Electrospinning Stapel-Polymer Stellingen voor Tissue Engineering en Cell Culture

Deze video demonstreert het elektrospinnen van polymeren, een populaire techniek voor tissue engineering en celcultuur om vezelsteigers te creëren die de architectuur en schaal van de natuurlijke extracellulaire matrix nabootsen. Hier elektrospinnen we een fotoreactief hyaluronzuur dat in staat is tot cross-linking bij blootstelling aan licht en introduceren we verdere verwerkingsapplicaties zoals fotopatronering, een proces dat kanalen, steigers en multischaalporositeit creëert om de cellulaire infiltratie en weefseldistributie te verhogen. Daarnaast gebruiken we de vorming van multipolymeersteigers, waardoor het elektrospinnen van twee verschillende polymeren in dezelfde mat mogelijk is, wat het afstemmen van de mechanica en degradatie van de steiger en het aanpassen van de porositeit voor cellulaire infiltratie toelaat.

Hallo, ik ben Jamie Kovi van het laboratorium van Jason Burdick van de afdeling Bioengineering aan de University of Pennsylvania. Hallo, ik ben Harini Swin, ook van het Burdick Lab. Vandaag laten we u een procedure zien voor het electrospinnen van vezelsteigers voor tissue engineering.

We zullen ook de aanvullende verwerkingsmogelijkheden van fotopatronering en de vorming van multi-polymeer scaffolds introduceren. Wij gebruiken deze procedures in ons laboratorium om interacties en infiltraties van HMSE-cellen in hyaluronzuur-scaffolds te bestuderen. Daarnaast maken we deze technieken met diverse andere polymeren gebruik om vezelversterkte weefsels, zoals de meniscus en het myocardium, te bestuderen.

Laten we beginnen. Bereid een gewichtsoplossing van 0,5% van de foto-initiator voor. Ik los I 2959 op in gedeïoniseerd water door dit gedurende enkele dagen bij 37 °C te laten oplossen.

I cure wordt gebruikt wanneer een fotoreactief polymeer nodig is voor electrospinning. Om de electrospinning-oplossing te bereiden, worden de volgende uiteindelijke concentraties in gedeïoniseerd water gecombineerd: 2 gewicht% gemethyleerd hyaluronzuur of MEHA, 3 gewicht% polyethyleenoxide of PEO en een 0,05 gewicht% I 2 9 5 9-oplossing; vortex deze vijf minuten en incubeer gedurende de nacht bij 37 °C. Om de oplossing op te lossen, wordt deze overgebracht naar een spuit waaraan een 18 gauge, zes inch lange stompe naald is bevestigd.

Gebruik vervolgens een spuitenpomp en stel deze in op een uitstootingssnelheid van 1,2 milliliters per uur. Plaats de naald van de spuitenmotor in de spuitenpomp. Bevestig de geaarde leiding van een hoogspanningsvoedingsbron aan het opvangapparaat.

In deze procedure gebruiken we een dorn die roteert met ongeveer 10 meter per seconde. Om uitgelijnde vezels op te vangen, bevestigt u de positief geladen draad aan de naald en stelt u de naald of het opvangapparaat zo in dat er een afstand van 15 centimeter tussen beide bestaat. Start de vloeistofstroom van de spuitpomp en zodra er vloeistof op de punt van de naald zichtbaar is, schakelt u de spanningsbron in en stelt u de spanning in op 22 kilovolt.

Verzamel vezels op het steigerframe totdat de gewenste dikte is bereikt. De verzameltijd is afhankelijk van de gewenste dikte en het volume van de gebruikte electrospinning-oplossing. Voor fotopatronering gebruiken we electrogesponnen matten die gedurende 16 uur zijn gesponnen.

Verwijder het steunmateriaal uit het opvangsysteem nadat de opvang is voltooid en bewaar het gedurende de nacht onder vacuüm voor volledige verwijdering van het oplosmiddel. Knip met een schaar monsters van vijf millimeter bij vijf millimeter uit de mat van het steunmateriaal. Plaats elk steunmateriaal op een met folie bedekte glazen objectglas ter voorbereiding op de crosslinking en plaats het fotomasker direct op het steunmateriaal; bedek dit met een schoon glazen objectglas en klem beide uiteinden van het objectglas vast met klemmetjes.

Spoel het scaffold in een stikstofkamer om reductie van de cross-linking door blootstelling aan zuurstof te voorkomen. Plaats de scaffold-opstelling in de stikstofkamer onder 365 nanometer licht met een intensiteit van ongeveer 10 milliwatts per vierkante centimeter, gebruikmakend van een collaterende adapter, gedurende vijf minuten. Verwijder elk scaffold en plaats deze in een 12-wells weefselkweekplaat.

Voeg twee milliliters gedeïoniseerd water aan elk toe. Profileer de plaat om aberratie van het water in de wells te voorkomen en plaats deze 24 uur lang bij 37 graden Celsius. Vervang het water elke acht uur door een vacuümpipet te gebruiken om het gedeïoniseerd water uit de well tussen de wasbeurten door te aspireren.

Bereid op een warmteplaat een 5% gewichtsoplossing van PEO in 90% ethanol. Roer gedurende ten minste twee uur voorafgaand aan de procedure bij 700 RPM bij 50 °C. Voeg na het roeren DPI toe tot een uiteindelijke concentratie van 10 µg/mL.

Breng de PEO- en DPI-oplossing over naar een spuit van drie milliliter en wikkel deze in aluminiumfolie om de oplossing tegen licht te beschermen. Bereid vervolgens de electrospinning-oplossing voor zoals beschreven in de tweede sectie en voeg met een micropipet methoxy ethyl biocarbon mole rod domine B toe aan een spuit van drie milliliter voor een uiteindelijke concentratie van 25 micromolar. Wikkel deze ook in aluminiumfolie om de oplossing tegen licht te beschermen.

Gebruik zorgvuldig plakband om de randen van 22 millimeter bij 22 millimeter gemethyleerde glazen dekglasjes op het oppervlak van de mandrel te bevestigen, zodanig dat de dekglasjes rond de omtrek van de mandrel passen. Gebruik een vijf millimeter lang stuk siliconen slang en bevestig één uiteinde aan één van de spuiten met lure-lock aansluitingen. Bevestig het andere uiteinde aan een naald, plaats de spuit in de spuitenpomp en steek de naald door het gat in de ventilator.

De waaiers overbruggen de lengte van de mandrel en worden gebruikt om een gelijke verdeling van beide polymeren in het resulterende steigerwerk te waarborgen. Zorg ervoor dat de naaldpunten gecentreerd zijn op de mandrel voor de spuit met MEHA. Positioneer de naaldpunt op 15 centimeter van de mandrel en stel de waaier in op een afstand van zes centimeter vanaf de naaldpunt.

Programmeer de spuitenpomp om 1,2 milliliters per uur toe te dienen en stel de stroombron in op 22 kilovolts. Richt de spuit met PEO op exact dezelfde wijze in, maar plaats de naaldpunt op 10 centimeters van het mandrel en stel de stroombron in op 15 kilovolts. Schakel daarna de lichten uit en zet het mandrel en de spuitenpompen aan.

Verwijder het aluminiumfolie van de spuiten zodra er vloeistof zichtbaar is op de punten van beide naalden. Zet gelijktijdig de voedingen aan en sluit de ventilatoren aan wanneer de opvang voltooid is. Schakel de voedingen en de mandrel uit en trek de stekkers van de ventilatoren voorzichtig uit het stopcontact.

Verwijder de dekglasjes en de tape met een scheermesje. Vezels kunnen worden gevisualiseerd met een fluorescentiemicroscoop die is uitgerust met filters voor rumine en dpi. Plaats elk dekglasje met het aangehechte electro spon polymeer in een individuele put van een zesdelige plaat.

Incubeer de scaffolds in twee milliliters PBS gedurende de nacht in een wellplaat om volledige verwijdering van oplosmiddel en contaminanten te waarborgen. Aspireer na 24 uur de PBS uit de wellplaat met behulp van vacuüm en plaats de scaffolds gedurende 30 minuten onder een germicide UV-lamp in een laminaire flowkast. Voer voor sterilisatie standaard celkweek uit en bereid een geconcentreerde celsuspensie voor bij de gewenste celdichtheid.

Gebruik bijvoorbeeld 100 milliliters cel-suspensie voor een dekglas van 22 bij 22 millimeter. Plaats dit gedurende één uur in de incubator. Voeg aan elk de passende hoeveelheid celcultuurmedium toe.

Plaats de steigers terug in de incubator. Kleur de cellen met een commercieel verkrijgbare live-dead kit van Invitrogen om de cellen en vezels te visualiseren met een fluorescentiemicroscoop uitgerust met filters voor trissy en fitzy; steigers verzameld op een geaarde vlakke plaat vertonen de verwachte resultaten. Er worden willekeurig verdeelde vezels geproduceerd wanneer steigers op een roterende mandrel worden verzameld.

Om uitgelijnde vezels te verkrijgen bij weergave via scanning elektronenmicroscopie tijdens het fotocrosslinken vanHet scaffold, plaatsen we een fotomasker tussen het scaffold en de lichtbron nadat het scaffold is ondergedompeld in gedeïoniseerd water en onreactief ha. De gebieden die voor het licht zijn afgeschermd en PEO worden verwijderd, waarbij de vorming van macroporiën zichtbaar wordt door de fluorescerende kleurstof. Gelijktijdige electrospinning van de MEHA- en PEO-jets resulteert in een composietscaffold dat verschillende vezelpopulaties bevat, opgebouwd uit de individuele polymeren.

De HMC's lijken positief te reageren op de vezels. Ze blijven niet alleen levensvatbaar, zoals blijkt uit de groene kleuring, maar ze lijken zich ook zo te oriënteren dat ze in lijn liggen met de rode vezels. We hebben u zojuist laten zien hoe u vezelsteigers kunt elektrospinnen voor tissue engineering.

We hebben ook extra mogelijkheden geïntroduceerd, zoals fotopatronering en elektrospinning met meerdere polymeren. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de elektrospinning-parameters van elk polymeer moeten worden geoptimaliseerd om uniforme vezels te vormen voordat verdere experimenten worden uitgevoerd. Dat is alles.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.