Name: Osmotische Vermijden in Caenorhabditis elegans: Synaptic Functie van twee genen, orthologen van de Mens NRXN1 En NLGN1, Als kandidaten voor Autisme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-11T16:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Ontdek osmotische vermijding in Caenorhabditis elegans voor onderzoek naar synaptische functie van neurexine- en neuroligine-genen. Deze methode helpt bij het bestuderen van autisme-gerelateerde neurale mechanismen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen graag door dr. Antonio Miranda-Vizuete voor zijn waardevolle hulp. We ook graag onze dank betuigen aan Salma Boulayoune en Isabel Caballero van waardevolle technische bijstand. Dit werk werd gefinancierd door een subsidie ​​van de Junta de Andalucía (BIO-272). Dit onderzoek is uitgevoerd in overeenstemming met de huidige wetten die genetische experimenten in Europa.

1: Osmotische vermijden test. <ol><li> Ongeveer 16-24 uur voor de test, pick L4 larvestadium dieren van elk genotype om een nieuwe plaat met NGM OP50 E. coli andincubate het bij 20 ° C. Volgende dag beginnen het experiment met jonge volwassenen. </li><li> Het is aanbevolen om het uitvoeren van de assay "blind". De platen met elke stam te worden getest moet worden geëtiketteerd door een tweede experimentator, het uitvoeren van de test met behulp van het opnieuw geëtiketteerde platen die zouden worden ontmaskerd als het experiment is voltooid. </li><li> De dag van de test, bereiden een 4M voorraad oplossing van fructose met 1% Congo Red oplossing en lossen volledig op kamertemperatuur. Wij raden u aan de oplossing voor elke test, omdat de kleurstof kan neerslag met de tijd. </li><li> Ringvormige ring (1 cm diameter) op NGM plaat is beschreven op het midden van het vast medium, met 15 ul van de rode 4M fructose-oplossing. Laat de fructose oplossing dringen in de agar, dit duurt meestal tussen de 2 en 5 minuten. </li><li> Plaats individuele jonge volwassen dieren van elke stam binnen de ring en volgt in de komende 10 minuten om de reactie op de osmotische barrière te bepalen. Dieren het vermijden van de ring meer dan zes keer op rij worden geclassificeerd als normaal, die het verlaten van de ring in minder dan zes pogingen worden als ondeugdelijk beschouwd in osmotische gevoeligheid. Opmerking: De controle stam moet worden gebruikt in elke test. N2 jonge volwassen dieren worden gebruikt als positieve controles als ze resoluut voorkomen dat de ring barrière. Dieren die eerder zijn uitgehongerd, gepasseerd Dauer larven of afkomstig zijn uit platen die te droog mag niet worden gebruikt. In het begin moet controle dieren worden geëvalueerd in tweevoud, te bevestigen dat de assay platen en de oplossing correct zijn. </li></ol> 2: Het genereren van knock-down wormen door RNAi voeden. <ol><li> RNAi platen: NGM RNAi voeden platen bevat per liter: 17 g agar-agar, 2,5 g pepton, NaCl 3,0 g, 1 ml van 5 mg ml-1 cholesterol, vul de kolf met 1 liter met H 2 O en autoclaaf. Na agar afkoelt tot ongeveer 65 ° C, voeg 25 ml van 1 M KPO 4, pH 6,0, 1 ml van 1 M CaCl 2, 1 ml 1M MgSO 4, 0,5 ml carbenicilline (50 mg ml -1) en een ml 1M IPTG. Als je begint met voorbereide solide NGM, smelt vast medium door de magnetron en vervolgens vloeibaar NGM plaats op de bank afkoelen en voeg KPO 4, pH 6,0, CaCl 2, MgSO 4, carbenicilline en IPTG zoals eerder aangegeven. Voeg 10 ml van NGM in elke 60 mm petrischaal. Laat afkoelen en keer platen handhaven ervan bij RT 's nachts voor gebruik. Platen kunnen worden opgeslagen in een plastic zakje bij 4 ° C gedurende ongeveer 4-5 dagen. </li><li> Bacteriële voorbereiding en inductie: Isoleer kolonies van E.coli HT115 (DE3) stam, getransformeerd met L4440 vector die een fragment dat overeenkomt met het target-gen, op Luria-Bertani (LB) agar platen (17 g agar, 10 g trypton, 5 g gistextract, en 10 g NaCl per liter) met ampicilline (50 ug / ml) en tetracycline (15 ug / ml). Kies een kolonie van bacteriën en in de LB met 50 ug / ml ampicilline enten, en geteeld voor 6 8 uur met schudden bij 37 ° C; zaad een daling van deze cultuur op de voorbereide NGM platen en grondig de platen voordat ze incubatie 's nachts droog ( 12 24 uur) bij kamertemperatuur, zodat de bacteriën om te groeien en om inductie te beginnen. De incubatie werd in het donker, omdat tetracycline is lichtgevoelig en kan invloed hebben op de variabiliteit van de RNAi-testen onder de borden. Het is noodzakelijk om een ​​positieve en een negatieve controle voor RNAi voeren experimenten gebruiken. De positieve controle is E.coli HT115 cel getransformeerd met de L4440 vector die het unc-22 gensequentie. De knock-down van de UNC-22 gen produceert een "trillen fenotype". De negatieve controle is E.coli HT115 cel getransformeerd met lege L4440 vector. </li><li> Worm handling en scoren: De eerste dag, plaats L4 stadium wormen uit een NGM plaat bezaaid met OP50 op NGM platen zonder bacteriën en incubeer bij 20 ° C gedurende 12 uur (vasten). De volgende dag, transfer jonge vastte volwassen hermafrodieten op een bord seedded met de bacteriën de uiting van de specifieke target-gen RNAi. Laat 40 tot 48 uur bij 20 ° C tot F1 nakomelingen te genereren. Plaats dan een paar F1 volwassen wormen op een ander bord bezaaid met dezelfde bacterie. Na 24-48 uur, selecteren en isoleren van de F2 nakomelingen, jong volwassenen (volledig gevormd uitstekende vulva met weinig eieren) en de score voor fenotypes. Let op: de RNAi inductie in neuronen hebben een aantal beperkingen als gevolg van de vuurvaste eigenschappen van de C elegans zenuwstelsel aan RNAi.. Het overwinnen van de problemen van deze inefficiëntie in neuron is het aanbevolen om de SRF-3 stam, een overgevoelig achtergrond om de effecten van RNAi in neuronen 10 te gebruiken. In onze experimenten geen differences werden gevonden tussen Bristol N2 en RRF-3 stammen voor de genen en het fenotype geanalyseerd. </li></ol> 3: Stammen gebruikt. De C. elegans stammen die in dit werk zijn weergegeven in Tabel 1. Mutante stammen waren uit-gekruist tegen N2 wild - type minstens vier keer om ongewenste willekeurige mutaties die hadden kunnen worden gegenereerd tijdens de mutagenese protocol te verwijderen. . OP50 E coli-stam werd suppliied door Caenorhabditis Genetic Center, University of Minnesota, USA E.coli HT115 (DE3) met het plasmide pL4440 die NRX-1 (JA: C29A12.5). En nlg-1 (JA: C40C9.5 )-gen fragmenten werden verzorgd door dr. Peter Askjaer, Centro Andaluz de biologia del Desarrollo (CABD), CSIC Universidad Pablo Olavide, Sevilla, Spanje. 4: Representatieve resultaten. Illustratief resultaten zijn weergegeven in de figuren 1 en 2. Tien dieren van elke stam en een minimum van drie replica experimenten werden uitgevoerd. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/1616/1616Fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Experimenten van de osmotische vermijdingsgedrag. Controle stammen en NRX-1 (ok1649 en tm1961) V deficiënt mutantworms reageren door het omkeren van achteruit wanneer ze in een osmotische barrière (4M fructose). Nlg-1 (ok259 en tm474) X mutanten niet om deze barrière op te sporen. Dubbele mutanten deficiënt in nlg-1 en NRX-1, stammen CRR21 (ok1649; ok259) VX en CRR23 (tm1961; ok259) VX herstelde het wild type fenotype. De * geeft significante verschillen (P ≤ 0.001) door t-student test, in de reactie van elke stam aan de Bristol N2 wild-type door t-student-test <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/1616/1616Fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Experimenten met knockdown wormen door RNAi voeden. E.coli HT115 (DE3) getransformeerd met lege pL4440 vector of met een fragment dat overeenkomt met het doel genen NRX-1 of NLG-1 werden gebruikt om gevoed verschillende worm stammen. De * geeft significante verschillen (P ≤ 0.001) door t-student test, in de reactie van de N2 stam bacteriën gevoed met het dragen van de pL4440 vector met een fragment gericht op de nlg-1-gen in vergelijking met de N2 stam gevoed met lege pL4440 vector .

<ol><li>Sudhof, T. C. Nature. 455 (7215), 903-903 (2008).</li>
<li>Fabrichny, I. P., Leone, P., Sulzenbacher, G. Neuron. 56 (6), 979-979 (2007).</li>
<li>Garber, K. Science. 317 (5835), 190-190 (2007).</li>
<li>Wang, K., Zhang, H., Ma, D. Nature. 459 (7246), 528-528 (2009).</li>
<li>Ward, S., Thomson, N., White, J. G. The Journal of comparative neurology. 160 (3), 313-313 (1975).</li>
<li>Bargmann, C. I., Thomas, J. H., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+Spring+Harbor+symposia+on+quantitative+biology%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Cold Spring Harbor symposia on quantitative biology.</a> 55, 529-529 (1990).</li>
<li>White, J. G., Southgate, E., Thomsom, J. N., Brenner, S. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 314, 1-1 (1986).</li>
<li>Culotti, J. G., Russell, R. L. Genetics. 90 (2), 243-243 (1978).</li>
<li>Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K. Nature. 391 (6669), 806-806 (1998).</li>
<li>Timmons, L., Fire, A. Nature. 395 (6705), 854-854 (1998).</li>
<li>Simmer, F., Tijsterman, M., Parrish, S., Koushika, S. P., Nonet, M. L., Fire, A., Ahringer, J., Plasterk, R. H. Curr Biol. 12, 1317-1317 (2002).</li>
<li>Missler, M., Zhang, W., Rohlmann, A. Nature. 423 (6943), 939-939 (2003).</li>
<li>Varoqueaux, F., Aramuni, G., Rawson, R. L. Neuron. 51 (6), 741-741 (2006).</li>
<li>Graf, E. R., Zhang, X., Jin, S. X., Scheiffele, P., Fan, J., Choih, J. Cell. 119 (7), 1013-1013 (2004).</li>
<li>Scheiffele, P., Fan, J., Choih, J. Cell. 101 (6), 657-657 (2000).</li>
<li>Jamain, S., Quach, H., Betancur, C. Nature genetics. 34 (1), 27-27 (2003).</li>
<li>Szatmari, P., Paterson, A. D., Zwaigenbaum , L. Nature genetics. 39 (3), 319-319 (2007).</li>
</ol>

Neurexins en neuroligins voeren een essentiële rol in synaptische transmissie 11 en differentiatie van de synaptische verbindingen 12. Beide moleculen zijn geïdentificeerd als kandidaat-genen voor autisme 13,14. In deze video laten we een eenvoudige methode die ons in staat stelt de studie van de invloed van de genen die de osmotische vermijdingsreactie in C. elegans. Neuroligin gebrekkige mutanten defect zijn bij het opsporen van osmotische kracht, ...

Tabel 1. C. elegans stammen. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Spanning </td><td> Gen </td><td> Allel </td><td> Bron </td></tr><tr><td> Bristol N2 </td><td> - </td><td> - </td><td> aCGC </td></tr><tr><td> VC228 </td><td> nlg-1 </td><td> ok259 </td><td> CGC </td></tr><tr><td> FX00474 </td><td> nlg-1 </td><td> tm474 </td><td> bNBP-JAPAN </td></tr><tr><td> VC1416 </td><td> NRX-1 </td><td> ok1649 </td><td> CGC </td></tr><tr><td> FX1961 </td><td> NRX-1 </td><td> tm1961 </td><td> NBP-JAPAN </td></tr><tr><td> NL2099 </td><td> RRF-3 </td><td> pk1436 </td><td> CGC </td></tr><tr><td> CRR21 </td><td> NRX-1; nlg-1 </td><td> ok1649; ok259 </td><td> Dit werk </td></tr><tr><td> CRR22 </td><td> NRX-1; nlg-1 </td><td> tm1961; ok259 </td><td> Dit werk </td></tr></tbody></table> a. Caenorhabditis Genetic Center, University of Minnesota, USA. b. Nationale Bioresource Project voor het proefdier &quot;nematode C. elegans&quot;. Tokyo Women&#39;s Medical University, Japan.

osmotische vermijden in caenorhabditis elegans: synaptic functie van twee genen, orthologen van de mens nrxn1 en nlgn1, als kandidaten voor autisme

Osmotic Avoidance in Caenorhabditis elegans: Synaptic Function of Two Genes, Orthologues of Human NRXN1 and NLGN1, as Candidates for Autism

Neurexins en neuroligins zijn cel adhesie moleculen in exciterende en inhiberende synapsen, en ze zijn verplicht voor een correcte neuron netwerkfunctie 1. Deze eiwitten zijn te vinden op de presynaptische en postsynaptische membranen 2. Studies in muizen wijzen erop dat neurexins en neurologins een essentiële rol in synaptische transmissie 1 hebben. Recente rapporten hebben aangetoond dat een veranderde neuronale verbindingen tijdens de ontwikkeling van het menselijk zenuwstelsel kan de basis van het ontstaan ​​van een groot aantal gevallen van autisme spectrum stoornissen drie vormen. Caenorhabditis elegans kan worden gebruikt als een experimenteel instrument om de studie van het functioneren van synaptische onderdelen daarvan te bevorderen, vanwege zijn eenvoud voor laboratorium experimenten, en gezien het feit dat het zenuwstelsel en de synaptische bedrading volledig is gekarakteriseerd. In C. Elegans NRX-1 en nlg-1 genen orthologe voor de menselijke NRXN1 en NLGN1 genen die coderen voor alfa-neurexin-1 en neuroligin-1 eiwitten, respectievelijk. Bij mensen en nematoden, de organisatie van neurexins en neuroligins is vergelijkbaar met betrekking tot functionele domeinen. Het hoofd van de nematode bevat de amphid, een zintuig van de nematode, die reacties bemiddelt op verschillende stimuli, waaronder osmotische kracht. De amphid is gemaakt van 12 sensorische bipolaire neuronen met trilharen dendrieten en een axon presynaptische terminal 4. Twee van deze neuronen, genaamd ASHR en ASHL zijn bijzonder belangrijk in osmotische sensorische functie, het detecteren van water-oplosbare insectenwerende middelen met een hoge osmotische kracht 5. De dendrieten van deze twee neuronen verlengen tot aan de punt van de mond en de axonen uit te breiden tot de zenuw ring, waar ze synaptische verbindingen met andere neuronen het bepalen van de gedrags-respons 6. Voor het evalueren van de implicaties van neurexin en neuroligin in hoge osmotische sterkte te vermijden, laten we de verschillende reactie van C. elegans mutanten defect in de NRX-1 en nlg-1 genen, met behulp van een methode op basis van een 4M fructose ring 7. De gedrags-fenotypes werden bevestigd met behulp van specifieke RNAi klonen 8. In C. elegans, kan de dsRNA nodig is om RNAi triggeren worden beheerd door het voeren van 9. De levering van dsRNA induceert via de voeding van de RNAi interferentie van het gen van belang waardoor de identificatie van genetische componenten en netwerk paden.

Neurexins en neuroligins zijn membraan-neuron hechting eiwitten die een essentiële rol in synaptische differentiatie en transmissie uit te voeren. Neuroligin gebrekkige mutanten van<em&gt; C. elegans</em&gt; Defect zijn in het opsporen van osmotische kracht, maar wanneer ze ook een mutatie in het gen dat codeert neurexin bevatten, innen zij de wild type fenotype.

Osmotische Vermijden in Caenorhabditis elegans: Synaptic Functie van twee genen, orthologen van de Mens NRXN1 En NLGN1, Als kandidaten voor Autisme

Neurexines en neuroligines zijn celadhesiemoleculen die aanwezig zijn in excitatoire en inhibitoire synapsen, en ze zijn vereist voor een correcte functie van het neurale netwerk. Deze eiwitten bevinden zich in de presynaptische en postsynaptische membranen. Studies bij muizen wijzen erop dat neurexines en neuroligines een essentiële rol spelen bij de synaptische transmissie. Recente rapporten hebben aangetoond dat gewijzigde neurale verbindingen tijdens de ontwikkeling van het menselijke zenuwstelsel de basis kunnen vormen voor de etiologie van talrijke gevallen van autismespectrumstoornissen. Caenorhabditis elegans kan worden gebruikt als experimenteel instrument om de studie naar de werking van synaptische componenten te vergemakkelijken, vanwege de eenvoud voor laboratoriumexperimenten en het feit dat het zenuwstelsel en de synaptische bedrading volledig zijn gekarakteriseerd. In C. elegans zijn de nrx-1- en nlg-1-genen ortholoog aan de menselijke NRXN1- en NLGN1-genen, die respectievelijk coderen voor de eiwitten alfa-neurexine-1 en neuroligine-1. Bij mensen en nematoden is de organisatie van neurexines en neuroligines vergelijkbaar wat betreft functionele domeinen. De kop van de nematode bevat de amphid, een zintuiglijk orgaan van de nematode dat responsen op verschillende stimuli medieert, waaronder osmotische sterkte. De amphid bestaat uit 12 sensorische bipolaire neuronen met gecilieerde dendrieten en één presynaptisch terminaal axon. Twee van deze neuronen, ASHR en ASHL genoemd, zijn bijzonder belangrijk voor de osmotische sensorische functie en detecteren wateroplosbare repellentia met een hoge osmotische sterkte. De dendrieten van deze twee neuronen strekken zich uit tot de punt van de mond en de axonen lopen door naar de zenuwring, waar ze synaptische verbindingen maken met andere neuronen die de gedragsrespons bepalen. Om de implicaties van neurexine en neuroligine bij het vermijden van hoge osmotische sterkte te evalueren, tonen we de verschillende respons van C. elegans-mutanten die defect zijn in de nrx-1- en nlg-1-genen, middels een methode gebaseerd op een 4M fructose-ring. De gedragstypische fenotypes werden bevestigd met behulp van specifieke RNAi-klonen. In C. elegans kan het dsRNA dat nodig is om RNAi te triggeren, via voeding worden toegediend. De toediening van dsRNA via voeding induceert de RNAi-interferentie van het gen van belang, waardoor de identificatie van genetische componenten en netwerkpaden mogelijk wordt.

Hallo, mijn naam is Manuel Ruiz Rubio van de afdeling Genetica van de Universiteit van Córdoba in Spanje. We gebruiken C. elegans als experimenteel instrument bij de studie naar autisme, waarbij we profiteren van het volledig gekarakteriseerde zenuwstelsel van C. elegans. We bestuderen mutanten van de nematode die defect zijn in genen die betrokken zijn bij de neurale synaps en die in verband zijn gebracht met autisme.Neurexinen en neuroliginen zijn membraanadhesiemoleculen die aanwezig zijn in de synaps. De kop van C. elegans bevat de amphid, een zintuiglijk orgaan van de nematode dat responsen op verschillende stimuli medieert, waaronder osmotische sterkte. De amphid bestaat uit 12 sensorische bipolaire neuronen met gecilieerde dendrieten en één presynaptisch terminaal axon.Twee van deze neuronen, ASHR en ASHL genoemd, zijn bijzonder belangrijk voor de osmotische sensorische functie bij het detecteren van wateroplosbare afstotingsstoffen met een hoge osmotische sterkte. Hiernaast wordt een methode beschreven om osmotische vermijding te meten in synaptische defecte mutanten van C. elegans.Om de implicaties van neurexine en neuroligine bij het vermijden van een hoge osmotische sterkte te evalueren, hebben we de verschillende respons van C. elegans mutantstammen met defecte nrx-1 en nlg-1 genen gerapporteerd, gebruikmakend van een methode gebaseerd op een 4 M fructose-oplossing. Bereid op de dag van het experiment een 4 M stockoplossing van fructose voor met 1% Congo-rood en laat dit volledig oplossen bij kamertemperatuur. Een ring van één centimeter diameter wordt in het centrum van het vaste medium op een NGM-plaat aangebracht.Gebruik 15 µL van de rode 4M fructose-oplossing. Laat de fructose ongeveer vijf minuten in de agar trekken; het experiment moet blind worden uitgevoerd. De plaat met elke stam die getest moet worden, dient door een tweede experimentator te worden gelabeld.De SA wordt uitgevoerd met behulp van deze markeringen die niet zijn aangevraagd. Wanneer het experiment is beëindigd, ongeveer 24 uur voordat de verkoop plaatsvindt, is het noodzakelijk om L4-larven van elk genotype te selecteren en deze over te brengen naar een AFL NGM-plaat met e coli-bacteriën en deze de volgende dag bij 20 °C te bewaren. Het experiment dient te worden gestart met jonge volwassenen.Plaats individuele wormen van elke stam binnen de rustcirkel en volg elk dier om de responstijd op de tic-barrière te timen. Er moeten 10 dieren van elke stam worden gebruikt en minimaal drie replica-experimenten worden uitgevoerd om tot een conclusief resultaat te komen. Dieren die de rode ring zes keer achter elkaar vermijden, worden geclassificeerd als normaal.Dieren die de ring in minder dan zes pogingen verlaten, worden beschouwd als defect in de osmotische gevoeligheid; in elke SA moet een controlestam worden gebruikt en twee dieren worden gebruikt als positieve controles omdat zij de ringbarrière vermijden. Controlestammen reageren door achteruit te gaan wanneer zij een osmotische barrière van vier molar fructose tegenkomen. Neuro-deficiënte mutanten vertonen een vergelijkbaar gedrag met betrekking tot dit type sterkte.Echter slaagden NEUR-deficiënte mutanten er niet in om deze osmotische barrière te detecteren. Dubbele mutanten met verschillende actieve neur- en nout-allelen herstelden het wildtype-fenotype dat reageerde op de osmotische sterkte. Om wormen via RNA-interferentie-voeding uit te schakelen, worden kolonies van E. coli HD115 geïsoleerd, een stam die is getransformeerd met de L4440-vector die een fragment bevat dat overeenkomt met het doelgen. Bacteriën worden geïsoleerd op LBA- of carbon-platen voor de volgende dag.Selecteer een bacteriekolonie en inoculeer LV vloeibaar medium. Laat dit ongeveer zeven uur groeien onder schudcondities bij 37 °C. Druppel deze cultuur op een NGM-plaat met carbonic ceiling en IPTG en laat dit een nacht bij kamertemperatuur staan, zodat de bacteriën kunnen groeien en de inductie van de expressie van het fragment van het doelgen kan beginnen.Het is noodzakelijk om een positieve en een niet-negatieve controle te gebruiken voor RNA-interferentie. Voedingsexperimenten. De negatieve controle is gelijk.HT115-stammen getransformeerd met de pL4440-vector. De positieve controles zijn HT115-cellen getransformeerd met de pL4440-vector die een sequence van het unc-22-gen bevat. De knockdown van dit gen veroorzaakt een 'shaking'-fenotype dat gemakkelijk onder de stereomicroscoop te onderscheiden is.De eerste dag. Vier L4-stadia van NGM PLA met bacteriën worden overgebracht naar een plaat met bacteriën en bewaard op 20 °C gedurende 12 uur. Dit is een vastenperiode.Verplaats de volgende dag de jonge volwassenen in het snelle stadium naar een plaat die is geïnoculeerd met bacteriën die het specifieke doelgen voor RNA-interferentie tot expressie brengen. Laat deze ongeveer 48 uur bij 20 °C staan om de F1-nakomelingen te verkrijgen. Selecteer vervolgens gedurende de volgende twee dagen enkele F1-volwassen wormen en plaats deze op een andere plaat die is geïnoculeerd met dezelfde bacteriën.Selecteer en isoleer jonge volwassenen uit het F2-nageslacht bij de fenotypering van de Bristol N2 wild-type stam gevoed met bacteriën. L4 40 vectoren bewogen achteruit bij de osmotische barrière.De Bristol en true white typestam, gevoed met bacteriën die een fragment van het nrx-1-gen uit C. elegans tot expressie brachten, slaagde er niet in om 4M oplossingen te detecteren. Echter, de nrx-1-deficiënte mutant, die niet in staat was de osmotische barrière te detecteren, herstelde deze capaciteit toen deze werd gevoed met bacteriën die een fragment van het nrx-1-gen uit C. elegans tot expressie brachten. In deze video tonen we een eenvoudige methode waarmee het effect van genen die de osmotische vermijdingsrespons in C. elegans beïnvloeden, bestudeerd kan worden.Een ring van fructose verzadigd met Congo Rood wordt gebruikt om de respons van de nematode op osmotische sterkte te analyseren. Neuroligin-deficiënte mutanten vertonen gebreken in deze respons; echter, nrx-mutanten zijn niet belemmerd in het detecteren van osmotische stress en vertonen een respons die vergelijkbaar is met die van het wild-type stam. Deze video laat zien dat dubbele mutantstammen met verschillende knockout-allelen in de nrx- en nlg-genen het wild-type fenotype herstelden in hun respons op osmotische sterkte.Deze waarnemingen werden bevestigd met behulp van RNA-interferentie via een feeding lockdown-benadering. Op deze manier was de wildtype-stam minder in staat om de osmotische barrière te herkennen wanneer deze werd gevoed met bacteriën die de overeenkomstige sequentie van het ING-gen tot expressie brachten. Aan de andere kant herstelden neur-defecte mutanten, die niet in staat zijn de 4M fructose-oplossing te detecteren, dit gedrag wanneer zij werden gevoed met bacteriën die de overeenkomstige sequentie van het NNU-gen tot expressie brachten.De resultaten die in dit experiment worden getoond, geven aan dat nrx-1 en nlg-1 betrokken kunnen zijn bij de synaptische verbinding van de sensorische neuronen van de nematode en ook dat ze met elkaar interageren op een manier die de synaptische functie beïnvloedt. Oké, tot ziens en veel succes met uw experimenten.

osmotic-avoidance-caenorhabditis-elegans-synaptic-function-two-genes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video laat zien hoe twee neurale stimulerende middelen, aldicarb en pentyleentetrazol (PTZ), tewerkstellen in complementaire manieren om de synaptische functie in de nematode C. elegans te bestuderen. Deze complementaire aanpak kan ook gebruikt worden om licht te werpen op evolutionair geconserveerd mechanismen voor het moduleren van neuronale synchroon en heeft gevolgen voor epilepsie en aanvallen.

Paradigma&#39;s voor farmacologische karakterisering van C. elegans synaptische transmissie Mutants

Microarray analyse werd uitgevoerd om genetische expressie profielen...

Het bepalen van genetische expressie profielen in C. elegans Met behulp van microarray en real-time PCR

This video describes an osmotic avoidance assay to examine chemoavoidance behavior in a transgenic worm model. Avoidance behavior is tested in a plate in the presence of a high-osmotic barrier and chemoattractant. The worms with a functional loss of neurons get attracted by the chemoattractant, cross the high-osmotic barrier, and become paralyzed in the trap zone because of the anesthetic solution.

Examine Chemoavoidance Behavior in Transgenic Worms Using Osmotic Avoidance Assay

Terwijl dsRNA voeden in C. elegans is een krachtig hulpmiddel om gen-functie, de huidige protocollen voor grootschalige voeden schermen resulteren in variabele knockdown efficiëntie te beoordelen. We beschrijven een verbeterde protocol voor het uitvoeren van grootschalige RNAi voeden schermen die resulteert in een hoogst doeltreffend en reproduceerbare neerhalen van genexpressie.

Grootschalige Gene Knockdown in<em&gt; C. elegans</em&gt; Met behulp van dsRNA Feeding bibliotheken Robuuste verlies-van-functie Fenotypes Genereer

Hier presenteren we een protocol om de vermijding van gestreste individuen te kwantificeren. Dit paradigma is krachtig maar gebruiksvriendelijk en kan worden gebruikt om de invloed van genen en omgeving op een soort sociale interactie bij Drosophila melanogaster te beoordelen.

Ongecompliceerd Assay voor de kwantificering van Sociale Avoidance in Drosophila melanogaster

Hier presenteren we een Caenorhabditis elegans -specifieke test die is ontworpen om veranderingen in het koperen aversiegedrag te evalueren en het vermogen om een ​​gemeenschappelijke voedingsbron te lokaliseren, als het organisme zich voortbrengt van een goed gevoed aan hongerige voedingswaarde.

EEN<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Voedingsstatus gebaseerde Koper Aversion Assay

We hebben eerder protocollen ontwikkeld voor Caenorhabditis elegans om associatieve herinneringen op korte en lange termijn te vormen door respectievelijk massale en gespreide training. Hier worden gedetailleerde protocollen beschreven voor de conditionering van C. elegans door 1-propanol en zoutzuur te koppelen als respectievelijk geconditioneerde en ongeconditioneerde stimuli om een aversief associatief geheugen te vormen.

Aversief associatief leren en geheugenvorming door twee chemicaliën te koppelen bij Caenorhabditis elegans

Autisme Spectrum Stoornis (ASS) wordt geassocieerd met verminderd sociaal en communicatief gedrag en het ontstaan van repetitief gedrag. Voor het bestuderen van de onderlinge relatie tussen ASS-genen en gedragsstoornissen in het Drosophila-model , worden in dit artikel vijf gedragsparadigma's beschreven voor het bepalen van sociale afstand, agressie, verkering, verzorging en gewenningsgedrag.

Paradigma's voor gedragsbeoordeling in het Drosophila-model van autismespectrumstoornis

Knaagdiermodellen zijn waardevolle hulpmiddelen voor het bestuderen van kerngedrag dat verband houdt met autismespectrumstoornis (ASS). In dit artikel gaan we dieper in op twee gedragstests voor het modelleren van de kernkenmerken van ASS bij muizen: zelfverzorging, die repetitief gedrag beoordeelt, en de driekamertest voor sociale interactie, die sociale beperkingen documenteert.

Strategieën voor het beoordelen van autistisch-achtig gedrag bij muizen

Dynamische klemelektrofysiologie kan causale verbanden leggen tussen neuronale vuurtekorten en disfunctie van ionkanalen. We beschrijven dynamische klemmethoden en protocollen in de cerebellaire Purkinje-neuronen van muizen, waarbij we nuttige bronnen en technische overwegingen opmerken. In een representatieve studie voegen we gemodelleerde natriumgeleiding toe aan Tsc1-/- Purkinje-neuronen om herhaald vuren te redden.

Dynamische klemmethoden om verminderde neuronale prikkelbaarheid geassocieerd met autisme te onderzoeken

Dit protocol beoordeelt functionele synaptische activiteit tussen gedefinieerde neuronale partners in vivo in het centrale zenuwstelsel van Drosophila melanogaster-larven met behulp van genetisch gecodeerde instrumenten. CsChrimson-gemedieerde optogenetische stimulatie van presynaptische cIVda-sensorneuronen induceert calciumafhankelijke fotoconversie van CaMPARI in postsynaptische Basin-4 interneuronen.

Functionele karakterisering van individuele pre- en postsynaptische partners in het centrale zenuwstelsel van de Drosophila-larve met behulp van CaMPARI

Ontdek osmotische vermijding in Caenorhabditis elegans voor onderzoek naar synaptische functie van neurexine- en neuroligine-genen. Deze methode helpt bij het bestuderen van autisme-gerelateerde neurale mechanismen.

Osmotische Vermijden in Caenorhabditis elegans: Synaptic Functie van twee genen, orthologen van de Mens NRXN1 En NLGN1, Als kandidaten voor Autisme (Video) | JoVE Journal

Osmotische Vermijden in Caenorhabditis elegans: Synaptic Functie van twee genen, orthologen van de Mens NRXN1 En NLGN1, Als kandidaten voor Autisme

Meer video's verkennen