Dissectie van 6,5 dpc muizenembryo's

Mijn naam is Kelly Shea; ik ben de laboratoriummanager en tevens een onderzoekstechnicus in het laboratorium van Neilsen. Het is erg lastig, omdat veel mensen niet weten hoe ze de verschillende weefsellagen moeten onderscheiden. Wat u in essentie moet doen, is alle weefsellagen terugpellen om het onderliggende embryo bloot te leggen, dat op dit punt nog niet sterk gevasculariseerd is. Hierdoor is het zeer transparant en moeilijk te onderscheiden.

Neem stomp gepunte pincetten en een schaar. Begin met het vastknijpen van het dier precies langs de middellijn en maak vervolgens een eerste incisie. Vanaf dat punt kunt u de huid simpelweg uiteentrekken, waardoor de buikholte van het dier wordt blootgesteld.

Er is een dunne laag van het peritoneum die u met de pincet omhoog trekt, waarna u deze met een schaar kunt doorknippen en naar achteren kunt klappen. Knip vervolgens langs het midden van het dier en trek beide uterine hoorns, die in het midden met elkaar verbonden zijn, uit elkaar. U kunt direct aan de basis knippen.

Waarschijnlijk zult u er ook veel vet bij krijgen. Neem de gehele uterinehoorn van het dier. Plaats deze direct in de PBS.

Dit is dus in de hoorn. Dit zijn de implantatieplaatsen 1, 2, 3, 4, 5. Wat u nu moet doen, is ze simpelweg van elkaar scheiden.

U kunt in principe hier tussen de implantatieplaatsen doorsnijden. U kunt het embryo aan de zijkant vastpakken en het in feite openwrikken. Op dit punt legt u het duodenum bloot, wat een sponsiger weefsel is dat eronder ligt.

Het embryo moet dus precies in het midden liggen, hier. Dit is de apex van het decidua. Je moet het zo oriënteren dat de apex naar boven wijst.

U zult vervolgens ongeveer een vijfde vanaf de apex afknippen. Het embryo moet hier precies in het midden liggen. Ik oriënteer het zijwaarts, pak het vast met één paar pincetten, houd het met de andere vast, knip de punt eraf en scheid het vervolgens.

Zodra het dopje is verwijderd, zet u het embryo op zijn zijkant. En zoals u kunt zien, is er een opening precies op de plek waar u het dopje heeft verwijderd. Wrik de pincet daar gewoon in. Ja.

Op dit punt zit het embryo heel los in het duodenum. Zodra u het duodenum openwrikt, kunt u het er in principe relatief eenvoudig uithalen, zolang u er maar onder de basis komt. Het is erg klein.

Er zijn ook nog enkele weefsels die aan het embryo vastzitten. U ziet de ectoplacentale kegel, die zich hier bevindt op de apex van het embryo. Daarnaast zijn er nog andere weefsels die nog vastzitten.

Ik neem dus de pipet en zuig hem op. Op dit punt wilt u de embryo's fixeren. Hiervoor heb ik een schaaltje met PFA.

We wilden kandidaatgenen onderzoeken. In essentie maken we gebruik van whole mount RNA-in situ-technieken om de productie van nucleïnezuren in situ binnen een embryo te visualiseren. Deze specifieke genen waar we zeer geïnteresseerd in zijn, coderen voor vermeende markers voor kiemcelvoorlopers; bovendien wordt voorspeld dat ze in het muizenembryo worden tot expressie gebracht op een specifiek tijdstip dat de kiemcellen helpt bij de ontwikkeling en rijping van vermeende kiemcelvoorlopers tot kiemcellen.

Een van de factoren waarin we zeer geïnteresseerd zijn, en de eerste factor waarop we daadwerkelijk whole mount in situ hybridisatie hebben uitgevoerd op deze embryo's van dag 6,5, was bone morphogenic protein 4 (BMP4). Dit is een lid van de TGF-beta superfamilie. Het is zeer belangrijk en absoluut vereist voor de rijping van kiemcellen.

Bovendien moeten de kiemcellen door het embryo migreren en zich vestigen nabij de primitieve streep van het embryo. BMP4 speelt een cruciale rol in zowel de signalering als de rijping die de kiemcellen moeten ondergaan om zich in de primitieve streep te kunnen bevinden. Daarom is het belangrijk om, ten eerste, precies te weten waarnaar u op zoek bent, hoe klein het is en op welke schaal u werkt, en om daarna zeer zorgvuldig een planning te maken.

De techniek, in het bijzonder met betrekking tot het type dissectiemicroscoop dat u gaat gebruiken. Een van de technische moeilijkheden is dat dit veel manipulatie en zeer gestage handbewegingen vereist, zodat u het embryo niet beschadigt. U wilt daarom een dissectiemicroscoop hebben die voldoende ruimte biedt voor manipulatie; zorg er daarnaast voor dat alles wat u voor het experiment nodig heeft klaarligt, zodat u tijdens de dissectie niet meer hoeft te manipuleren dan strikt noodzakelijk is.

Verder denk ik dat u het heel rustig aan moet doen en de individuele weefsellagen zeer langzaam moet wegpellen, zodat u precies weet wat u doet. Zorg er ook voor dat u weet waar het embryo zich bevindt.