19 ml) en chloroform-isoamylalcohol op 1,25 rpm gedurende 10 minuten bevat. Let op: Sluit het deksel zeer strak om lekkage te voorkomen. Leg een papieren handdoek op de rockende plaat voordat u de buis, zodat eventuele lekken gemakkelijk kan worden gedetecteerd. 12. Centrifugeer bij 1800 x g, voor 20 min bij 10 - 14 ° C. 13. Overdracht waterige fase naar een nieuwe buis. Let op: Niet storen de interfase tussen de waterfase (bovenste laag) en de organische laag (onderlaag) wanneer u de supernatant overdracht. Laat ongeveer 1,5 tot 2 ml supernatant collectie van slechts schone supernatant te verzekeren. 14. Herstel de DNA met behulp van isopropylalcohol (stap 15.a - 21.a). U kunt ook Amicon ® Ultra-15 centrifugaalfilter Devices (stap 15.b - 21.b) als u zeer lage hoeveelheid biomassa in de steekproef, die nauwelijks zichtbaar zijn pellets zal produceren door isopropylalcohol neerslag die moeilijk te herstellen verwachten. 15.a. Plaats de supernatant naar een nieuwe buis ultracentrifuge. 16.a. Voeg isopropylalcohol om de verzamelde supernatant bij een volume verhouding van 0.6:1. Omgekeerde de buizen voorzichtig een paar keer om te mengen. 17.a Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. 18.a. Centrifugeer bij 16.000 x g, gedurende 20 min bij 20 - 25 ° C. Zorg ervoor dat de gewichten van alle buizen zijn goed in balans voor de centrifugatie stap. Let op: Mark de richting van de middelpuntvliedende kracht op de buis, zodat u de DNA-pellet makkelijker te detecteren wanneer de DNA-opbrengst is laag. 19.a. Verwijder isopropyl alcohol door decanteren of vacuüm afzuiging. Wees voorzichtig dat u de DNA pellet te verstoren. Opmerking: Verwijder isopropylalcohol zo snel centrifugeren is voltooid. Wees heel voorzichtig dat u de DNA pellet te verliezen. De grootte van de DNA-pellet kan sterk variëren, afhankelijk van het bodemtype, van een duidelijk zichtbaar (~ 9 mm diameter) tot nauwelijks zichtbaar. Het wordt aanbevolen om het residu van isopropylalcohol verwijderen door uitzuigen langs de wand van de buis voorzichtig om niet te zuigen uit de DNA-pellet. 20.a. Droog DNA pellet bij kamertemperatuur gedurende 5 - 20 min.. Let op: niet te droog DNA pellet, anders zal het moeilijk zijn om het DNA weer wordt opgelost. 21.a. Resuspendeer de DNA pellet in 200 ui TE. Meng het door zachtjes te tikken. Breng de DNA-oplossing in 1,5 ml buis. Houd de buis bij 4 ° C gedurende de nacht om volledig te ontbinden DNA. Opmerking: Afhankelijk van de grootte van korrel, kunt u het volume van TE aan te passen aan toe te voegen. Meestal 200 tot 400 ul van TE werkt goed. * U kunt ook de volgende stappen 15.b - 21.b. 15.b. Pre-wash een Amicon ® Ultra-15 centrifugaalfilter Devices, voeg 15 ml TE aan het apparaat en centrifugeer bij 3500 x g, gedurende 10 minuten. Gooi de flow-through. 16.b. Plaats de DNA-oplossing van stap 13 tot en met de pre-gewassen Amicon filter. Centrifugeer bij 3500 x g totdat het DNA volume is teruggebracht naar 200 - 500 pi. Gooi de flow-through. 17.b. Twee keer was de DNA met TE, voeg 10 ml TE aan de Amicon filter apparaten. Centrifugeer bij 3500 x g totdat het DNA volume is gereduceerd tot ongeveer 200 ul. Gooi de flow-through. Herhaal dit nog een keer. 18.b. Breng de DNA-oplossing op het filter om een ​​nieuwe 1,5 ml buis. 19.b. Voeg 40 ul TE aan de Amicon filter. Was beide zijden van het filter membranen door en neer te pipetteren om eventuele DNA-resten terug op het filter. Voeg deze wassen oplossing voor de buis bij stap 18.b. 20.b. Indien nodig, kan het DNA worden verder geconcentreerd door Microcon ® Ultracel YM-30 centrifugaalfilter Unit; het filter pre-wash door de toevoeging van 200 ul TE en centrifugeren bij 10000 x g voor 7 minuten. Voeg de DNA-oplossing op het filter en centrifugeer bij 5000 x g gedurende 1 minuut. Herhaal het centrifugeren totdat het bedrag van de DNA-oplossing op het filter teruggebracht tot 50 pi ongeveer. Let op: Maximaal eerste steekproef volume voor Microcon filter is 500 pi. Niet centrifuge bij snelheden meer dan 14000 x g. Niet meer dan centrifuge totdat het membraan droogt volledig. Ervoor te zorgen dat wat vloeistof nog steeds de filter dekt na het centrifugeren. Als u over gecentrifugeerd en het membraan droog is, voeg dan 15 ul TE, schud zachtjes gedurende 30 seconden, en ga verder met stap 21.b. 21.b. Plaats het filter op zijn kop in een nieuw Microcon buis en centrifugeer bij 1000 xg gedurende 3 minuten aan het DNA te herstellen. 22. Kwantificeren DNA door TAE-gel (0,8%, 0.5xTAE, 50 V voor 4 uur), en door Nanodrop spectrofotometer of Pico-groen-test en de plaat lezer. Let op: DNA bedrag kan worden geschat door het vergelijken van het monster band naar de marker band met een bekende concentratie (High moleculaire DNA-merker of λHindIII) op de gel. 23. Controleer de integriteit van hoog moleculair gewicht DNA met behulp van Pulsed Field Gel Elektroforese (PFGE) met 1%, 1xTAE gel (Voor meer details zie de Step II, part2 op <a href="https://www.jove.com/index/details.stp?id=1387">https://www.jove.com/index/details.stp?id = 1387</a> , doi: 10.3791/1387 door Taupp et al. 2009).. Opmerking: U kunt regelmatig agarose gel gebruiken voor dit doel, QC, in plaats van laagsmeltende agarose. Kortom, elektroforese condities zijn als volgt: 2-250 kb, 6 volt, de eerste schakeltijd: 5 sec, laatste schakeltijd: 15 sec, lopen 12 uur bij 14 ° C. SYBR Goud kleuring voor een uur aan het DNA te visualiseren op de gel. 24. Als het molecuulgewicht van geëxtraheerde DNA bevredigend zijn, ga dan naar de volgende CsCl gradiënt centrifuge stap. Als alternatief kan DNA worden bewaard bij -20 ° C of -80 ° C voor de CsCl centrifuge. De mediane grootte van de DNA moeten zijn gelijk aan of meer bedragen dan 36 Kb, als je wilt een grote voegen metagenomic DNA-bibliotheek te bouwen. Deel II. DNA-zuivering met behulp van cesium chloride gradiënt ultracentrifugatie Voorbereiding van de centrifuge: 1,5 - 2 uur Centrifugatie stap: 18 uur Het verwijderen van ethidiumbromide (EtBr) en het concentreren van DNA na het centrifugeren: 3 uur Procedure Voor meer informatie, zie Wright et al.. . 2009 <a href="https://www.jove.com/index/details.stp?id=1352">https://www.jove.com/index/details.stp?id=1352</a> , doi: 10.3791/1352 Vertegenwoordiger Resultaten / Resultaat Het totale bedrag van genomisch DNA geïsoleerd uit 2 g van de bosbodem organische (O horizon) en minerale horizonten (Ae, AB, en Bt horizon) (bemonsterd uit de Long Term Soil Productiviteit (LTSP) site gelegen aan Skulow meer, BC, Canada en beheerd door BC Ministerie van bossen en Range) varieerde van 10 mg tot 180 mg. De mediane grootte van de geïsoleerde DNA was meestal tussen 40 - 60 kb (Figuur 1). De verhouding van de absorptie bij 260 nm nm/280 was tussen 1,3-1,6 en er was een piek bij 230 nm, die humuszuur besmetting vaak waargenomen in bodemmonsters kunnen wijzen. De CsCl gradiënt centrifugatie drastisch verminderd deze verontreiniging en verhoogde ook de verhouding van 260/280 naar 1,8 tot 1,9 zoals weergegeven in Figuur 2a en 2b. <img src="/files/ftp_upload/1569/1569fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1. PFGE foto&#39;s van de geëxtraheerde genomische DNA voor CsCl ultracentrifugatie. lane1: 1 kb marker 100 ng, laan 2: λHind III marker 100 ng, baan 3: λHind III marker 250 ng, laan 4: λHind III marker 500 ng, lane5: Fosmid 36 kb marker 100 ng, baan 6 en 7: genomische DNA geïsoleerd uit de minerale bodem horizon Ae, baan 8 en 9: genomisch DNA geïsoleerd uit de minerale bodem horizon AB op de LTSP site gelegen Skulow meer, BC <img src="/files/ftp_upload/1569/1569fig2tmb.jpg" alt="Figuur 2" border="0" /> Figuur 2. Chromograms van genomisch DNA gedetecteerd door spectrofotometer voor (A) en na CsCl ultracentrifuge (B). Let op de vermindering van de absorptie waarde bij de 230 nm golflengte na CsCl ultracentrifugatie, die verbetering van de genomische DNA kwaliteit aangeeft. Gelieve <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/1569/1569fig2.jpg">Klik hier</a> voor een grotere versie van figuur 2 te zien.

<ol><li>Hurt, R. A., Qiu, X., Wu, L., Roh, Y., Palumbo, A. V., Tiedje, J. M., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+recovery+of+RNA+and+DNA+from+soils+and+sediments%5BTitle%5D)+AND+%22AEM%22%5BJournal%5D)">Simultaneous recovery of RNA and DNA from soils and sediments.</a> AEM. 67 (10), 4495-4503 (2001).</li>
<li>Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+extraction+from+0.22+%CE%BCM+Sterivex+filters+and+cesium+chloride+density+gradient+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">DNA extraction from 0.22 μM Sterivex filters and cesium chloride density gradient centrifugation.</a> JoVE. , (2009).</li>
<li>Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+insert+environmental+genomic+library+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Large insert environmental genomic library production.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
</ol>

Recept * Denatureren oplossing 4 M Guanidine isothiocyanate 10 mM Tris-HCl (pH 7,0) 1 mM EDTA 0,5% 2-mercapto-ethanol <table border="0" style="font-size:9pt; width:400px;"><tr><td colspan="2"> Denatureren oplossing: 10 ml in totaal </td></tr><tr><td> Guanidine isothiocyanaat (MW 118,16) </td><td> 4,73 g </td></tr><tr><td> 1 M Tris-HCl (pH 7,0) </td><td> 100 pi </td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA </td><td> 20 pl </td></tr><tr><td colspan="2"> Voeg water toe tot 9,95 ml in totaal. </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclaaf. </td></tr><tr><td colspan="2"> Voeg 50 pi 2-mercapto-ethanol vlak voor gebruik. (5 ul van 2-mercapto-ethanol per 1 ml denatureren Solution) Let op: Houd de denaturering oplossing bij 4 ° C. Gebruik geen buffer ouder dan een week. Indien mogelijk, het maken van verse buffer te gebruiken. </td></tr></table> ** Extractiebuffer 100 mM natriumfosfaat buffer [pH 7,0] 100 mM Tris-HCl [pH 7,0] 100 mM EDTA [pH 8,0] 1,5 M NaCl 1% Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) 2% SDS <table border="0" style="font-size:9pt; width:400px;"><tr><td colspan="2"> Extractiebuffer voor 1 L in totaal </td></tr><tr><td> 1M natriumfosfaatbuffer [pH 7,0] * </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> 1 M Tris-HCl [pH 7,0] </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA [pH 8,0] </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> 5 M NaCl </td><td> 300 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclaaf en bewaren bij kamertemperatuur. </td></tr><tr><td colspan="2"> Voeg 200 ml, 5% Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB, geautoclaveerd) en 100 ml, 20% SDS (autoclaaf) net vóór gebruik. Als CTAB werd gekristalliseerd, het smelt bij 60 ° C. * 1M natriumfosfaatbuffer: 57,7 ml, 1M natrium monobasisch (NaH 2 PO 4) en 42,3 ml, 1M Dibasisch (NaH 2 PO 4). Pas de pH tot 7,0 Let op: Gebruik geen 20% SDS als deze neerslag. Het is normaal om te zien melkachtige suspensie als je SDS toe te voegen aan de oplossing. Zodra u SDS, plaatst de extractie buffer bij 60 ° C om ervoor te zorgen SDS is goed opgeschort. </td></tr></table>

extractie met een hoog molecuulgewicht genomic dna uit bodems en sedimenten

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

De bodem microbioom is een groot en relatief onontgonnen reservoir van genomische diversiteit en metabole innovatie die nauw is verbonden met voedingsstoffen en energie stromen binnen terrestrische ecosystemen. Teelt-onafhankelijke milieu-genoom, ook wel bekend als metagenomic, benaderingen beloven een ongekende toegang tot deze genetische informatie met betrekking tot de pad wederopbouw en functionele screening voor hoogwaardige therapeutische en biomassa conversie processen. Echter, de bodem microbioom blijft nog steeds een uitdaging grotendeels te wijten aan de moeilijkheid bij het verkrijgen van een hoog moleculair gewicht DNA van voldoende kwaliteit zijn voor grote insert bibliotheek productie. Hier introduceren we een protocol voor de extractie van een hoog moleculair gewicht, microbiële gemeenschap genomisch DNA uit bodems en sedimenten. De kwaliteit van de geïsoleerde genomisch DNA is ideaal voor de aanleg van grote insert milieu genome bibliotheken voor downstream-sequencing en screening toepassingen. De procedure begint met cel lysis. Celwanden en membranen van micro-organismen worden gelyseerd door zowel mechanische (slijpen) en chemische krachten (β-mercapto-ethanol). Genomisch DNA wordt vervolgens geïsoleerd met behulp extractiebuffer, chloroform-isoamylalcohol en isopropyl alcohol. De buffers gebruikt voor de lysis en de winning stappen omvatten guanidine isothiocyanaat en hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) om de integriteit van het hoge moleculair gewicht genomisch DNA te behouden. Afhankelijk van uw downstream toepassing, kan het geïsoleerde genomisch DNA verder worden gezuiverd met behulp van cesium chloride (CSCL) gradiënt ultracentrifugatie, die verontreinigingen, zoals humuszuren vermindert. De eerste procedure, extractie, duurt ongeveer acht uur, met uitzondering van DNA kwantificering stap. De CsCl gradiënt ultracentrifugatie, is een proces van twee dagen. Gedurende de gehele procedure, genomisch DNA moet voorzichtig behandeld worden om afschuiven te voorkomen, te vermijden ernstige vortexen, en repetitieve hard pipetteren.

Een methodiek om hoog moleculair gewicht en de hoge kwaliteit van genomisch DNA te isoleren uit de bodem microbiële gemeenschap wordt beschreven.

Extractie met een hoog molecuulgewicht Genomic DNA uit bodems en sedimenten

Het bodemmicrobioom is een enorm en relatief onontgonnen reservoir van genomische diversiteit en metabole innovatie dat nauw verbonden is met ...

Hallo, ik ben San Lee uit het laboratorium van Stephen Harlem van de afdeling Microbiologie en Immunologie aan de University of British Columbia. Vandaag tonen we u een procedure voor de extractie van genomisch DNA met een hoog moleculair gewicht uit bosbodems, die ook toepasbaar is op een breed scala aan bodem- en sedimenttypen. We gebruiken genomisch DNA met een hoog moleculair gewicht om de forest meter library van bodemmicrobiële gemeenschappen te construeren.Met deze bibliotheken in hand kunnen we de diversiteit en het metabolische potentieel bestuderen van microbiële gemeenschappen die verdeeld zijn over verschillende bodemhorizonnen. Laten we beginnen. Dit protocol start met cellyse.De eerste stap is het completeren van de denaturerende buffer door betta mer capto ethanol toe te voegen tot een concentratie van 0,5%. Voor het beste resultaat dient de denaturerende oplossing elke keer vers te worden bereid. Gebruik alternatief een buffer die minder dan een week oud is en bewaard is bij vier graden Celsius. Voor de volgende stap heeft u een houder met vloeibare stikstof, een autoclaaf en een vooraf gekoelde vijzel met stamper en spatel nodig.Plaats een bevroren bodemmonster van twee gram in de vooraf gekoelde vijzel. Voeg één milliliter van de denatureringsoplossing toe. Voeg vervolgens vloeibare stikstof toe om de bodem volledig te bedekken.Gebruik een vooraf gekoelde stamper om het monster te vermalen totdat de bodemdeeltjes poederachtig en homogeen ogen en het monster begint te smelten. Voeg vervolgens meer vloeibare stikstof toe en herhaal de malingsstap. Hiermee is de stap van cellysis met een vooraf gekoelde spatel voltooid.Breng het gemalen monster over naar een conische buis van 50 milliliter. Houd het monster op ijs om onmiddellijk over te gaan naar de DNA-extractiestap of bewaar het bij minus 80 degrees Celsius. Voor later gebruik: voeg vlak voor aanvang van de DNA-extractie hexadecyltrimethylammoniumbromide of CTAB en SDS toe om de extractiebuffer te voltooien.Controleer of het CTAB is gekristalliseerd en los het, indien nodig, op bij 60 °C voordat u verdergaat. Voeg het vervolgens toe aan de oplossing voor een totale concentratie van 1%. Voeg daarna 20% SDS-oplossing toe tot een eindconcentratie van 2%. De melkachtige suspensie die zich vormt, is normaal.Zodra het SDS is toegevoegd, dient het voltooide extractiebuffer homogeen gehouden te worden door deze na 10 tot 15 minuten op 60 °C te bewaren. Wanneer de extractiebuffer volledig is opgelost en homogeen is, voegt u negen milliliter extractiebuffer toe aan het bodemmonster en vortexest u dit kort op lage snelheid om te mengen. Incubeer het monster met de extractiebuffer gedurende 40 minuten in een hybridisatieoven van 65 °C.Keer de buisjes tijdens de incubatie elke 10 minuten voorzichtig om of roteer de buisjes continu op de laagste snelheid van de rotor. Na de incubatie kan de oplossing enigszins viskeus lijken. De volgende stap is het gebruik van chloroform-isoamylalcohol om het DNA te zuiveren van het organische materiaal in het lysismengsel.Begin met het centrifugeren van de sample gedurende 10 minuten bij 1800 Gs bij ongeveer 10 tot 14 °C in de zuurkast; verzamel het DNA-bevattende supernatant door de pipetpunt voorzichtig langs de wand van de buis te schuiven, waarbij de beige laag aan de bovenkant en de organische laag aan de onderkant worden vermeden. Breng het supernatant over naar een vooraf gekoelde buis van 50 milliliter die 20 milliliters chloroform-isoamylalcohol bevat. Herhaal vervolgens het extractieproces nog twee keer op dezelfde sample. Houd het DNA-extract en de chloroform-isoamylalcohol ondertussen op ijs in de zuurkast.Voer voor de tweede DNA-extractie opnieuw de bewerking uit op de buis met het bodemsediment en de resterende extractiebuffer en voeg nog eens vijf milliliter extractiebuffer toe. Roer voorzichtig met een tip van één milliliter om te mengen en vortex kort om het sediment opnieuw te resuspenderen, zoals eerder gedaan. Incubeer ditmaal 10 minuten bij 65 °C.Centrifugeer vervolgens bij 1800 Gs gedurende 10 minuten. Breng de supernatant bij een temperatuur van ongeveer 10 tot 14 °C in de zuurkast over naar de buis die chloroform, isoamylalcohol of chloroform i a a en de supernatant van de vorige extractie bevat. Herhaal het volledige extractieproces nogmaals om zoveel mogelijk DNA uit het bodemmonster te extraheren.Wanneer u in totaal drie extracties op uw bodemmonster heeft uitgevoerd, schudt u de buis met het verzamelde supernatant en chloroform zeer voorzichtig 10 minuten lang op een rotatieplaat met 1.25 RRP m. Centrifugeer de buis na deze mengstap 20 minuten bij 1800 Gs bij ongeveer 10 tot 14 °C. Draag na centrifugatie de waterige fase voorzichtig over naar een nieuwe ultracentrifugebuis, waarbij u één tot twee milliliter SNAT achterlaat om te voorkomen dat de interface tussen de waterige en organische fasen wordt verstoord. Voeg nu 0,6 milliliter isopropylalcohol toe om het DNA te laten neerslaan.Inverteer de buizen met elke milliliter verzameld supernatant voorzichtig een paar keer om te mengen. Op dit punt is het mogelijk dat het DNA neerslaat in lange draden. Incubeer het DNA vervolgens 30 minuten bij kamertemperatuur met het isopropanol.Na de incubatie is het tijd om het DNA door middel van centrifugatie te pelleten. Markeer een hoek van de buis terwijl u deze in de centrifuge plaatst, zodat u weet waar u het DNA-pellet kunt verwachten. Centrifugeer bij 16.000 GS gedurende 20 minuten bij 20 tot 25 °C. Verwijder na centrifugatie de isopropanol door deze af te gieten en/of met een vacuümsysteem af te zuigen. Let erop dat u het DNA-pellet niet verliest; de grootte hiervan varieert van nauwelijks zichtbaar tot negen millimeter breed, afhankelijk van de extractie-efficiëntie en de biomassa in de bodemmonsters. Droog het DNA-pellet gedurende vijf tot 20 minuten bij kamertemperatuur. Let op dat u het pellet niet te ver uitdroogt zodra het droog is.Resuspendeer het DNA in 200 tot 400 µL TE. Meng dit door voorzichtig op de buis te tikken. Breng de DNA-oplossing over naar een buisje van 1,5 ml.Bewaar het DNA gedurende de nacht bij vier graden Celsius. Om het DNA volledig op te lossen nadat het uit het bodemmonster is geëxtraheerd, zijn de resterende stappen voor het controleren van de concentratie en de DNA-integriteit van het monster standaardprocedures, die in detail worden beschreven in een ander JoVE-protocol van het laboratorium van Hallam. Bepaal de DNA-concentratie met de methode naar keuze.Controleer daarnaast de integriteit van het DNA met een hoog molecuulgewicht door 10 tot 20 µL van uw DNA-monster te analyseren via pulsed field gel electrophoresis of PFGE. De mediane DNA-grootte moet 36 kb of groter zijn, afhankelijk van uw verdere toepassing. Ga over naar de volgende stap met cesiumchloride-gradiëntcentrifugatie; alternatief kan het DNA worden bewaard bij -20 °C of -80 °C vóór de ultracentrifugatie.De volgende stap is het gebruik van cesiumchloride-gradiëntcentrifugatie om het DNA verder te zuiveren door onzuiverheden te verwijderen, gevolgd door de concentratie en verdere zuivering van het DNA met behulp van AmCon- en MicroCon-centrifugale filterapparaten. De cesiumchloride-gradiëntcentrifugatie is essentieel voor het verkrijgen van hoogwaardig DNA en wordt in detail beschreven in een ander JoVE-protocol van het Hallam-laboratorium. Controleer na het uitvoeren van de cesiumchloride-gradiëntcentrifugatie en de concentratiestappen de DNA-concentratie met de door u gekozen methode.Controleer vervolgens opnieuw de integriteit van het DNA met een hoog moleculair gewicht door een kleine hoeveelheid van het DNA via PFGE te analyseren. De totale hoeveelheid genomisch DNA geïsoleerd uit twee gram geforceerde bodem varieert van 10 tot 180 microgram, zoals te zien is op de gelrun vóór en na cesiumchloride-ultracentrifugatie. De grootte van het geïsoleerde DNA ligt gewoonlijk tussen de 40 en 60 kilobases; hier wordt een chromatogram van genomische DNA-monsters vóór en na cesiumchloride-ultracentrifugatie getoond.Deze stap verbetert de zuiverheid van het DNA, waarbij de 260/280-ratio stijgt van 1,3 tot 1,6 voorafgaand aan de stap, naar 1,8 tot 1,9 erna. Bovendien werd de piekabsorptie bij 230 nanometer, wat duidt op contaminatie met humuszuur, na centrifugatie succesvol verminderd. We hebben u zojuist laten zien hoe u hoogmoleculair genomisch DNA kunt isoleren uit bodemmicrobiële gemeenschappen.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de extractie- en denaturatiebuffer nauwkeurig volgens de instructies moet worden bereid. Wees voorzichtig en raak het DNA-pellet niet aan na precipitatie met isopropylalcohol. Wanneer u de DNA-band terugwint na chloridegradiëntcentrifugatie.Vergeet niet om de spuit te spoelen met de TE om het DNA-herstel te maximaliseren. Controleer tot slot de kwantiteit en kwaliteit van het geïsoleerde DNA bij alle voorgestelde stappen. Dat is alles.Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experiment.

extraction-high-molecular-weight-genomic-dna-from-soils

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We beschrijven een methode voor de extractie van een hoog moleculair gewicht genomische DNA van plankton biomassa geconcentreerd op 0,22 micrometer Sterivex filters, gevolgd door een cesium chloride dichtheidsgradiënt centrifugatie voor zuivering.

DNA-extractie van 0,22 uM Sterivex Filters en Cesium Chloride dichtheidsgradiënt centrifugatie

Deze video toont het protocol voor DNA-extractie van formaline gefixeerde in paraffine ingebedde materiaal. Dit is een multi-dagen procedure waarbij weefsel secties worden ontdaan met xyleen, gerehydrateerd met ethanol en behandeld met proteinase K te zuiveren en DNA te isoleren voor latere gen-specifieke of genome-wide analyse.

DNA-extractie van paraffine Embedded materiaal voor genetische en epigenetische Analyses

Wij bieden een verbeterde protocol voor de extractie van een hoog moleculair gewicht DNA van hypersaline microbiële matten. Microbiële cellen worden gescheiden van de mat matrix voorafgaand aan de DNA-extractie en zuivering. Dit verhoogt de concentratie, de kwaliteit en de grootte van het DNA. Het protocol kan worden gebruikt voor andere vuurvaste monsters.

Extractie met een hoog molecuulgewicht DNA van microbiële matten

DNA-extractie uit speeksel kan een gemakkelijk beschikbare bron van DNA met een hoog moleculair gewicht leveren, met weinig tot geen degradatie/fragmentatie. Dit protocol biedt geoptimaliseerde parameters voor speekselverzameling/opslag en DNA-extractie om van voldoende kwaliteit en kwantiteit te zijn voor downstream DNA-tests met hoge kwaliteitseisen.

En extractie van speeksel DNA voor Next Generation Sequencing

De cryosfeer biedt toegang tot bewaarde organismen die bleef onder het verleden omgevingsomstandigheden. Een protocol wordt gepresenteerd te verzamelen en te ontsmetten permafrost kernen van de bodem en ijs. De afwezigheid van exogeen DNA kolonies en suggereren dat microorganismen gedetecteerd vertegenwoordigt de theorie en minder contaminatie door boren of verwerking.

Verwijdering van exogene materialen uit het buitenste gedeelte van Frozen Cores tot de Oude Biologische Gemeenschappen koesterde Inside Onderzoek

Hier wordt een methode beschreven voor de extractie, zuivering en kwaliteitscontrole van genomisch DNA van de obligate biotrofe schimmelpathogeen, echte meeldauw, voor gebruik in genoomsequencing met lange reads.

Zuivering van hoog molecuulgewicht Genomic DNA van echte meeldauw voor Long-Read Sequencing

Hier beschrijven we een protocol om amplicon reeks gegevens van bodem, rhizosfeer en wortel endosphere microbiomes te verkrijgen. Deze informatie kan worden gebruikt voor het onderzoeken van de samenstelling en de diversiteit van de plant-geassocieerde microbiële gemeenschappen, en is geschikt voor het gebruik met een breed scala van plantensoorten.

Verkennen van de wortel Microbiome: extraheren van gegevens van de bacteriële Gemeenschap uit de bodem, de rhizosfeer, en de wortel Endosphere

Hier presenteren we een eenvoudige techniek om antimicrobiële resistentie in het milieu (AMR) te beoordelen door het aandeel extracellulair DNA met een laag moleculair gewicht te verbeteren. Voorafgaande behandeling met 20%-30% PEG en 1,2 M NaCl maakt detectie van zowel genomische als horizontaal overgedragen AMR-genen mogelijk. Het protocol leent zich voor een kit-vrij proces met extra optimalisatie.

Verbeterde extractie van DNA met een laag moleculair gewicht uit afvalwater voor uitgebreide beoordeling van antimicrobiële resistentie 

Dit protocol beschrijft de CTAB-methode om hoogwaardige DNA uit mycobacteriën te extraheren, waarbij de uitdagingen van hun harde, mycolinezuurrijke celwanden worden overwonnen. Het proces omvat enzymatische vertering, cellysie met CTAB en DNA-zuivering door organische extractie en ethanolprecipitatie. Deze methode produceert DNA dat geschikt is voor moleculaire studies en is betrouwbaar voor mycobacterieel onderzoek.

Extractie van het volledige genoom van deoxyribonucleïnezuur uit Mycobacterium-soorten via de Cetyltrimethylammoniumbromide-techniek

Isolatie van Genomic DNA van muis Tails

Leer een betrouwbare methode voor het isoleren van hoogmoleculair genomisch DNA uit bodemmonsters. Deze techniek maakt gedetailleerd onderzoek naar microbiële diversiteit en metabolisch potentieel in verschillende bodemlagen mogelijk.

Extractie met een hoog molecuulgewicht Genomic DNA uit bodems en sedimenten

Meer video's verkennen