Name: Intranucleaire micro-injectie van DNA in gedissocieerde Adult zoogdieren Neuronen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-10T17:10:00.000+00:00
Duration: 13 min 39 s
Description: Leer intranucleaire micro-injectie van cDNA in gedissocieerde volwassen zoogdierneuronen voor functionele eiwitstudies. Deze methode bereikt hoge expressieniveaus in post-mitotische cellen die traditioneel moeilijk te transficeren zijn.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ons laboratorium onderzoek wordt ondersteund door de Intramurale Research Program van de NIH, National Institute on Alcohol misbruik en alcoholisme.

<html> I. Voorbereiding voor injectie Deze sectie beschrijft de voorbereidende stappen die moeten vooraf worden genomen om te injecteren cDNA in de kern van neuronen. De isolatie procedure voor neuronen valt buiten het bestek van dit artikel, maar het is belangrijk om neuronen gescheiden in individuele cellen hebben en hechten goed aan de onderkant van 35 mm celkweek gerechten (zie Overleg voor nuttige tips om dit te bereiken). Hoewel een verscheidenheid van verschillende neuronen zou kunnen worden gebruikt, zijn perifere ganglia, zoals de superieure cervicale ganglia (SCG) of de achterwortelganglia voorkeur voor dissectie, omdat ze gemakkelijk toegankelijk zijn en de opbrengst van een groot aantal neuronen. Bijkomende voordelen van het gebruik van SCG neuronen zijn dat ze een relatief homogene populatie van cellen en goed gekarakteriseerde 1,2,3,4. A. Bereiding van plasmide cDNA voor injectie <ol><li> Om te voorkomen dat verontreiniging of afbraak van DNA, moeten handschoenen worden gedragen tijdens de voorbereiding. </li><li> DNA dat codeert voor het eiwit van belang is gesubkloneerd in een geschikte expressievector zoogdier, zoals PCI (Promega, Madison, WI), onder de regulering van de zeer en de constitutief actieve cytomegalovirus (CMV) promotor. Als het eiwit niet wordt gelabeld, een reporter plasmide, is codering EGFP bijvoorbeeld (pEGFP-N1, BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA), co-geïnjecteerd om succesvolle injectie en expressie te bevestigen. DNA wordt geïsoleerd met behulp van een hoge kwaliteit scheidingskolom (bijv. QIAfilter Midi-prep-kit, Qiagen, Chatsworth, CA) en verder gezuiverd met behulp van een centrifugale filter unit met een PVDF filter (0,1 urn, Millipore, Bedford, MA) om deeltjes te verwijderen in de plasmide voorbereiding, die injectie pipetten kunnen een belemmering vormen tijdens de injectie proces. Plasmiden worden bewaard bij -20 ° C bij een concentratie van ongeveer 1 ug / ul in een geschikte DNA opslagbuffer (bijv. TE-buffer: 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0). </li><li> Onmiddellijk voorafgaand aan de micro-injectie, zijn plasmide cDNAs verdund en gemengd om de gewenste uiteindelijke concentratie in TE-buffer of H 2 O. Typisch, 5-10 ng / ul van het reportergen is voldoende om geïnjecteerde cellen label, en de totale concentratie van cDNA te worden geïnjecteerd mag niet meer dan 200 ng / ul, omdat DNA is viskeus bij hoge concentraties en kunnen verstoppen injectie pipetten. Een klein volume van het cDNA voor injectie (5-10 pi) wordt bereid door het mengen van druppels van de oplossing op de schone oppervlak van een klein stukje van Parafilm (zijkant onder de papieren achterkant). Meng de druppels van de oplossing door pipetteren op en neer meerdere malen met een pipetor en voorkomen dat er luchtbellen tijdens het mixen. </li><li> Met behulp van een pipet microloader tip (Eppendorf, Brinkmann Instruments, Westbury, NY), overdracht van het cDNA oplossing voor een speciaal geprepareerde hematocriet buis (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Zie materialen sectie voor instructies over het bereiden hematocriet buizen (Materialen tabel). Plaats de hematocriet buis met de cDNA injectie oplossing in een 1,5 ml microcentrifugebuis. </li><li> Centrifugeer de buis voor 15-30 minuten bij 10 000 g in een microcentrifuge is uitgerust met een vaste hoek of swingende emmer rotor (Eppendorf), bij kamertemperatuur (20-24 ° C) om sediment deeltjes in de cDNA oplossing die kan blokkeren de micro-injectie pipet. De cDNA-oplossing voor injectie kan worden bewaard bij kamertemperatuur tijdens de injectie sessie. </li></ol> B. Fabricatie van injectie pipetten <ol><li> Wegwerp glazen micro-injectie pipetten zijn commercieel verkrijgbaar (bijv. Femtotips, Eppendorf), die zijn handig, maar duur (10 dollar per micro-injectie pipet). Injectie pipetten kunnen worden vervaardigd in het laboratorium met behulp van een programmeerbare P-97 Flaming Brown pipet trekker (Sutter Instrument Company, Novato, CA) en filamented, dunwandige borosilicaatglas capillaire buisjes (World precisie-instrumenten, Sarasota, FL). Deze optie is meer kosteneffectief en zorgt voor de controle van micro-injectie pipet vorm en grootte. </li><li> Een twee-fase programma wordt gebruikt om smalle microinjectie pipetpunten trekken. Sinds de opening van de micro-injectie pipetten te smal is om te onderzoeken onder een lichtmicroscoop, de kwaliteit van de injectie pipetten moeten direct worden geëvalueerd door het injecteren van een paar cellen voor de programma-instellingen zijn afgerond. De volgende instellingen zijn bij benadering voor warmte, trek, snelheid en tijd instellingen: (pull 1) 600, 115, 15, 250, (pull 2) 640, 130, 65, 200. Deze instellingen variëren met verschillende batches van glas en door de toestand van de verwarming filament in de trekker, en dient te worden aangepast zoveel als nodig. Voor meer details zie 5. </li><li> Trek een aantal (2-5) injectie pipetten per schotel van neuronen te worden geïnjecteerd, in geval van schade of problemen tijdens de injectie sessie. Bewaar injectie pipetten in een afgedekte container om stof te voorkomen dat de micro-injectie pipet tip. </li></ol> II. Intranucleaire micro-injectie tent &quot;&gt; Dit hoofdstuk beschrijft het proces van het injecteren van cDNA in de kern van neuronen. Een eenvoudige micro-injectie set-up bestaat uit een omgekeerde fase-contrast microscoop (bijv. Nikon Diaphot TMD, Nikon, Melville, NY) om het proces te visualiseren, micromanipulator (bijv. Eppendorf 5171) om de beweging van de injectie pipet en een druk injector (bijv. Eppendorf FemtoJet Express) drukken om de cDNA-oplossing te verdrijven uit de pipet. aansluiten van de druk injector aan de micromanipulator zorgt voor de synchronisatie van de laatste twee processen tijdens injecties. Andere optioneel, maar wordt sterk aanbevolen, componenten zijn onder andere een gemonteerde video monitoring systeem (CCD-camera, Cohu Inc, San Diego, CA; zwart-wit video monitor, Sony Corporation, Tokio, Japan). Dit systeem is niet een absolute vereiste voor injecties; echter, de zwarte en witte monitor biedt een hoog contrast voor een betere visualisatie van de celkern en biedt een meer comfortabele kijkervaring tijdens lange injectie sessies. Daarnaast is een laptop computer met software om een ​​hand-held controller te bedienen kan worden gebruikt om semi- automatiseren van de injectie proces (zie Overleg voor details). Het ideale moment om SCG neuronen injecteren is 3-6 uur na de dissociatie. In dit stadium, de cellen zijn bolvormig, stevig bevestigd aan de bodem van de schaal, en de kern is duidelijk zichtbaar, onder een fase-contrast microscoop, als centrale ronde organel met een donkere membraan, met een enkele of meerdere nucleoli (Figuur 1A). <ol><li> Plaats een schotel van gedissocieerd neuronen in het midden van de microscoop podium. Stel het beeld scherp en het optimaliseren van de fase contrast optiek van de microscoop, zodat de kernen van neuronen zijn duidelijk zichtbaar. </li><li> Pipetteer 2 pi cDNA bereide oplossing in een micro-injectie pipet met behulp van een pipet microloader tip. Vermijden, up oplossing in de buurt van de bodem van de hematocriet buis, omdat dit kan opwekken deeltjes die gevestigd tijdens het centrifugeren. De gloeidraad in de micro-injectie pipetten moet de steun bij het opstellen oplossing voor de tip, maar als kleine luchtbelletjes blijven bestaan, tik zachtjes tegen de zijkant van het glas om ze te verjagen. </li><li> Steek de micro-injectie pipet in de capillaire houder van de druk injector en bevestig de houder aan de micromanipulator. De houder is vastgesteld op een hoek van 45 °. </li><li> Laat de micro-injectie pipet in de schaal. Omdat de pipet komt het kweekmedium, is een meniscus gevormd die van invloed op de breking van licht en verlaagt de beeldkwaliteit van de neuronen. Te verlichten dit probleem, kan de fase-ring-toren enigszins worden gecompenseerd tot de kernen van neuronen zijn duidelijk weer zichtbaar. </li><li> Enige druk injectie systemen hebben een &quot;schone&quot;-functie die maximale luchtdruk van de micro-injectie pipet tip voor een korte duur van toepassing. Gebruik deze functie om de pipet van puin te ruimen voor het begin en tijdens injecties als de tip verschijnt verstopt. Als verdreven vloeistof is niet zichtbaar op het scherm tijdens het gebruik van deze functie, te vervangen door een nieuwe injectie pipet. </li><li> Midden van de micro-injectie pipet in het weergavevenster monitor en lijn de tip naast een neuron en in hetzelfde focal plane als de nucleolus. Stel deze positie als de lagere z-as limiet op de micromanipulator. Deze positie is de diepte van de micro-injectie pipet zal om verder te gaan tijdens de injecties. Nu de positie van de tip ongeveer 30 micrometer boven dit punt, zodat de micro-injectie pipet wist de top van de neuronen. </li><li> Het &quot;injecteren&quot;-modus van een Eppendorf 5171 micromanipulator kan worden gedefinieerd met de volgende instellingen om intranucleaire injecties uit te voeren. Het injecteren functie is ingeschakeld, terwijl de spiesen functie is gebleven. Een diagonaal injectie pad (langs de x-en z-as) levert de minste hoeveelheid celbeschadiging, en dus ook de axiale modus moet worden gebruikt voor injecties. Een injectie snelheid van 300 um / s voldoende is, en synchroniseren drukopbouw als de micro-injectie pipet bereikt de set z-as te beperken. </li><li> De druk injector regelt de hoeveelheid cDNA-oplossing geïnjecteerd in de kern. In de &quot;automatische&quot; injectie-modus, de levering van DNA is de tijd-gestuurd en op initiatief van de aangesloten micromanipulator. De injectie druk (Pi) moet worden ingesteld tussen 100 tot 200 hectopascal (hPa; 1 hPa ~ 0.015 psi); hogere injectiedruk niet verbeteren slagingspercentages of kwaliteit van de injecties en kunnen andere problemen geven met de micro-injectie pipet tip grootte of de DNA zuiverheid . Een injectie duur (TI) van 0,3 s en een vergoeding druk (Pc) van 30 hPa, die een constante positieve druk om de toegang van de afsluiter deeltjes uit het kweekmedium in de pipet te voorkomen tip levert, worden gebruikt. </li><li> Plaats het neuron te worden geïnjecteerd onder het topje van de micro-injectie pipet met behulp van de microscoop van de xy-as stadium controle. Lijn het puntje van de pipet boven het midden van de kern door te focussen heen en weer tussen tHij tip en de nucleoli. </li><li> Injecteer de kern door te drukken op de knop injecteren (op de micromanipulator). Voor de injectie stap worden de beweging van de micro-injectie pipet en de vrijlating van cDNA-oplossing gecontroleerd door de micromanipulator. Het is moeilijk om een ​​succesvolle intranucleaire injecties te bevestigen door het oog, maar de injectie van de relatief lage viscositeit cDNA-oplossing (in vergelijking met de viskeuze nucleaire milieu), vaak verschijnt als een witte pluim onder fase-contrast optica en kan gebruikt worden als een indicator van de injectie in de kern. Soms is de micro-injectie pipet niet doordringen in de kernmembraan en gewoon duwt de kern. Een tweede injectie poging op dezelfde positie kan leiden tot een succesvolle injectie van DNA in de kern. Zwelling van de cel is meestal een indicatie van onbedoelde cytoplasmatische injectie. Ook is het belangrijk nucleaire zwelling niet goed verdragen door de neuronen en meestal resulteert in celdood kort daarna, dus de inspuitdruk en de duur mag niet meer dan de aanbevolen waarden. </li><li> Ga verder injecteren van neuronen door de herpositionering van de microscoop etappe naar de volgende neuron af te stemmen onder de micro-injectie pipet. Systematisch navigeren door de schotel op ongeveer 50 tot 100 kernen injecteren alvorens terug te keren de schotel van neuronen naar de incubator voor overnachting incubatie. Met succes geïnjecteerd neuronen kan worden geïdentificeerd van de volgende dag door expressie van het reportergen. </li></ol> III. Representatieve resultaten <img src="/files/ftp_upload/1614/1614fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1: Superior cervicale ganglion (SCG) neuronen. Fase contrast beeld van SCG neuronen 3 uur post-dissociatie (A). In dit stadium, de kern is duidelijk zichtbaar wat helpt uitlijning van de micro-injectie pipet tip. De kern verschijnt in het midden van de neuronen met een enkele (links) of meerdere (rechts) dark nucleoli. SCG neuronen 16 uur na de injectie van EGFP cDNA in de kern (B). Links, SCG neuronen bekeken onder fase-contrast verlichting. Rechts, epifluorescerende beeld van dezelfde neuronen met succesvolle injectie en de daaruit voortvloeiende EGFP expressie in een neuron. Witte schaal bar is 20 micrometer. <img src="/files/ftp_upload/1614/1614figure2tmb.jpg" alt="Figuur 2" border="0" /> Figuur 2: whole-cell opnames van stromen door middel van heteroloog tot expressie G-eiwit gekoppelde innerlijk herstellen van K + (GIRK) kanalen van SCG neuronen. GIRK stromen (I GIRK) werden opgeroepen door een 200 ms spanning helling -140 tot 40 mV van een bedrijf potentieel van -60 mV (inzet van A) na activatie van endogene α 2-receptoren door norepinefrine (NE, 10 uM) . Gesuperponeerd sporen zijn opnames van dezelfde neuron en vermeld voor (zwart) en na toepassing van een van beide NE alleen (blauw) of NE plus 10 mM Ba 2 + (rood). Onderbroken lijnen geven het huidige niveau nul. Voor het opnemen ik GIRK, het ingeperkte externe oplossing (in mm) 130 NaCl, KCl 5,4, 10 HEPES, 10 CaCl2, 0,8 MgCl 2, 15 glucose, sucrose 15 en 0,0003 TTX, op pH 7,4 met NaOH. De interne opname oplossing bevatte (in mm) 135 KCl, 11 EGTA, een CaCl 2, 2 MgCl 2, 10 HEPES, 4 MgATP, en 0,3 Na 2 GTP, op pH 7,2 met KOH. Het gebrek aan stroom opgewekt door de spanning ramp in de aanwezigheid van NE in uninjected SCG neuronen (A) toont aan dat SCG neuronen niet drukken endogene GIRK kanalen. Succesvolle injectie van plasmide cDNA dat codeert voor een functioneel GIRK kanaal 11 geeft aanleiding tot grote stromen tijdens het voltage oprit bij blootstelling aan NE (B, links). Stromingen hebben de typische kenmerken van de stromen via GIRK kanalen: activering door een G-eiwit gekoppelde receptor agonist (NE), actieve rectificatie, en blokkeren van de stromen door de vermeende GIRK-blokker, Ba 2 + (B, rechts rood spoor). Open en gevulde cirkels vertegenwoordigen ik GIRK op het bedrijf en de piekstroom respectievelijk. Gelieve <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1614/1614figure2.jpg">Klik hier</a> voor een grotere versie van figuur 2 te zien.

<ol><li>Eccles, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+action+potential+of+the+superior+cervical+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The action potential of the superior cervical ganglion.</a> J Physiol. 85, 179-206 (1935).</li>
<li>Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-dependent+modulation+of+N-type+calcium+channels+by+G-protein+%CE%B2%CE%B3+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Voltage-dependent modulation of N-type calcium channels by G-protein βγ subunits.</a> Nature. 380, 255-258 (1996).</li>
<li>Schofield, G. G., Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+currents+of+acutely+isolated+adult+rat+superior+cervical+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Potassium currents of acutely isolated adult rat superior cervical ganglion neurons.</a> Brain Res. 485, 205-214 (1989).</li>
<li>Schofield, G. G., Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+and+calcium+currents+of+acutely+isolated+adult+rat+superior+cervical+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Sodium and calcium currents of acutely isolated adult rat superior cervical ganglion neurons.</a> Pflugers Arch. 411, 481-490 (1988).</li>
<li>Dean, D. A. Chapter 4. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDean%2C+DA+%22Live+Cell+Imaging%3A+a+Laboratory+Manual%22">Live Cell Imaging: a Laboratory Manual</a>. Goldman, R. D., Spector, D. L. 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 51-66 (2005).</li>
<li>Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+expression+of+receptors+and+signaling+proteins+in+adult+mammalian+sympathetic+neurons+by+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Heterologous expression of receptors and signaling proteins in adult mammalian sympathetic neurons by microinjection.</a> Methods Mol Biol. 83, 191-202 (1997).</li>
<li>Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+G-protein+signaling+components+in+adult+mammalian+neurons+by+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of G-protein signaling components in adult mammalian neurons by microinjection.</a> Methods Mol Biol. 259, 167-181 (2004).</li>
<li>Ikeda, S. R., Jeong, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+RGS-insensitive+G%CE%B1+subunits+to+study+endogenous+RGS+protein+action+on+G-protein+modulation+of+N-type+calcium+channels+in+sympathetic+neurons.%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Use of RGS-insensitive Gα subunits to study endogenous RGS protein action on G-protein modulation of N-type calcium channels in sympathetic neurons.</a> Methods Enzymol. 389, 170-189 (2004).</li>
<li>Washbourne, P., McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+gene+transfer+into+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Techniques for gene transfer into neurons.</a> Curr Opin Neurobiol. 12, 566-573 (2002).</li>
<li>Zhang, Y., Yu, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+microinjection+technology+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Single-cell microinjection technology in cell biology.</a> Bioessays. 30, 606-610 (2008).</li>
<li>Vivaudou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+G-protein+regulation+of+GIRK1+and+GIRK4%2C+the+two+subunits+of+the+KACh+channel%2C+using+functional+homomeric+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Probing the G-protein regulation of GIRK1 and GIRK4, the two subunits of the KACh channel, using functional homomeric mutants.</a> J Biol Chem. 272, 31553-31560 (1997).</li>
</ol>

Voorkomende problemen en suggesties: Zoals eerder vermeld, een succesvolle nucleaire injecties zijn afhankelijk van die cellen aanhanger van weefselkweek platen. Het uitstellen van de start van de injecties een paar uur na de cel dissociatie procedure laat neuronen te houden aan de onderkant van gerechten. Daarnaast, coating gerechten met 0,1 mg / ml met een hoog molecuulgewicht poly-L-lysine (Sigma, St. Louis, MO) helpt de hechting van neuronen aan de onderkant van de gerechten. Blokkering van micro-injectie pipetten, vooral als een poging om een ​​hoge concentratie van DNA injecteren, kan een veel voorkomend probleem te zijn. Met behulp van hoge kwaliteit scheiding kolommen te isoleren en te zuiveren plasmide DNA, en het uitvoeren van de bijkomende zuiveringsstappen vermeld (spin filters, spinning in hematocriet buizen) kan helpen om deeltjes te verwijderen voorafgaand aan de injectie. Tijdens de injecties, kan de &quot;schone&quot; functie van de druk injector worden gebruikt (bij 0,2 s is voldoende), maar als dat het probleem niet oplost, een nieuwe injectie pipet moet worden gebruikt. Als de meerderheid van micro-injectie pipetten verstopt raken tijdens een injectie sessie, overweeg dan het veranderen van de instellingen van de glazen pipet trekker naar micro-injectie pipetpunten te produceren met een grotere opening. Een ander probleem dat zich voordoet tijdens de nucleaire injecties is de oneffenheden van de onderkant van weefselkweek gerechten. Deze variabiliteit rechtstreeks van invloed op de doelgerichtheid nauwkeurigheid van de injectie pipet tips om de kern, omdat de diepte van de pipet doorkruist tijdens de injecties is opgelost. Daarom moet dit z-as grens worden aangepast in de loop van injecties in hetzelfde gerecht. Het zal duidelijk zijn wanneer een aanpassing nodig is: er zal geen aanwijzing van nucleaire injectie (geen witte pluim in de kern of de cel is volledig gemist), of de injectie pipet tip komt dicht bij de bodem van de schaal (het comprimeren van de cel of zelfs crashen van de pipet tip in de bodem van de schaal). Glas-klonen cilinders (. OD 10 mm, Cat No 2.090 tot 01.010, Bellco Glas, Vineland, New Jersey), kan worden gebruikt tijdens de beplating van de neuronen om hen te beperken in een kleinere, meer beperkt gebied, dus het minimaliseren van de afstand die nodig is om te bewegen de injectie pipet tussen de injecties. Deze klonen cilinders zijn verwijderd voor het uitvoeren van micro-injecties. Nadelen van de techniek: Intranucleaire micro-injecties zijn technisch veeleisend, die vereisen geduld en een hoge mate van handvaardigheid door de operator. Vaardigheid met deze techniek, net als bij elke andere vaardigheid, komt met de praktijk. Het is dus aangeraden om alleen de praktijk nucleaire injecties van het reporter-gen voordat de werkelijke experimenten. Ter verdere ondersteuning van de injectie proces, kan het mogelijk zijn om de stappen van de micromanipulator en druk injector in een computerprogramma te consolideren. Programma&#39;s zoals Igor Pro (WaveMetrics, Lake Oswego, OR) kan worden gebruikt om micro-injectie instellingen op te slaan en te multifunctionele regelaars (ShuttlePRO, Contour Design, Windham, NH) programma om semi-automatiseren van de injectie proces (zie 6,7,8 voor details). Een ander nadeel van de intranucleaire micro-injectie techniek is het lage slagingspercentage. Ongeveer 10-20% van poging tot kernenergie injecties leiden tot eiwitexpressie. Terwijl dit rendement kan voldoende zijn voor toepassingen die niet nodig een groot aantal uit te drukken cellen, elektrofysiologie bijvoorbeeld voor verschillende biochemische assays kan dit niet voldoende zijn. Toepassingen van techniek: Ondanks de nadelen, intranucleaire micro-injectie van DNA is een zeer nuttige techniek voor het heteroloog tot expressie eiwitten in neuronen. Hoge niveaus van eiwitexpressie worden bereikt met nucleaire micro-injecties vanwege het grote aantal plasmiden vrij in de kern tijdens de injecties, een zeer actieve CMV promoter reguleren van gentranscriptie, en een lange stabiliteit van plasmiden in de kern. Eiwit over-expressie is vooral nuttig in de dominant-negatieve experimenten waarbij een hoog niveau van heterologe eiwitten zijn nodig om de endogene eiwit overweldigen. Een ander voordeel van intranucleaire injecties is de mogelijkheid om een ​​consistent deel van de cDNA constructen te leveren aan de kern wanneer er meerdere constructen geïnjecteerd. Met andere transfectie methoden, is het moeilijk om reproduceerbaar te introduceren hetzelfde aandeel van elke DNA in verschillende cellen te bouwen binnen hetzelfde gerecht en tussen transfecties. Directe injectie van cDNA-oplossing in de kern elimineert deze bron van variabiliteit en laat de verhouding van tot expressie gebrachte eiwitten effectief worden getitreerd. Traditionele transfectie methoden hebben een beperkt effect in de post-mitotische cellen vanwege de lage opname van DNA in de kern 9 en chemische toxiciteit geassocieerd met transfectie Reagouders 10. Nucleaire micro-injecties overwinnen van deze problemen door de invoering van genetisch materiaal mechanisch in de kern. Hoewel deze techniek is meer betrokken, de mogelijkheid om het effect van een eiwit in een biologisch systeem functioneel onderzoek, compleet met endogene signaalwegen, meer dan compenseert voor de moeizame karakter van deze techniek. Alle experimentele procedures op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de National Institutes of Health Guidelines for Animal Care en gebruik.

<table><tbody><tr><td>Ultrafree-MC Filter Unit</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC30VV00</td><td>Durapore PVDF-filter; 0.1 &amp;#x03BC;m poriegrootte</td></tr><tr><td>TE-buffer</td><td>Quality Biological, Inc.</td><td>351-010-131</td><td>10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0</td></tr><tr><td>Micro-hematocriet capillairbuisjes</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-362-574</td><td>Niet-gehepariniseerd Voorbereiding:&lt;br/&gt;Overnacht weken in 100% ethanol. Drie keer grondig wassen met gedeïoniseerd water en het glas droog bakken in een oven (95&amp;#x00B0;C). Snijd de gereinigde hematocrietbuisjes in stukken van 3-4 cm lengte met een diamantstift en smelt één uiteinde dicht met een vlam, gebruikmakend van een pincet om het glas vast te houden. Bewaren in een schoon glazen bekerglas en afdekken om stofophoping te voorkomen.</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5417 R</td><td>Met een rotor met vaste hoek of een zwaairotor</td></tr><tr><td>Microloader 20 &amp;mu;l pipetpunten</td><td>Eppendorf</td><td>5242 956.003</td><td></td></tr><tr><td>Microinjectie capillairglas</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW120F-4</td><td>Dunwandig met filament, 1,2 mm buitendiameter, 0,9 mm binnendiameter, 100 mm lengte</td></tr><tr><td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td>Met platina-iridium box-filament (onderdeel # FB330B)</td></tr><tr><td>Nikon Diaphot TMD Inverted Microscoop</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>20x en 40x fasecontrast objectieven, gemonteerd op een trillingsisolatietafel</td></tr><tr><td>Charge-coupled device (CCD) camera</td><td>Cohu Inc.</td><td>6410</td><td></td></tr><tr><td>Videomonitor</td><td>Sony Corporation</td><td>PVM-122</td><td>Zwart-wit, 9&amp;#8221; scherm</td></tr><tr><td>Micromanipulatorsysteem</td><td>Eppendorf</td><td>5171</td><td></td></tr><tr><td>Microinjectie-eenheid</td><td>Eppendorf</td><td>FemtoJet Express</td><td></td></tr><tr><td>Microinjectiecontroller</td><td>Contour Design</td><td>S-PROV2</td><td>Programmeerbare multimedia-controller</td></tr><tr><td>Igor Pro</td><td>WaveMetrics</td><td>Version 4.05A</td><td>Commandoprogramma om de microinjectiecontroller aan te sturen, geschreven door S. Ikeda</td></tr></tbody></table>

intranucleaire micro-injectie van dna in gedissocieerde adult zoogdieren neuronen

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Primaire neuronale celkweken zijn waardevolle instrumenten om de functies van eiwitten bestuderen, omdat zij vertegenwoordigen een meer biologisch relevante systeem in vergelijking met onsterfelijk cellijnen. Echter, de post-mitotische aard van de primaire neuronen voorkomt effectief heterologe eiwitexpressie het gebruik van gemeenschappelijke procedures zoals elektroporatie of chemisch-gemedieerde transfectie. Dus, moeten andere technieken worden gebruikt om doeltreffend te kunnen eiwitten uit te drukken in deze niet-delende cellen. In dit artikel beschrijven we de stappen die nodig zijn om intranucleaire injecties van cDNA constructen te doen naar gedissocieerd volwassen sympathische neuronen. Deze techniek, die is toegepast op verschillende soorten neuronen, met succes kan veroorzaken heterologe eiwit expressie. De apparatuur van essentieel belang voor de micro-injectie procedure omvat een omgekeerde microscoop naar de cellen, een glas injectie pipet gevuld met cDNA-oplossing die is verbonden met een N 2 (g) druk aflevering systeem, en een micromanipulator visualiseren. De micromanipulator coördineert de injectie beweging van micro-injectie pipet met een korte puls van druk N 2 tot en met cDNA-oplossing uit te werpen uit de pipet tip. Deze techniek heeft niet de toxiciteit in verband met vele andere transfectie methoden en kunnen meerdere DNA-constructen worden uitgedrukt in een consistente verhouding. Het lage aantal geïnjecteerde cellen maakt de micro-injectie procedure zeer geschikt voor single cell studies zoals elektrofysiologische opnamen en optische beeldvorming, maar is wellicht niet ideaal voor biochemische assays dat een groter aantal cellen en de hogere transfectie efficiëntie vereisen. Hoewel intranucleaire micro-injecties een investering van apparatuur en de tijd, de mogelijkheid om hoge niveaus van heterologe eiwit expressie te bereiken in een fysiologisch relevante omgeving maakt deze techniek een zeer nuttig instrument om eiwit functie te onderzoeken.

Directe intranucleaire injectie van cDNA is een effectieve techniek voor transfectie post-mitotische cellen. Deze methode biedt een hoge mate van heterologe eiwitexpressie van een of meerdere cDNA constructen en maakt het mogelijk eiwit functie die moet worden bestudeerd in een fysiologisch relevante omgeving met een verscheidenheid van enkele cel assays.

Intranucleaire micro-injectie van DNA in gedissocieerde Adult zoogdieren Neuronen

Primaire neuronale celculturen zijn waardevolle instrumenten voor het bestuderen van eiwitfuncties, aangezien zij een biologisch relevanter systeem vertegenwoordigen in vergelijking met ...

In de eerste stap van deze injectieprocedure wordt een werkconcentratie van de DNA-oplossing gecentrifugeerd om sedimentatie te bewerkstelligen. Injectiepijpetten voor partikels, vervaardigd uit BO-silicaatglas capillaire buisjes, worden vervolgens gevuld met de DNA-oplossing. Cellen worden op de microscopitafel geplaatst en de visualisatie van de celkern wordt geoptimaliseerd.De pipet wordt uitgelijnd met de nucleus en de cel wordt geïnjecteerd. De volgende dag worden meerdere cellen in elke schaal geïnjecteerd. Succesvol geïnjecteerde cellen worden geïdentificeerd aan de hand van de expressie van een reportergen.Hoi, ik ben Van Mu uit het laboratorium van Dr. Stephen Akeda bij het National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism van de National Institutes of Health. Ik ben Damien Williams, ook uit het Akeda Lab. En ik ben Eugene run uit het AKEDA lab.Vandaag laten we u de procedure zien voor de INTERCLEAR micro-injectie van cDNA-constructen in gedissocieerde neuronen. Dit is een effectieve methode voor heterologe expressie van eiwitten van belang in postmitotische cellen, die traditioneel moeilijk te transfecteren zijn. Wij gebruiken deze techniek in ons laboratorium om de mechanismen te bestuderen die ten grond liggen aan de G-proteïne modulatie van N-kanalen.Laten we nu beginnen met het verkrijgen van donkere tanden. Begin met het uitplaten van gedissocieerde neuronen van volwassen zoogdieren op celkweekschalen die zijn gecoat met 0,1 mg/mL hoogmoleculair poly-L-lysine. Dit bevordert de adhesie van de neuronen aan het bodemoppervlak van de schalen.Glazen klooncilinders kunnen worden gebruikt om geplaatte neuronen in een kleiner, beperkter gebied te concentreren, om zo de afstand tussen de te injecteren neuronen te minimaliseren. Plaats de schaaltjes drie tot zes uur in een incubator van 37 °C voordat de intranucleaire micro-injecties worden uitgevoerd, zodat de cellen voldoende tijd hebben om aan de bodem van de schaaltjes te hechten.Terwijl de neuronen incuberen, worden de micro-injectiepipetten geprepareerd met een Sutter P 97 flaming brown puller en dunwandige borosilicaatglazen capillaire buizen. We gebruiken een tweestaps trekprogramma met de volgende instellingen voor de eerste en tweede trekkingsfase. Aangezien de benodigde instellingen variëren per batch glas en afhankelijk zijn van de staat van het verwarmingselement in de puller, moeten deze naar behoefte worden aangepast.Er moeten ten minste vijf injectiepipetten worden getrokken per schaal met neuronen, voor het geval de pipetten beschadigd raken of er problemen optreden tijdens de injectiesessie. De getrokken injectiepipetten moeten worden bewaard in een afgedekte container om te voorkomen dat er stof in de tip van de microinjectiepipet terechtkomt vlak voor de injectie. De plasmide-cDNA's worden verdund tot de werkconcentratie. Plaats een klein stukje paraform op het werkoppervlak en verwijder de papieren achterkant.Voeg de CD NA-stamoplossing en TE-buffer toe aan het param. Om de CD NA te verdunnen, raden wij een uiteindelijke CDNA-concentratie van minder dan 200 nanogram per microliter en een totaalvolume tussen 2 en 10 microliters aan. Als het door de CD NA gecodeerde eiwit geen tag heeft, kan een reporterplasmid dat bijvoorbeeld EGFP codeert, samen met de experimentele CD NA worden geïnjecteerd. Om een succesvolle injectie en expressie te bevestigen, worden de CD NNA-oplossingen gemengd door meerdere keren met de pipet op en neer te pipetteren on perfil.Wees voorzichtig om het introduceren van luchtbellen te voorkomen, om eventuele deeltjes in de cDNA-oplossing te laten bezinken die later de microinjectiepipet zouden kunnen blokkeren. Gebruik een micro-loader pipetpunt om de oplossing over te brengen naar een voorbereide hematocrietbuis die is gereinigd, afgesneden en aan één uiteinde vlamgeseald. Plaats vervolgens de hematocrietbuis in een 1,5 milliliter microcentrifugebuis en centrifugeer gedurende 15 tot 30 minuten.10.000 g bij kamertemperatuur. Zodra het centrifugeren is voltooid, wordt de buis met de cDNA-injectieoplossing apart gezet. De oplossing kan gedurende de injectiesessie één tot twee uur bij kamertemperatuur worden bewaard.Verwijder na het uitplaten van de cellen de glazen kweekcilinders. Plaats de uitgeplaatte cellen vervolgens terug in de incubator voor de rest van de incubatieperiode voorafgaand aan de injectiesessie. Om te beginnen met injecteren, haal eerst een schaal met uitgeplaatte neuronen uit de incubator en plaats deze op de microscooptafel van een injectie-opstelling.De opstelling bestaat uit een omgekeerde fasecontrastmicroscoop, een drukspuit verbonden met een micromanipulator en een videomonitoringsysteem. Onder fasecontrast verschijnen neuronen als sferische cellen met een duidelijk zichtbare nucleus als een centraal rond organel met een donker membraan, die één of meerdere nucleoli kan bevatten. Zuig met een microlader-pipetpunt twee microliter van de bereide CD NA op uit de hematocrietbuis.Zorg ervoor dat de oplossing nabij de bodem van de buis, waar partikels zijn neergeslagen, wordt vermeden. Overbreng de oplossing naar een microinjectiepipet. Het filament in de microinjectiepipet dient te helpen bij het trekken van de oplossing naar de tip.Als er echter kleine luchtbellen blijven bestaan, tik dan voorzichtig tegen de zijkant van het glas om deze te verwijderen; zorg ervoor dat de capillaire houder van de drukinjector onder een hoek van 45 graden is vastgezet. Plaats vervolgens de micro-injectiepipet in de capillaire houder en bevestig de houder aan de micromanipulator. Laat daarna de micro-injectiepipet met behulp van de micromanipulator in de schaal zakken; zodra de pipet het cultuurmedium binnendringt, vormt zich een meniscus die het lichtpad door het specimen verandert en daarmee de beeldkwaliteit van de neuronen vermindert.Om dit probleem te verhelpen, stelt u de fasedraaischijf zo in dat de kernen van de neuronen duidelijk zichtbaar zijn. Gebruik vóór aanvang van de injecties de reinigingsfunctie van het drukinjectiesysteem om de pipet te ontdoen van vuil en om de kwaliteit van de microinjectiepipetten te controleren.De uitgestoten oplossing moet zichtbaar zijn op het scherm. Bij gebruik van deze functie wordt de vloeistof uit een optimaal formaat pipetpunt als een dunne stroom uitgestoten. Als de microinjectiepipet verstopt is of te nauw is, zal er geen vloeistof worden uitgestoten wanneer de reinigingsfunctie wordt gebruikt.Als de tip te breed is of is afgebroken, zal de vloeistof als een brede stroom uit de tip worden gespoten. Als de tip tijdens injecties suboptimaal lijkt, vervang dan de injectiepipet en centreer vervolgens de micro-injectiepipet in de monitor. Houd de nucleus in focus en laat de tip van de pipet zakken totdat deze in focus is naast een neuron.Stel deze positie in als de onderste Z-aslimiet op de micromanipulator. Deze positie is de diepte waartoe de microinjectiepipet zal bewegen tijdens de injecties. Positioneer de tip vervolgens ongeveer 30 micrometers boven dit punt.De micro-injectiepipet raakt nu de bovenkant van de neuronen. Programmeer nu de instellingen van de micromanipulator voor micro-injecties. Zet de injectiemodus van de einor micromanipulator op 'aan' en de impale-functie op 'uit' om celbeschadiging te minimaliseren.Kies bij de microinjectie een diagonaal injectiepad door de axiale modus te selecteren. Stel de injectiesnelheid in op 300 micrometers per seconde en synchroniseer de drukopbouw bij de limiet. Volgende programma.De instellingen van de drukinjector stellen de injectiedruk of PI in tussen 100 en 200 hectopascal of hPa, de injectieduur of ti op 0,3 seconden en de compensatiedruk of PC op 30 hPa. Zodra de instellingen van de manipulator zijn aangepast, kunnen intranucleaire injecties worden uitgevoerd. Gebruik de besturing van de XY-as van de microscooptafel om het neuron onder de punt van de micro-injectiepipet te positioneren.Lijn de pipetpunt uit boven het centrum van de nucleus door scherp te stellen tussen de punt en de nucleus. Injecteer de nucleus door op de injectieknop van de micromanipulator te drukken. De injectie van de relatief lage viscositeit.De cDNA-oplossing verschijnt vaak als een witte pluim in de nucleus wanneer deze onder fasecontrastoptiek wordt bekeken. Ga door met het injecteren van neuronen door de microscopietafel te verplaatsen om het volgende neuron onder de micro-injectiepipet uit te lijnen.Navigeer systematisch door de schaal. Ga door met het injecteren van kernen. Gebruik elke 10 tot 15 injecties de eerder beschreven reinigingsfunctie om de kwaliteit van de microinjectiepipet te controleren.Als de pipet verstopt of beschadigd is, dient deze te worden vervangen door een nieuwe injectiepipet. Een ongelijkmatige bodem van de weefkweekschalen kan ervoor zorgen dat de injectiepipet de cel mist of dat de witte pluim in de kern niet zichtbaar is. Pas in dat geval de tip van de micro-injectiepipet aan zodat deze zich in hetzelfde brandvlak als de kern bevindt, en stel dit in als de nieuwe limiet van de x-as.Ga vervolgens verder met het injecteren van neuronen. Soms penetreert de microinjectiepipet het kernmembraan niet en verschuift deze enkel de nucleus. Als dit gebeurt, kan een tweede injectiepoging op dezelfde positie leiden tot een succesvolle injectie van DNA in de nucleus.Opzwelling van de cel is doorgaans een aanwijzing voor onbedoelde cytoplasmatische injectie. Zodra er 50 tot honderd kernen zijn geïnjecteerd, wordt de schaal met neuronen teruggeplaatst in de incubator voor incubatie gedurende de nacht. Na 16 uur kunnen succesvol geïnjecteerde neuronen worden geïdentificeerd aan de hand van de expressie van een reportergen.In dit veld is één neuron van het superieure cervicale ganglion of SCG geïnjecteerd, dat kan worden geïdentificeerd door de expressie van EGFP. Niet-geïnjecteerde SCG-neuronen, die geen endogene G-proteïnegekoppelde naar binnen gelijkrichtende kaliumkanalen of grk-kanalen bezitten, vertonen geen meetbare stromen tijdens een spanningsramp. In vergelijking hiermee leidt een succesvolle injectie van het plasmide cDNA dat codeert voor een functioneel grk-kanaal, bij blootstelling aan de G-proteïnegekoppelde receptoragonist norepinefrine, tot grote stromen tijdens een spanningsramp.De hier gemeten stromen zijn typerend voor Kir-kanalen en worden gekenmerkt door activering door norepinefrine, naar binnen gerichte rectificatie en inhibitie door de vermeende grk-kanaalblokker barium. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe cDNA in de kern van neuronen kan worden geïnjecteerd. Bij het uitvoeren van deze techniek is het belangrijk om vier zaken in gedachten te houden.Ten eerste, om het DNA te centrifugeren vóór injectie. Ten tweede, om er zeker van te zijn dat de nucleus duidelijk zichtbaar is. Ten derde, om de limiet van de Z-as opnieuw in te stellen bij het navigeren over de schaal.En vierens, controleer regelmatig de kwaliteit van de pep tip tussen de injecties door. Dat was alles, bedankt voor het kijken en veel succes met uw experiment.

intranuclear-microinjection-dna-into-dissociated-adult-mammalian

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit protocol beschrijft de stappen die nodig zijn om te ontleden, transfecteren via elektroporatie en cultuur muis hippocampus en corticale neuronen. Op korte termijn culturen kan worden gebruikt voor studies van axon uitgroei en begeleiding, terwijl de lange-termijn culturen kunnen worden gebruikt voor onderzoek naar synaptogenese en dendritische rug analyse.

Nucleofection en Primaire Cultuur van de embryonale Mouse hippocampus en de corticale neuronen

Hier beschrijven we een test dat de kracht van micro-injectie in combinatie met fluorescerende...

Analyse van de mRNA Nuclear Export Kinetics in zoogdiercellen door micro-injectie

Source: Denaxa, M., el al., Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the procedure for injecting a plasmid vector carrying the gene of interest into interneuron progenitors in an embryonic brain slice, followed by electroporation for plasmid entry and gene expression. These modified progenitors can later be used for treating brain disorders.

Agarose-Embedded Electroporation-Assisted Gene Transfer in Mouse Cortical Interneuron Progenitors

Neuroblast migratie is een cruciale stap in postnatale neurogenese. Het protocol hier beschreven kan worden gebruikt om de rol van de kandidaat regulatoren van neuroblast migratie door gebruik DNA / small hairpin RNA (shRNA) nucleofection en een 3D migratietestsysteem met neuroblasts geïsoleerd van het knaagdier postnatale rostrale migratiestroom onderzoeken.

Nucleofectie van knaagdieren neuroblasts om neuroblast Migratie Studie<em&gt; In vitro</em

Hier demonstreren we een techniek voor wijdverspreide neuronale transductie door intraventriculaire injectie van adeno-geassocieerd virus in de neonatale muisbrein. Deze methode biedt een snelle en eenvoudige manier om levenslange expressie van vireel aangeboden transgenen te bereiken.

Intracerebroventriculaire Viral Injectie van de Neonatale Mouse Brain voor persistent en wijdverbreide Neuronale Transduction

Dit protocol is gericht op het genereren van direct geherprogrammeerde interneuronen in vivo, met behulp van een AAV-gebaseerd virale systeem in de hersenen en een FLEX synapsin-driven GFP Reporter, die het mogelijk maakt voor celidentificatie en verdere analyse in vivo.

In vivo directe herprogrammering van ingezeten gliacellen in interneuronen door intracerebrale injectie van virale vectoren

Hier presenteren we een protocol, ontworpen om gebruik te maken van chemogenetische hulpmiddelen om de activiteit van corticale Interneuron voorlopercellen getransplanteerd in de cortex van vroege postnatale muizen te manipuleren.

Transplantatie van Chemogenetisch gemanipuleerde corticale Interneuron progenitors in vroege postnatale Muizenhersenen

Dit protocol is bedoeld om te laten zien hoe een DNA/DOTAP mengsel microinjecteert in de eyebuds van een dag oude Xenopus laevis embryo's, en hoe te beeld en reconstrueren individuele groene fluorescerende eiwitten (GFP) uitdrukken optische axonale Arbors in tectal midbrains van intact, levende Xenopus tadpoles.

Micro injectie van DNA in de Oogtoppen van Xenopus laevis embryo's en beeldvorming van GFP dat optische axonale Arbors uitdrukt in intact, levend Xenopus tadpoles

Dit protocol toont het gebruik van een robotplatform voor micro-injectie in enkele neurale stamcellen en neuronen in hersenschijfjes. Deze techniek is veelzijdig en biedt een methode om cellen te volgen in weefsel met een hoge ruimtelijke resolutie.

Manipulatie van enkele neurale stamcellen en neuronen in hersenschijfjes met behulp van roboticamicroïsjectie

Het huidige protocol schetst stapsgewijze instructies voor het uitvoeren van intrathecale injecties bij neonatale muizen voor genbewerking en medicijnafgifte.

Intrathecale injectie van pasgeboren muis voor genoombewerking en medicijnafgifte

Er wordt een nieuwe techniek beschreven voor wijdverbreide toediening van adeno-geassocieerd virus waarbij gebruik wordt gemaakt van infusie van subarachnoïdaal virus. Deze methode zorgt niet alleen voor wijdverspreide transductie van neocorticale neuronen van muizen in oppervlakkige lagen, maar resulteert ook in selectieve expressie van het transgen in laag vijf piramidale neuronen, zelfs bij gebruik van een niet-selectieve promotor.

Wijdverbreide transductie van neocorticale neuronen van muizen door subarachnoïdale injectie van AAV2

Leer intranucleaire micro-injectie van cDNA in gedissocieerde volwassen zoogdierneuronen voor functionele eiwitstudies. Deze methode bereikt hoge expressieniveaus in post-mitotische cellen die traditioneel moeilijk te transficeren zijn.

Intranucleaire micro-injectie van DNA in gedissocieerde Adult zoogdieren Neuronen

Meer video's verkennen