Name: Isolatie en zuivering van Drosophila Perifere neuronen door Magnetic Bead sorteren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-01T14:59:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Leer de isolatie en zuivering van Drosophila perifere neuronen door magnetische kralen sortering. Deze methode maakt snelle celscheiding mogelijk voor RNA-analyse en transcriptoomonderzoek in neurobiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Drs. Yuh-Nung Jan en Wes Grueber voor het aanbieden van vliegen voorraden die in deze studie. De auteurs erkennen de Thomas F. en Kate Miller Jeffress Memorial Trust voor de ondersteuning van dit onderzoek (DNC) en de George Mason University Provost&#39;s Office (EPRI).

Algemeen Reacties op Magnetic Bead sorteren van Drosophila perifere neuronen (Totaal Timing voor de voltooiing van het protocol: 2,5-3 uur) Standaard lab procedures voor het handhaven van een schone, RNAse vrije omgeving moeten worden nageleefd te allen tijde RNA degradatie te voorkomen. Wanneer de Drosophila larven cuticula is ontleed en geplaatst in de cel dissociatie buffer, de perifere neuronen zijn een van de laatste cellen los te maken van de cuticula. We hebben benut deze eigenschap en ontworpen dit protocol voor de meeste van de niet-specifieke cellen van de cuticula, zoals spier-en vetweefsel voorafgaand aan het isoleren van de da neuronen te verwijderen. Met de praktijk, kan de hele protocol met succes worden voltooid binnen ongeveer 2,5 uur. De voorbereiding van antilichamen gecoate kralen moet zijn afgerond voordat het experiment begint. 1. Voorbereiden magnetische korrels voor Binding Cells: Deze stap moet voor de aanvang van het experiment worden afgerond. De voorbereide kralen kunnen worden bereid en bewaard bij 4 ° C totdat het nodig is. <ol><li> Was de 100 ul Dynabeads M-280 Streptavidine gecoate kralen drie keer in PBS door resuspenderen in 500 pi van verse PBS en pellets in een sterk magnetisch veld per keer. </li><li> Eindelijk direct resuspendeer de kralen in 100 pi van onverdund gebiotinyleerd rat anti-muis-CD8a antilichaam (antilichaamconcentratie is 100 ug / ml). </li><li> Incubeer dit mengsel gedurende 1 uur op ijs met af en toe een lichte vortexen naar sedimentatie te voorkomen. [1 ui van Dynabeads M-280 kunnen binden 0,05-0,10 ug van gebiotinyleerd antilichaam]. </li><li> Was de kraal-antilichaam mengsel drie keer, zoals beschreven in stap 1.1 om het overtollige antilichaam te verwijderen. De magnetische kralen zijn nu bedekt met antilichamen en klaar om gebruikt te worden. Bewaar de kraal-antilichaam mengsel in 100 ul PBS 1X bij 4 ° C tot gebruik. </li></ol> 2. Selecteren en Wassen Larven: (10-15 minuten) <ol><li> Kies 30-50 jaar geëvenaard derde instar larven en leg ze in een 1.6ml microfugebuis met 1 tot 1,2 ml 1X fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). (3-5 minuten) </li><li> Sluit de buis en vortex deze op de maximale instelling drie keer voor een seconde elk. </li><li> Met behulp van een brand-gepolijste Pasteur pipet volledig ontdoen van het supernatant. Herhaal de wasbeurt (2.1) en vortex (2.2) stappen 3-4 keer tot de bovenste is zichtbaar vrij is van alle etensresten en vuil. </li><li> Kort herhalen van de wassen met 1 ml 70% ethanol en gooi de supernatant. </li><li> Twee keer was de larven met 1 ml ddH2O Verwijder de bovenstaande vloeistof. </li><li> Kort herhalen de was nog eens met 1 ml van RNase-AWAY en gooi het supernatant. </li><li> Was de larven drie keer in 1 ml van ddH2O om volledige verwijdering van RNase-AWAY te verzekeren. </li></ol> 3. Dissectie: (10-12 minuten) <ol><li> Plaats 10 tot 12 larven in het midden van een Sylgard gecoate 35mm Petri plaat. Plaats ze iets weg van elkaar. [Kritische stap: Gooi alle larven die niet lijken te zijn op het juiste ontwikkelingsstadium] </li><li> Opengesneden het voorste puntje van de larven met behulp van een paar van fijne dissectie schaar voor alle larven. </li><li> Met behulp van een paar saaie Dumont nr. 5 tang draai de larven inside-out. Plaats een pincet in de larvale cuticula helemaal naar het achterste einde. Samen Knijp de uiteinden van de tang aan het achterste einde van de cuticula (figuur 1a) (probeer het indrukken van de cuticula neer op de Sylgard oppervlak gemakkelijker te maken) te grijpen. Met behulp van het tweede paar pincetten, duw de larvale nagelriem binnen en van buiten. [Kritische stap: Probeer het beoefenen van deze methode een paar keer voordat de cel isolatie experiment. Probeer de larven helemaal omgedraaid te krijgen, om ervoor te zorgen dat alle zachte weefsels worden blootgesteld aan de oplossing voor eenvoudige dissociatie.] </li><li> Na het ontleden 3-4 larven, direct overbrengen naar verse, ijskoud PBS (plaats de buis op het ijs) in een 1,6 ml microfugebuis. </li><li> Herhaal de stappen 3,1 tot 3,4 totdat alle benodigde larven worden verzameld (30-40 larven in dit protocol). [Critical Stap:. Anticipeer op 10-20% verlies tijdens dissectie en dissociatie, en plan dienovereenkomstig] </li></ol> 4. Verwijdering van losjes hechtende niet-specifieke cellen: (2-3 minuten) [Deze stap helpt bij het opruimen van los hechtende niet-specifieke weefsels zoals vet lichamen en CNS.] <ol><li> Neem de 1,6 ml microfugebuisje met het omgekeerde larvale nagelriemen en vervang het supernatant met ongeveer 700 tot 800 ul van verse ijskoude PBS. </li><li> Pulse-vortex de microfugebuis 5 keer (3 seconden per puls) op volle snelheid. </li><li> Verwijder het supernatant en vervang deze met ongeveer 700 tot 800 ul vers, ijskoud PBS. </li><li> Herhaal de stappen 4.2 en 4.3 drie keer. </li><li> Resuspend het larvale nagelriemen in 400 ul vers, ijskoud PBS </li></ol> 5. Dissociatie het weefsel in een enkele celsuspensie: (18-20 minuten) [Kritische stap: Over-dissociatie kan het verlies van de cel-oppervlak marker wat leidt tot een slechte cel-rendement en een lage levensvatbaarheid van de cellen veroorzaken. De larvale weefsel kan los gezien worden door een mechanische dissociatie (sonicatie, douncing), enzymatische dissociatie (trypsine, collagenase enz.) of een combinatie van beide. Aangezien deze larven weefsels zijn moeilijk te scheiden, vonden we dat een combinatie van zowel mechanische en enzymatische dissociatie de beste resultaten opgeleverd.] <ol><li> Voeg 1,5 pi van 1X Liberase Blendzyme 3 (28 W nsch eenheden / flacon) tot het larvale cuticula gesuspendeerd in 400 pi PBS. </li><li> Vortex de oplossing 2-3 keer gedurende 1 seconde per bij maximale instelling (Dit zou het losjes adherente cellen van de opperhuid te verwijderen in de oplossing). </li><li> Incubeer de oplossing bij kamertemperatuur (22-25 ° C) gedurende 5 minuten. [Kritische stap: Incubatie tijd grote invloed op de uiteindelijke celsortering efficiency. De aanbevolen incubatietijd zou voldoende moeten zijn voor het losmaken van het weefsel. Niet meer dan 15 minuten.] </li><li> Pulse-vortex de buis 20-30 keer op maximale instellingen voor 2 seconden per puls op volle snelheid. Dit moet releases van de spieren en andere weefsels in de oplossing. Inspecteer een kleine greep uit de oplossing onder een tl-stereo-microscoop bij elke stap. (Met een ervaring moeten kunnen om het niveau van dissociatie te bepalen door het observeren van de microfugebuis direct onder een fluorescentie-enabled stereo-microscoop) </li><li> Was het larvale nagelriemen 2-3 keer met verse, ijskoud PBS en uiteindelijk hen resuspendeer in 500 ul vers, ijskoud PBS dat 1% BSA. </li><li> Om te voorkomen dat het larvale cuticula vasthouden aan het glazen oppervlak van de 2 ml Kontes weefsel molen en de grote ruimte stamper, pre-coat het weefsel molen en een stamper met een 1% BSA in PBS-oplossing en na een korte spoeling gooi de BSA-oplossing. Vervolgens wordt met behulp van een brand-gepolijste Pasteur pipet de nagelriemen van stap 5.5 op de BSA-gecoate weefsels molen. [Kritische stap: Pre-cool het weefsel molen / stamper door het op ijs voor een paar minuten tot celbeschadiging / lysis te voorkomen]. </li><li> Dounce het weefsel met een langzame en gestage slagen, het vermijden van schuimvorming (ongeveer 20-30 slagen). [Critical Stap:. Dounce langzaam en gelijkmatig, anders kunnen de cellen lyseren] </li><li> Voor de beoordeling van de cel dissociatie niveaus, veeg de buitenmuur van het weefsel molen met een schone tissue Kimwipe, en inspecteer deze onder een tl-stereo-microscoop. De neuronen moeten los van de nagelriem, en kan gezien worden in de oplossing. Als dit blijkt te zijn moeilijk, als alternatief pipet uit een kleine steekproef van de oplossing, en observeer het onder een tl-stereo-microscoop. Een goede indicatie van de cel dissociatie is de afwezigheid van de neuronen van de larvale cuticula. Echter, als men nog steeds op neuronen aan de nagelriem, of merkt onvolledig gescheiden cellen, verder dounce totdat de cellen komen tot een enkele celsuspensie. </li><li> Vermaal de oplossing vijf keer met een brand-gepolijste Pasteur pipet gedaald tot ongeveer 50% van de standaard tip diameter, gevolgd door 10 keer met een brand-gepolijste Pasteur pipet gedaald tot ongeveer 25% van de standaard tip diameter. [Kritische stap: Krachtig fijnwrijving kan schade aan de cellen. Monitor de cellen tussen de stappen, en dienovereenkomstig aan te passen van de procedure]. </li><li> Filtreer de oplossing door een 30 um cel filter en verzamel de cel filtraat op in een 1,6 ml microfugebuis. De resulterende oplossing moet bestaan ​​uit een enkele cel schorsing en is nu klaar voor magnetische celsortering. </li></ol> 6. Magnetische Bead Cell Sorting: (45 - 75 minuten, afhankelijk van de antilichamen incubatietijd) <ol><li> Voeg 15 ul van het antilichaam gecoate magnetische kralen om 500 pi van de celsuspensie (stap 5,10). De resterende antilichaam geconjugeerd magnetische korrels kunnen worden opgeslagen totdat ze nodig voor latere cel isolaties. </li><li> Incubeer de cellen met antilichaam gecoate magnetische korrels gedurende 30-60 minuten op ijs met af en toe hand-mixen. [Kritische stap: Incubatie bij een hogere temperatuur of langere tijd kan leiden tot niet-specifieke antilichaam binding.] </li><li> Plaats de microfugebuis in een sterk magnetisch veld gedurende 2 minuten. Alle positief geselecteerde cellen, samen met niet-gebonden kralen zal scheiden aan de zijkant van de buis. </li><li> Langzaam pipet het supernatant, zorg ervoor niet naar de cel pellet te verstoren. </li><li> Was de cellen 3-4 keer in verse, ijskoude PBS om alle resterende niet-specifieke cellen te verwijderen. </li><li> Resuspendeer de cellen in 30 ul van verse, ijskoude PBS. </li><li> Om onderlinge aanpassing van de zuiverheid en de opbrengst van de cellen, pipet 5 ul van de cel suspension op het gepolijste oppervlak van een hemocytometer en tel alle zichtbare fluorescerende cellen onder een tl-stereo-microscoop. Controleer ook de hoeveelheid niet-fluorescerende cellen en geen tekenen van onzuiverheden. Typisch het monster zal zeer worden verrijkt voor de fluorescerende cellen. </li></ol> 7. RNA isolatie van Magnetic Bead Gesorteerd Cells: (60 - 75 minuten) <ol><li> Na het tellen, pellet de cellen in een magnetisch veld, gooi het supernatant en voeg 20 ul van de extractie buffer van de PicoPure ™ RNA Isolation Kit (Molecular Devices). Afhankelijk van het aantal cellen een kan nodig zijn om een ​​hoger volume van de extractie buffer toe te voegen. </li><li> Vortex de buis met maximale snelheid aan het mengen van celpellet met extractiebuffer mogelijk te maken. </li><li> Incubeer de buis bij 42 ° C gedurende 30 minuten. </li><li> Om ervoor te zorgen verwijdering van de magnetische beads voorafgaand aan de kolom zuivering van het RNA (zie stap 7.5), is de buis kort gecentrifugeerd bij 2.000 (x) g gedurende 2 minuten om pellet het magnetische korrels. De buis wordt dan geplaatst in een sterk magnetisch veld om de pellet te behouden, en het supernatant is overgebracht naar een nieuwe microfugebuis. </li><li> Extract en kolom zuiveren het RNA volgens de PicoPure RNA-extractie kit instructies van de fabrikant. DNAse behandeling is optioneel, en kan worden uitgevoerd op kolom in de RNA-zuivering volgens de analyse vereiste. Ten slotte is elueren de gebonden totaal RNA in een klein volume (11 tot 30 pl) van elutiebuffer en bewaar bij -80 ° C tot aan gebruik. Indien gewenst kan een 1 pi aliquot kan worden gebruikt om de totale RNA kwaliteit te beoordelen op een Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Inc.) </li></ol> Representatieve resultaten: Magnetische bead sortering werd gebruikt om Drosophila da neuronen (figuur 1) te isoleren. Het RNA gezuiverd van deze geïsoleerde da neuronen (figuur 2a) bleek te zijn van uitstekende kwaliteit, zoals aangegeven door de aanwezigheid van scherpe 5.8S, 18S en 28S ribosomaal RNA pieken wanneer geanalyseerd op een Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc) ( Figuur 2b). Beginnen met 30-40 derde instar larven we in staat waren om het isoleren van gemiddeld 300 tot 500 klasse-IV da neuronen met behulp van de PPK-GAL4 driver, en da 1500-2000 neuronen (klasse I, II, III en IV) met behulp van de pan- da neuron-specifieke GAL4 21-7 driver. Voor de beoordeling van de neuronale-specifieke verrijking van onze geïsoleerde cellen wij controlewerkzaamheden uitgevoerd kwantitatieve reverse transcriptie PCR (qRT-PCR) met behulp van twee neuronale gen-specifieke markers (elav en futsch). Deze analyses aangetoond dat er belangrijke factor verrijking van zowel de marker-genen duidt op een zeer specifieke verrijking voor da neuronen in vergelijking met de stromen door het gebruik van onze protocol (figuur 3). Ten slotte werd de geïsoleerd RNA uit zowel pan-da neuronen en klasse-IV da neuronen gebruikt worden om transcriptionele expressie profilering uit te voeren op Agilent Drosophila melanogaster hele genoom oligo microarrays (4 x 44K) (figuur 4). Deze analyses tal van eerder betrokken toezichthouders van da neuron dendriet morfogenese geïdentificeerd als aanvulling op een breed spectrum van eerder ongekarakteriseerde moleculen en vermeende signaaltransductie die mogelijk spelen een belangrijke functionele rol in da neuron ontwikkeling. Studies is ontworpen om de mogelijke rol (len) van de eerder ongekarakteriseerde moleculen in het bemiddelen da neuron ontwikkeling, en in het bijzonder dendriet morfogenese te beoordelen, zijn momenteel aan de gang. <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure1tmb.jpg" border="0" /> Figuur 1:. Schema van de magnetische kraal sorteren van Drosophila da neuronen (a) Leeftijd afgestemd derde instar larven met het da neuron-specifieke GAL4, UAS-mCD8-GFP reporter transgen wordt doorsneden door het omkeren van de larvale cuticula inside-out, om de bloot PNS tot dissociatie buffer en opgeslagen in ijskoud PBS. (b) Enzymatische dissociatie wordt uitgevoerd door het toevoegen van Liberase Blendzyme 3 tot en met de oplossing die larvale cuticula. (c) De larven weefsels worden verder gescheiden door een combinatie van vortexen, trituratie en douncing voor niet specifiek gelabeld weefsels zoals vet-lichamen, darm en CZS. (d, e) De cellen worden vervolgens gefilterd met behulp van een 30 micrometer cel filter te verwijderen. De oplossing bevat een enkele celsuspensie van verschillende celtypen waaronder epitheel, spier-en zenuwcellen. (F) Anti-muis CD8a-antilichaam gecoate Dynabeads M-280 worden toegevoegd aan de celsuspensie, en geïncubeerd op ijs gedurende 30-60 minuten. ( g) De magnetische korrels bindt aan de da neuronen die uiting van een muis CD8 gelabeld GFP fusie-eiwit. (h, i) De magnetische kraal gecoate cellen worden gescheiden door het plaatsen van de oplossing in een sterk magnetisch veld. Het supernatant wordt verwijderd, en de cellen worden drie keer gewassen om eventuele resten van niet-specifieke cellen te verwijderen, wat resulteert in (j) highly gezuiverde populaties van da neuronen. Gelieve <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1599/1599figure1.jpg">Klik hier</a> voor een grotere versie van figuur 1 te zien. <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure2tmb.jpg" border="0" /> Figuur 2: (a) representatief beeld van positief geselecteerde, GFP fluorescente klasse-IV da neuronen geïsoleerd door cel dissociatie en magnetische kraal sorteren. De resulterende populatie van neuronen werd bepaald in hoge mate verrijkt voor klasse-IV da neuronen met weinig of geen vervuilende cel onzuiverheden. (B) Een Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc) electropherogram van totaal RNA geïsoleerd van magnetische bead gesorteerd da neuronen , waarin een uitstekende totaal RNA kwaliteit, zoals aangegeven door de aanwezigheid van 5.8S, 18S en 28S rRNA. Gelieve <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1599/1599figure2.jpg">Klik hier</a> voor een grotere versie van figuur 2 te zien. <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure3.jpg" border="0" /> Figuur 3: qRT-PCR-analyse van neuronale marker genexpressie in geïsoleerde da neuronen (GAL421-7, UAS-mCD8-GFP) en de stroom door de fractie werd in drievoud uitgevoerd. De expressie niveaus van de twee neuronale-specifieke marker genen (elav en futsch) werden beoordeeld door qRT-PCR. Waarden verkregen uit deze analyses werden genormaliseerd om de endogene controle (rp49), en de niveaus ten opzichte van die welke werden waargenomen in de doorstroming fractie werd berekend met de ΔΔCτ methode 6. Zowel elav en futsch waren significant verrijkt in de geïsoleerde da neuron bevolking ten opzichte van de stroom door fractie. <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure4tmb.jpg" border="0" /> Figuur 4: Representatieve klasse-IV da neuron-specifieke Cy3 gelabeld microarray image-bestand. Hier afgebeeld is een Agilent Drosophila melanogaster hele genoom oligo microarray (4 x 44K) gehybridiseerd met Cy3-labeld totaal RNA geïsoleerd van klasse-IV da neuronen gezuiverd door middel van magnetische kraal sorteren. Gelieve <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1599/1599figure4.jpg">Klik hier</a> voor een grotere versie van figuur 4 te zien.

<ol><li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136, 1049-1061 (2009).</li>
<li>Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim,, Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+that+regulate+establishment%2C+maintenance%2C+and+remodeling+of+dendritic+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields.</a> Ann. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li>
<li>Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system%3A+links+with+peripheral+dendrite+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li>
<li>Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+multidendritic+sensory+neurons+are+necessary+for+rhythmic+locomotion+behavior+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5199-5204 (2007).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) methods.</a> Methods. 25, 402-408 (2001).</li>
</ol>

Het protocol hier gepresenteerde is geoptimaliseerd voor de isolatie en zuivering van de perifere neuronen die strak te houden aan de binnenkant van de Drosophila derde instar larven nagelriemen met behulp van een magnetisch bolletje celsortering strategie. Hoewel we hebben gebruikt dit protocol om specifiek Drosophila da neuronen, toepassingen van dit protocol te isoleren om het isolement van andere celtypen die voldoen aan de cuticula in larve-of popstadium stadia van ontwikkeling (bijvoorbeeld epitheel, spieren, ande...

Uitrusting <ul><li> (10) Neodymium magneten blok (K &amp; J Magnetics, Inc, Cat. # B444B), als alternatief DynaMag ™ -2 (Invitrogen, Cat. # 123-21D) kan worden gebruikt. </li><li> Kontes glasvlies Grinder, 2 ml van de arbeidsgeschiktheid, met een grote ruimte pestle (Cat. # 885.300 tot 0,002) </li><li> Cel filters, bijvoorbeeld MACS Pre-Separation Filter (Miltenyi Biotec, Cat. # 130-041-407) </li><li> 35 mm petri-schalen bekleed met Sylgard (Dow Corning Corporation, Cat. # 3097358 tot 1004) </li><li> Ontleden tools: twee paren van Dumont nr. 5 pincet (Fine Science Tools, Cat # 11251-20). </li><li> Vannas lente micro-dissectie schaar (Fine Science Tools, Cat. # 15000-08) </li><li> Pipetten (P-1000, P-100, P-10) met disposable tips </li><li> Standaard hemocytometer naar de cellen en een schatting zuiverheid tellen </li><li> Pasteurpipetten met vuur gepolijste uiteinden van de standaard diameter, gedaald tot ~ 50% van de standaard diameter en versmald tot ~ 25% van de standaard diameter voor tritureren </li><li> Tafelblad micro-centrifuge (1-16,000 (x) g) </li><li> Draaikolk </li><li> TL-stereo-microscoop (een Leica MZ16FA werd gebruikt in dit protocol) </li></ul>

isolatie en zuivering van drosophila perifere neuronen door magnetic bead sorteren

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Perifere zenuwstelsel (PNS) is een krachtig model voor het onderzoeken van de complexe processen van neuronale ontwikkeling en dendrieten morfogenese bij de functionele en moleculair niveau. Om te helpen in deze analyses, hebben wij een strategie ontwikkeld voor de isolatie van een subklasse van PNS neuronen genaamd dendritische arborization (da) neuronen die op grote schaal gebruikt voor het bestuderen van dendriet morfogenese<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Deze neuronen zijn zeer moeilijk te isoleren als een zuivere populatie, mede door hun extreem lage optreden en hun moeilijk te bereiken locatie onder de stoere chitinous larvale cuticula. Onze nieuw ontwikkelde methode overwint deze uitdagingen, en is gebaseerd op een snelle en specifieke cel verrijking met behulp van antilichaam-gecoate magnetische korrels. Voor onze magnetische kraal sorteren studies, hebben we gebruik gemaakt van dezelfde leeftijd derde instar larven uiten van een muis CD8 gelabeld GFP fusie-eiwit (<em&gt; UAS-mCD8-GFP</em&gt;)<sup&gt; 3</sup&gt; Onder de controle van zowel de klasse IV dendritische arborization (da) neuron-specifieke<em&gt; Zakkenroller (PPK)-GAL4</em&gt; Driver<sup&gt; 4</sup&gt; Of de controle van het pan-da neuron-specifieke GAL4<sup&gt; 21-7</sup&gt; Driver<sup&gt; 5</sup&gt;. Hoewel dit protocol is geoptimaliseerd voor het isoleren van PNS-cellen, die zijn bevestigd aan de binnenwand van de larvale cuticula, door het variëren van een paar parameters, zou hetzelfde protocol gebruikt worden om veel verschillende soorten cellen aan de cuticula op larve of popstadium stadia van isoleren ontwikkeling (bijvoorbeeld epitheel, spier, oenocytes enz.), of andere celtypen uit larvale organen afhankelijk van de GAL4-specifieke driver expressie patroon. Het RNA geïsoleerd door deze methode is van hoge kwaliteit en kunnen gemakkelijk worden gebruikt voor de downstream-genomische analyses, zoals microarray genexpressie studies. Deze aanpak biedt een krachtige nieuwe tool om studies uit te voeren op geïsoleerde<em&gt; Drosophila</em&gt; Dendritische arborization (da) neuronen waardoor het verstrekken van nieuwe inzichten in de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen dendriet morfogenese.

In deze video-artikel stellen we een methode voor de isolatie en zuivering van<em&gt; Drosophila</em&gt; Perifere neuronen met behulp van een snelle magnetische kraal bijgestaan ​​celsortering strategie. RNA verkregen uit de geïsoleerde cellen kunnen gemakkelijk worden gebruikt voor downstream-toepassingen zoals microarray-analyses.

Isolatie en zuivering van Drosophila Perifere neuronen door Magnetic Bead sorteren

Het perifere zenuwstelsel (PNS) van Drosophila is een krachtig model voor het onderzoeken van de complexe processen van neuronale ontwikkeling en dendriet...

Drosophila-larven met een neuron-specifiek CD8-GFP-fusierapporteur-transgeen worden gebruikt om DA-neuronen te isoleren. De larven worden gedisseceerd door de cuticula binnenstebuiten te keren, waardoor het perifere zenuwstelsel bloot komt te liggen. De omgekeerde larven worden onderworpen aan enzymatische dissociatie, gevolgd door mechanische dissociatie via vortexen, agitatie en pipetteren.De cellen worden vervolgens gefiltreerd om een enkelcel-suspensie te verkrijgen die voornamelijk uit epitheel-, spier- en neuronen bestaat. Antilichaam-gecoate magnetische kralen worden toegevoegd aan de celsuspensie, waarbij ze binden aan neuronen die het CD eight-getagde GFP-fusieprotein tot expressie brengen. Ten slotte worden de met magnetische kralen gecoate neuronen geïsoleerd door de oplossing in een sterk magnetisch veld te plaatsen, wat resulteert in zeer gezuiverde neuronpopulaties.Hallo, ik ben Dan Cox van de afdeling Moleculaire Biologie en Microbiologie aan het Krasno Institute for Advanced Study van George Mason University. Hallo, ik ben Ish AER uit het laboratorium van Dr. Dan Cox. Vandaag laten we u een procedure zien voor de isolatie en zuivering van DLO perifere neuronen middels magnetische bead-sortering.Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de moleculaire mechanismen die de klasse-specifieke en rechter-morfogenese reguleren te bestuderen. Laten we beginnen. Om deze procedure te starten, selecteert u 30 tot 50 leeftijd-gematchte derde-stadium larven en plaatst u deze in een microcentrifugebuis van 1,6 milliliter die 1 tot 1,2 milliliter 1X PBS bevat.Sluit de buis en vortex deze drie keer gedurende één seconde op de maximale stand. Verwijder het supernatant volledig met een vuurgepolijste Pasteurpipet. Voeg 1 mL PBS toe en herhaal de was- en vortexstappen drie keer totdat het supernatant zichtbaar vrij is van voedseldeeltjes en debris.Herhaal de wasbeurt kort met 1 mL 70% ethanol. Was de larven vervolgens twee keer met 1 mL dubbel gedestilleerd water. Herhaal tot slot de wasbeurt nogmaals met 1 mL RNase AWAY en drie keer met 1 mL dubbel gedestilleerd water voor volledige verwijdering van de RNase AWAY; de larven zijn nu klaar voor dissectie.Plaats 10 tot 12 larven in het centrum van een met sill guard gecoate Petri-schaal van 35 millimeter. Positioneer ze enigszins uit elkaar en verwijder alle larven die niet in het juiste ontwikkelingsstadium lijken te verkeren. Gebruik vervolgens een fijn dissectieschaartje om de anterieure tip van de larven open te knippen met behulp van een stompe dumont.Nummer vijf, pincetten. Keer de larven binnenstebuiten. Begin met het inbrengen van één pincet in de cuticula van de larve tot aan het posterieure uiteinde.Knijp de punten van de pincet samen om het posterieure uiteinde van de cuticula vast te pakken. Het is eenvoudiger als u de cuticula tegen het oppervlak van de syl guard drukt. Duw de larvale cuticula met de tweede pincet binnenstebuiten.Zorg ervoor dat de larven volledig zijn omgekeerd, zodat alle zachte weefsels zijn blootgesteld aan de oplossing voor een eenvoudige dissociatie. Oefen dit een paar keer voordat u probeert de cellen te dissociëren. Na het dissecteren van drie tot vier larven brengt u deze onmiddellijk over naar vers, ijskoud PBS in een microcentrifugebuisje.Herhaal dit proces totdat de vereiste 30 tot 40 larven zijn verzameld, alvorens over te gaan tot het verwijderen van aspecifieke cellen. Houd er rekening mee dat nu alle larven zijn gedisseceerd, een verlies van 10 tot 20% tijdens de dissectie en associatie wordt verwacht. Verwijder loszittend aspecifiek weefsel, zoals vetlichamen en cellen van het centraal zenuwstelsel.Vervang de supernatant in de buis met de omgekeerde larvale cuticula's door 700 tot 800 µL verse, ijskoude PBS. Vortex tot slot de microcentrifugebuis vijf keer met pulsen van drie seconden per puls op maximale snelheid.Verwijder vervolgens het supernatant en vervang dit door ongeveer 700 tot 800 µL verse ijskoude PBS. Herhaal deze stap drie keer en resuspendeer de larvale cuticula's tot slot in 400 µL vers ijs.Gebruik koude PBS voordat u overgaat naar het dissociëren van de cellen om de dendritische arborisatie of da-larvale neuronen te isoleren. Gebruik een combinatie van enzymatische en mechanische dissociatie. Let op overmatige dissociatie, aangezien dit kan leiden tot het verlies van de celoppervlaktemarker, wat resulteert in een geringe celopbrengst en een lage celviabiliteit.Start de dissociatie door 1,5 µL van 1x Liase Zyme III (28 units per vial) toe te voegen aan de larvale cuticula's gesuspendeerd in 400 µL PBS. Vortex de oplossing twee tot drie keer gedurende één seconde op de maximale stand om de losjes aanhechtende cellen van de cuticula's in de oplossing te brengen.Incubeer de oplossing vervolgens gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Aangezien de incubatietijd de uiteindelijke efficiëntie van de cel sortering sterk beïnvloedt, mag de incubatieperiode aan het einde van de puls niet langer dan 15 minuten duren.Vortex de buis 20 tot 30 keer op maximale snelheid gedurende twee seconden per puls. Dit moet het spierweefsel en andere aspecifieke weefsels in de oplossing brengen. Controleer het monster periodiek onder een stereomicroscoop met fluorescentie om vast te stellen of de perifere neuronen nog aan de cuticula vastzitten.Inspecteer een kleine monstername van de oplossing door de microcentrifugebuis direct onder een fluorescentie-stereomicroscoop te observeren om de mate van dissociatie te bepalen. Herhaal dit bij elke stap van de dissociatie; stop met vortexen zodra de perifere neuronen beginnen te dissociëren van de cuticula in de oplossing. Was de larvale cuticula's kort met twee tot drie wisselingen van telkens één milliliter vers ijskoud PBS.En ten slotte de resuspensie. Suspendeer ze in 500 µL verse, ijskoude PBS met 1% BSA. Om verder te gaan met de mechanische dissociatie van de cellen, gebruik een tissue grinder van twee milliliter met een wijd openstaande stamper en een 1% BSA in PBS-oplossing. Gooi na een kort spoelen de BSA-oplossing weg.Dit voorkomt dat de larvale cuticula's aan de glazen oppervlakken kleven. Koel vervolgens de weefselmaler en stamper enkele minuten voor door ze op ijs te plaatsen om celbeschadiging of lysis te voorkomen. Gebruik daarna een vuurgepolijste Pasteurpipet om de cuticula's over te brengen naar de weefselmaler.Druk het weefsel nu ongeveer 20 tot 30 keer langzaam en gelijkmatig plat, waarbij u schuimvorming vermijdt. Zorg ervoor dat u dit langzaam en gelijkmatig doet. Anders kunnen de cellen lyseren.Om de mate van celdissociatie te beoordelen, veegt u de wand van de weefselmaler af met een schoon Kim wipe-doekje en inspecteert u deze onder een fluorescent stereomicroscoop. De neuronen moeten zijn losgekomen van de cuticula en moeten in de oplossing zichtbaar zijn. Een goede indicatie van celdissociatie is de afwezigheid van neuronen in de larvale cuticula.Indien er echter nog steeds neuronen aan de cuticula vastzitten of indien er in volledig gedissocieerde cellen klontjes zichtbaar zijn, gaat men door tot de cellen een suspensie van enkelvoudige cellen vormen. Zet de mechanische dissociatie voort met een vuurgepolijste Pasteur-pipet. Vernauw deze tot ongeveer 50% van de standaard tipdiameter om de oplossing vijf keer te pipetteren, gevolgd door 10 keer met een vuurgepolijste Pasteur-pipet.Versmal tot ongeveer 25% van de standaard tipdiameter. Let op dat krachtige rotatie de cellen kan beschadigen. Controleer de cellen tussen de stappen door en pas de procedure indien nodig aan.Sluit af door de oplossing te filteren door een 30 micrometer celfilter en verzamel het celfiltraat in een 1,6 milliliter microfugebuisje. De resulterende oplossing moet bestaan uit een enkelvoudige celsuspensie en is nu klaar voor magnetische cel sortering. Magnetische kralen gecoat met een anti CD eight antilichaam.Deze werden voorbereid zoals beschreven in het bijbehorende schriftelijke protocol en de DA-neuronen expresseren een CD8-GFP-fusie-eiwit dat door het antilichaam wordt herkend. Start de cel sortering door 15 µL antilichaam-gecoate magnetische beads toe te voegen aan 500 µL cel-suspensie. Incubeer de cellen met de antilichaam-gecoate magnetische beads gedurende 30 tot 60 minuten op ijs, waarbij af en toe handmatig wordt gemengd; incubatie bij een hogere temperatuur of gedurende een langere tijd kan leiden tot aspecifieke antilichaambinding.Plaats vervolgens de micro-centrifugebuis gedurende twee minuten in een sterk magnetisch veld. Alle positief geselecteerde cellen samen met de ongebonden beads zullen zich aan de wand van de buis hechten; aspireer langzaam het supernatant zonder het celpellet te verstoren en was de cellen drie tot vier keer met verse, ijskoude PBS. Deze stap verwijdert alle resterende aspecifieke cellen.Resuspendeer de cellen ten slotte in 30 µL vers, ijskoud PBS om de zuiverheid en opbrengst van de cellen te schatten. Pipetteer vijf µL van de celsuspensie op het gepolijste oppervlak van een hemocytometer en tel alle zichtbare fluorescerende cellen onder een fluorescent stereomicroscoop. Controleer daarnaast de hoeveelheid niet-fluorescerende cellen en eventuele tekenen van onzuiverheden.Normaal gesproken zal het monster sterk verrijkt zijn met fluorescente cellen. Gebruik tot slot de pico pure RNA-isolatiekit om RNA te isoleren uit de cellen die aan de beads zijn gebonden. Voeg de extractiebuffer toe aan de gesorteerde cellen, maar verwijder de beads met een magneet vóór de zuiveringsstap met de kolom; gebruik 1 µL van het geëxtraheerde RNA om de totale RNA-kwaliteit te beoordelen op een Agilent Bioanalyzer 2100.Het RNA dat is gezuiverd uit de geïsoleerde DA-neuronen is van uitstekende kwaliteit, zoals blijkt uit de aanwezigheid van scherpe 5,8 s en 28 s ribosomaal RNA-pieken bij analyse met een Agilent 2100 Bioanalyzer. Beginnend bij het 30e tot 43e stadium in sterlarven waren wij in staat om gemiddeld 300 tot 500 klasse vier DA-neuronen te isoleren met behulp van de PPK gal4-driver en 1500 tot 2000 DA-neuronen van de klassen 1, 2, 3 en 4. Met behulp van een pnr-neuronenspecifieke gal4-driver onthulde kwantitatieve RT-PCR met L11 en fch, welke neuronenspecifieke markers zijn, een significante fold-verrijking van beide, wat wijst op een zeer specifieke verrijking voor DA-neuronen met het door ons gedemonstreerde protocol vergeleken met de flow-through. Ten slotte werd het geïsoleerde RNA van zowel pnr-neuronen als klasse vier DA-neuronen gebruikt om transcriptionele expressieprofilering uit te voeren op Agilent Drosophila melanogaster whole genome oligo-microarrays, waarbij vele factoren werden geïdentificeerd die betrokken zijn bij de morfogenese van DA-neuronen.We hebben u laten zien hoe u perifere neuronen van drosophila kunt isoleren en zuiveren via magnetische kraal-sortering uit het derde instadium van de larvale ontwikkeling. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om een balans te vinden tussen de enzymatische en mechanische dissociatiestappen. Overmatige enzymatische dissociatie kan leiden tot de degradatie van CD8 celoppervlaktemarkers, wat resulteert in een inefficiënte of mislukte cel-sortering.Het is tevens belangrijk om gedurende de gehele procedure RNA-vrije omstandigheden te handhaven om de integriteit van het gezuiverde RNA uit de geïsoleerde neuronen te waarborgen. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

isolation-purification-drosophila-peripheral-neurons-magnetic-bead

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In deze video-artikel stellen we een methode voor het isoleren van een of...

Laser capture microdissectie van Drosophila Perifere neuronen

Dit is een protocol om actief volle lengte Kinesine isoleren...

Isolatie en zuivering van kinesine uit Drosophila Embryo&#39;s

This video demonstrates a method to isolate primary oligodendrocyte cells from a neural cell suspension obtained from a mouse pup using magnetic separation. The technique employs magnetic beads coated with antibodies specific to oligodendrocyte antigens, enabling selective isolation of these cells.

Isolating Murine Primary Oligodendrocytes Using Immunomagnetic Beads

This video demonstrates a protocol for extracting microglial cells from demyelinating lesions in mouse brains using magnetic cell sorting. The protocol involves dissecting the lesioned brain tissue containing microglial cells, treating the tissue with specific enzymes to obtain a single-cell suspension, and utilizing microglial receptor-specific magnetic beads to isolate the microglial cells.

Isolating Microglia from Mouse Brain Demyelinating Lesions Using Magnetic Activated Cell Sorting

Drosophila weefsels bevatten vaak een heterogeen mengsel van celtypen. Om genexpressie in bepaalde celtypes van een bepaald weefsel te onderzoeken, kan kernen genetisch gemerkt en vervolgens geïsoleerd met behulp van een op affiniteit gebaseerde benadering. Geïsoleerde kernen kan worden gebruikt voor verdere toepassingen zoals genexpressie analyse en chromatine immunoprecipitatie.

-Affiniteit gebaseerde Isolatie van Tagged Kernen uit<em&gt; Drosophila</em&gt; Tissues voor de analyse van genexpressie

Het vertalen van Ribosoom Afiniteitszuivering (TRAP) kan de celtype-specifieke translatie van mRNA vastleggen. Hier rapporteren we het eerste TRAP-protocol dat zich richt op de isolatie van mRNA in zeldzame celpopulaties van Drosophila-embryo's.

TRAP-rc, vertalen Ribosoom Affiniteitszuivering van Rare Cell Populaties van<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo

Organspecifieke sensorische neuronen zijn moeilijk te identificeren. Fast Blue tracing wordt gebruikt om nodose neuronen die de luchtwegen innerveren te identificeren voor celsortering. Gesorteerde nodose neuronen worden gebruikt om hoogwaardig ribonucleïnezuur (RNA) te extraheren voor sequencing. Met behulp van dit protocol wordt de genexpressie van specifieke luchtwegneuronen bepaald.

Een methode te richten en te isoleren Airway-innerveren sensorische neuronen in Muizen

We beschrijven de immunomagnetic isolatie van primaire muisknop oligodendrocyten, waarmee het snelle en specifieke isolement van de cellen voor in vitro cultuur.

Snelle en specifieke Immunomagnetic isolatie van de primaire oligodendrocyten muis

Hier presenteren we een cel dissociatie protocol voor het efficiënt isoleren van cellen aanwezig bij lage overvloed binnen het visuele systeem van Drosophila door fluorescentie geactiveerd cell sorting (FACS).

Zuivering van Low-overvloedig cellen in het visuele systeem van Drosophila

Hier presenteren we een protocol om primaire microglia te isoleren en te zuiveren in diermodellen van demyeliniserende ziekten, met behulp van kolomvormige magnetisch geactiveerde celsortering.

Isolatie van primaire microglia van muizen door magnetisch geactiveerde celsortering in diermodellen van demyelinisatie

We beschrijven een protocol voor het isoleren van microgliacellen uit de hypothalamus van de muis (of gelijkwaardige kleine hersenstructuren) met behulp van magnetisch geactiveerde celsortering (MACS), in een relatief korte tijd. De MACS-gesorteerde hypothalamische microglia kunnen worden gebruikt voor ex vivo-analyse en kunnen worden geplateerd om in vitro-assays uit te voeren.

Isolatie van hypothalamische microglia uit vers doorbloede volwassen muizenhersenen door magnetisch geactiveerde celsortering  

Leer de isolatie en zuivering van Drosophila perifere neuronen door magnetische kralen sortering. Deze methode maakt snelle celscheiding mogelijk voor RNA-analyse en transcriptoomonderzoek in neurobiologie.

Isolatie en zuivering van Drosophila Perifere neuronen door Magnetic Bead sorteren

Meer video's verkennen