Extractie met een hoog molecuulgewicht Genomic DNA uit bodems en sedimenten
10 november 2009
Een methodiek om hoog moleculair gewicht en de hoge kwaliteit van genomisch DNA te isoleren uit de bodem microbiële gemeenschap wordt beschreven.
Hallo, ik ben San Lee uit het laboratorium van Stephen Harlem van de afdeling Microbiologie en Immunologie aan de University of British Columbia. Vandaag tonen we u een procedure voor de extractie van genomisch DNA met een hoog moleculair gewicht uit bosbodems, die ook toepasbaar is op een breed scala aan bodem- en sedimenttypen. We gebruiken genomisch DNA met een hoog moleculair gewicht om de forest meter library van bodemmicrobiële gemeenschappen te construeren.
Met deze bibliotheken in hand kunnen we de diversiteit en het metabolische potentieel bestuderen van microbiële gemeenschappen die verdeeld zijn over verschillende bodemhorizonnen. Laten we beginnen. Dit protocol start met cellyse.
De eerste stap is het completeren van de denaturerende buffer door betta mer capto ethanol toe te voegen tot een concentratie van 0,5%. Voor het beste resultaat dient de denaturerende oplossing elke keer vers te worden bereid. Gebruik alternatief een buffer die minder dan een week oud is en bewaard is bij vier graden Celsius. Voor de volgende stap heeft u een houder met vloeibare stikstof, een autoclaaf en een vooraf gekoelde vijzel met stamper en spatel nodig.
Plaats een bevroren bodemmonster van twee gram in de vooraf gekoelde vijzel. Voeg één milliliter van de denatureringsoplossing toe. Voeg vervolgens vloeibare stikstof toe om de bodem volledig te bedekken.
Gebruik een vooraf gekoelde stamper om het monster te vermalen totdat de bodemdeeltjes poederachtig en homogeen ogen en het monster begint te smelten. Voeg vervolgens meer vloeibare stikstof toe en herhaal de malingsstap. Hiermee is de stap van cellysis met een vooraf gekoelde spatel voltooid.
Breng het gemalen monster over naar een conische buis van 50 milliliter. Houd het monster op ijs om onmiddellijk over te gaan naar de DNA-extractiestap of bewaar het bij minus 80 degrees Celsius. Voor later gebruik: voeg vlak voor aanvang van de DNA-extractie hexadecyltrimethylammoniumbromide of CTAB en SDS toe om de extractiebuffer te voltooien.
Controleer of het CTAB is gekristalliseerd en los het, indien nodig, op bij 60 °C voordat u verdergaat. Voeg het vervolgens toe aan de oplossing voor een totale concentratie van 1%. Voeg daarna 20% SDS-oplossing toe tot een eindconcentratie van 2%. De melkachtige suspensie die zich vormt, is normaal.
Zodra het SDS is toegevoegd, dient het voltooide extractiebuffer homogeen gehouden te worden door deze na 10 tot 15 minuten op 60 °C te bewaren. Wanneer de extractiebuffer volledig is opgelost en homogeen is, voegt u negen milliliter extractiebuffer toe aan het bodemmonster en vortexest u dit kort op lage snelheid om te mengen. Incubeer het monster met de extractiebuffer gedurende 40 minuten in een hybridisatieoven van 65 °C.
Keer de buisjes tijdens de incubatie elke 10 minuten voorzichtig om of roteer de buisjes continu op de laagste snelheid van de rotor. Na de incubatie kan de oplossing enigszins viskeus lijken. De volgende stap is het gebruik van chloroform-isoamylalcohol om het DNA te zuiveren van het organische materiaal in het lysismengsel.
Begin met het centrifugeren van de sample gedurende 10 minuten bij 1800 Gs bij ongeveer 10 tot 14 °C in de zuurkast; verzamel het DNA-bevattende supernatant door de pipetpunt voorzichtig langs de wand van de buis te schuiven, waarbij de beige laag aan de bovenkant en de organische laag aan de onderkant worden vermeden. Breng het supernatant over naar een vooraf gekoelde buis van 50 milliliter die 20 milliliters chloroform-isoamylalcohol bevat. Herhaal vervolgens het extractieproces nog twee keer op dezelfde sample. Houd het DNA-extract en de chloroform-isoamylalcohol ondertussen op ijs in de zuurkast.
Voer voor de tweede DNA-extractie opnieuw de bewerking uit op de buis met het bodemsediment en de resterende extractiebuffer en voeg nog eens vijf milliliter extractiebuffer toe. Roer voorzichtig met een tip van één milliliter om te mengen en vortex kort om het sediment opnieuw te resuspenderen, zoals eerder gedaan. Incubeer ditmaal 10 minuten bij 65 °C.
Centrifugeer vervolgens bij 1800 Gs gedurende 10 minuten. Breng de supernatant bij een temperatuur van ongeveer 10 tot 14 °C in de zuurkast over naar de buis die chloroform, isoamylalcohol of chloroform i a a en de supernatant van de vorige extractie bevat. Herhaal het volledige extractieproces nogmaals om zoveel mogelijk DNA uit het bodemmonster te extraheren.
Wanneer u in totaal drie extracties op uw bodemmonster heeft uitgevoerd, schudt u de buis met het verzamelde supernatant en chloroform zeer voorzichtig 10 minuten lang op een rotatieplaat met 1.25 RRP m. Centrifugeer de buis na deze mengstap 20 minuten bij 1800 Gs bij ongeveer 10 tot 14 °C. Draag na centrifugatie de waterige fase voorzichtig over naar een nieuwe ultracentrifugebuis, waarbij u één tot twee milliliter SNAT achterlaat om te voorkomen dat de interface tussen de waterige en organische fasen wordt verstoord. Voeg nu 0,6 milliliter isopropylalcohol toe om het DNA te laten neerslaan.
Inverteer de buizen met elke milliliter verzameld supernatant voorzichtig een paar keer om te mengen. Op dit punt is het mogelijk dat het DNA neerslaat in lange draden. Incubeer het DNA vervolgens 30 minuten bij kamertemperatuur met het isopropanol.
Na de incubatie is het tijd om het DNA door middel van centrifugatie te pelleten. Markeer een hoek van de buis terwijl u deze in de centrifuge plaatst, zodat u weet waar u het DNA-pellet kunt verwachten. Centrifugeer bij 16.000 GS gedurende 20 minuten bij 20 tot 25 °C. Verwijder na centrifugatie de isopropanol door deze af te gieten en/of met een vacuümsysteem af te zuigen. Let erop dat u het DNA-pellet niet verliest; de grootte hiervan varieert van nauwelijks zichtbaar tot negen millimeter breed, afhankelijk van de extractie-efficiëntie en de biomassa in de bodemmonsters. Droog het DNA-pellet gedurende vijf tot 20 minuten bij kamertemperatuur. Let op dat u het pellet niet te ver uitdroogt zodra het droog is.
Resuspendeer het DNA in 200 tot 400 µL TE. Meng dit door voorzichtig op de buis te tikken. Breng de DNA-oplossing over naar een buisje van 1,5 ml.
Bewaar het DNA gedurende de nacht bij vier graden Celsius. Om het DNA volledig op te lossen nadat het uit het bodemmonster is geëxtraheerd, zijn de resterende stappen voor het controleren van de concentratie en de DNA-integriteit van het monster standaardprocedures, die in detail worden beschreven in een ander JoVE-protocol van het laboratorium van Hallam. Bepaal de DNA-concentratie met de methode naar keuze.
Controleer daarnaast de integriteit van het DNA met een hoog molecuulgewicht door 10 tot 20 µL van uw DNA-monster te analyseren via pulsed field gel electrophoresis of PFGE. De mediane DNA-grootte moet 36 kb of groter zijn, afhankelijk van uw verdere toepassing. Ga over naar de volgende stap met cesiumchloride-gradiëntcentrifugatie; alternatief kan het DNA worden bewaard bij -20 °C of -80 °C vóór de ultracentrifugatie.
De volgende stap is het gebruik van cesiumchloride-gradiëntcentrifugatie om het DNA verder te zuiveren door onzuiverheden te verwijderen, gevolgd door de concentratie en verdere zuivering van het DNA met behulp van AmCon- en MicroCon-centrifugale filterapparaten. De cesiumchloride-gradiëntcentrifugatie is essentieel voor het verkrijgen van hoogwaardig DNA en wordt in detail beschreven in een ander JoVE-protocol van het Hallam-laboratorium. Controleer na het uitvoeren van de cesiumchloride-gradiëntcentrifugatie en de concentratiestappen de DNA-concentratie met de door u gekozen methode.
Controleer vervolgens opnieuw de integriteit van het DNA met een hoog moleculair gewicht door een kleine hoeveelheid van het DNA via PFGE te analyseren. De totale hoeveelheid genomisch DNA geïsoleerd uit twee gram geforceerde bodem varieert van 10 tot 180 microgram, zoals te zien is op de gelrun vóór en na cesiumchloride-ultracentrifugatie. De grootte van het geïsoleerde DNA ligt gewoonlijk tussen de 40 en 60 kilobases; hier wordt een chromatogram van genomische DNA-monsters vóór en na cesiumchloride-ultracentrifugatie getoond.
Deze stap verbetert de zuiverheid van het DNA, waarbij de 260/280-ratio stijgt van 1,3 tot 1,6 voorafgaand aan de stap, naar 1,8 tot 1,9 erna. Bovendien werd de piekabsorptie bij 230 nanometer, wat duidt op contaminatie met humuszuur, na centrifugatie succesvol verminderd. We hebben u zojuist laten zien hoe u hoogmoleculair genomisch DNA kunt isoleren uit bodemmicrobiële gemeenschappen.
Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de extractie- en denaturatiebuffer nauwkeurig volgens de instructies moet worden bereid. Wees voorzichtig en raak het DNA-pellet niet aan na precipitatie met isopropylalcohol. Wanneer u de DNA-band terugwint na chloridegradiëntcentrifugatie.
Vergeet niet om de spuit te spoelen met de TE om het DNA-herstel te maximaliseren. Controleer tot slot de kwantiteit en kwaliteit van het geïsoleerde DNA bij alle voorgestelde stappen. Dat is alles.
Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experiment.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een methodologie voor het isoleren van genomisch DNA met een hoog molecuulgewicht uit microbiële bodemgemeenschappen. De procedure is toepasbaar op diverse soorten bodems en sedimenten, wat de studie van microbiële diversiteit en het metabole potentieel mogelijk maakt.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Microbiologie
- Genomica
- Milieukunde
Achtergrond
- Genomisch DNA met een hoog molecuulgewicht is essentieel voor het bestuderen van microbiële gemeenschappen.
- Microbiële gemeenschappen in de bodem spelen een belangrijke rol in ecosysteemfuncties.
- Inzicht in de microbiële diversiteit kan bijdragen aan praktijken voor milieubeheer.
- Huidige methoden isoleren mogelijk geen hoogwaardig DNA uit de bodem op een effectieve manier.
Doel van de studie
- Om een betrouwbaar protocol te ontwikkelen voor het extraheren van genomisch DNA met een hoog molecuulgewicht.
- Om de constructie van bibliotheken voor het bestuderen van microbiële gemeenschappen te faciliteren.
- Om het begrip van de microbiële diversiteit in verschillende bodemhorizons te vergroten.
Gebruikte methoden
- Cellysis om DNA uit microbiële cellen vrij te maken.
- Isolatie van genomisch DNA met een hoog molecuulgewicht.
- Toepassing van de methode op diverse bodemtypes.
- Constructie van bosmeter-bibliotheken voor analyse.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle extractie van hoogwaardig genomisch DNA uit bodemmonsters.
- De geconstrueerde bibliotheken bieden inzicht in de microbiële diversiteit.
- Methode is toepasbaar op een breed scala aan bodem- en sedimenttypen.
- Faciliteert verder onderzoek naar het microbiële metabole potentieel.
Conclusies
- De ontwikkelde methodologie is effectief voor het isoleren van genomisch DNA.
- Extractie van DNA met een hoog molecuulgewicht is cruciaal voor microbiologische studies.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze bevindingen om de microbiële ecologie te verkennen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Toegang tot genomisch DNA met een hoog moleculair gewicht uit complexe milieu-monsters maakt de constructie van metagenomische bibliotheken met grote inserts mogelijk voor functionele screening en het ontdekken van metabole routes. Deze mogelijkheid ondersteunt de identificatie van targets en de generatie van leads bij de ontdekking van geneesmiddelen uit natuurproducten door toegang te bieden tot het metabole potentieel van niet-kweekbare microben. De methode pakt een belangrijke bottleneck in de milieugenomica aan en faciliteert het verminderen van risico's bij therapeutische hypothesen in een vroeg stadium door directe toegang tot genetisch diverse bodemmicrobiomen.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door toegang te bieden tot genetisch diverse, niet-gecultiveerde microbiële gemeenschappen voor de ontdekking van targets.
- Operationele waarde: Levert DNA met een hoog moleculair gewicht dat geschikt is voor de constructie van bibliotheken met grote inserts, waardoor cloning bias wordt verminderd en de functionele hit-rates toenemen.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert DNA-templates voor functionele metagenomische screening van biosynthetische routes uit bodem die gekoppeld zijn aan therapeutische activiteit.
- Operationele waarde: Levert gezuiverd DNA met een verminderde contaminatie van humuszuren, wat de efficiëntie van downstream enzymatische reacties en de reproduceerbaarheid van assays verbetert.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt de identificatie van nieuwe enzymatische functies en bioactieve verbindingen uit milieu-microbiomen voor preklinische validatie.
- Operationele waarde: Maakt de constructie van sequentie-klare bibliotheken mogelijk voor heterologe expressie en lead-optimalisatie bij de ontdekking van antimicrobiële of antikanker-geneesmiddelen.
Pipeline- & workflowintegratie
De methode past binnen het continuüm van de vroege ontdekking, waardoor bibliotheekconstructie mogelijk wordt voor screeningcampagnes die bijdragen aan lead-identificatie en de selectie van preklinische kandidaten.
- Discovery Biology: Faciliteert hypothesevrije exploratie van het metabole potentieel van bodemmicroben voor de ontdekking van doelwitten en pathways.
- Screening: Levert DNA-inputs voor functionele screening-assays die zijn ontworpen om bioactieve metabolieten of enzymactiviteiten te detecteren.
- Analytics: Maakt verificatie van grootte en zuiverheid mogelijk via pulsed field gel electrophoresis en cesiumchloride-gradiëntcentrifugatie om de bibliotheekkwaliteit te waarborgen.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt de ontdekking van omgevingsgenen met preklinische evaluatie door expressie van gekloonde pathways in hanteerbare gastheren.
- Enterprise Hergebruik: Biedt een gestandaardiseerd, schaalbaar DNA-extractieprotocol dat toepasbaar is op diverse bodem- en sedimentmonsters voor herhaalde screeningscampagnes.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie door toegang te krijgen tot genetisch rijke, niet-gekweekte microbiële reservoirs.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid en standaardisatie bij DNA-isolatie, waardoor variabiliteit tussen verschillende typen milieu-monsters wordt verminderd.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen in de vroege ontdekkingsfase door de toegang tot nieuwe chemische ruimtes uit bodemmicrobiomen uit te breiden.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van leads afgeleid van metagenomische bibliotheken met gevalideerd functioneel potentieel.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in moleculaire biologie en het omgaan met gevaarlijke reagentia zoals beta-mercaptoethanol, chloroform en cesiumchloride.
- Afhankelijk van toegang tot ultracentrifugatie-apparatuur voor de cesiumchloride-gradiëntstappen en pulsed field gel electrophoresis-systemen voor de beoordeling van de DNA-integriteit.
- Vereist gestandaardiseerde werkprocedures tussen teams om een consistente DNA-opbrengst en -kwaliteit te garanderen vanuit variabele bodemmatrices.
- Omvat zorgvuldige monsterbehandeling om DNA-shearing te voorkomen, waaronder het vermijden van krachtig vortexen en repetitief pipetteren tijdens de extractie- en precipitatiestappen.
- Beperkt door de inherente variabiliteit van het humuszure gehalte in de bodem, wat optimalisatie van de zuiveringsstappen voor bepaalde monstertypes kan vereisen.
