Osmotische Vermijden in Caenorhabditis elegans: Synaptic Functie van twee genen, orthologen van de Mens NRXN1 En NLGN1, Als kandidaten voor Autisme

Hallo, mijn naam is Manuel Ruiz Rubio hier bij het Departement Genetica van de Universiteit van Córdoba in Spanje. We gebruiken de elegans als experimenteel hulpmiddel in de studie van autisme, profiteren van het gekarakteriseerde zenuwstelsel van de drie elegans. We bestuderen mutanten van de nematode, effectief in genen die betrokken zijn bij neurale synapsen en die zijn gerelateerd aan autisme.

Rein Regans zijn membraanhechtingsmoleculen die aanwezig zijn in de synaps. De kop van C elegans bevat de amfi, een sensorisch orgaan van de nematode met bemiddelde reacties op verschillende stimuli, inclusief osmotische sterkte. Amfi bestaat uit 12 sensorische bipo-neuronen met gerelateerde hoogte en een INAP-terminale actie.

Twee van deze neuronen, genaamd A SH rechts en links, zijn bijzonder belangrijk in de osmotische sensorische functie. Ze detecteren wateroplosbare herverdelingen met hoge osmotische sterkte. Hi, A Nan River-wijn met sky-methode om osmotische vermijding in synapse-defecte mutanten van The ance te meten.

Om de implicaties van neuro en neuro hoge osmotische sterkte vermijding te evalueren, rapporteerden we de verschillende reacties van C tegen mutanten die defect zijn in neuro-neurale genen met behulp van een methode gebaseerd op een vier molare fructose-oplossing. Maak op de dag van de dag een vier molare stockoplossing van fructose met 1% Congo-rood en los deze volledig op bij kamertemperatuur. Een ring van een centimeter diameter op NGM-plaat wordt gesublinieerd in het centrum van het vaste medium.

Gebruik 15 microliter van de rode vier molare fructose-oplossing. Laat de fructose vijf minuten in de acre weken, het experiment moet blind worden uitgevoerd. De plaat met elke stam die de achtste moet zijn, moet worden gelabeld door een tweede experimentator.

De SA wordt uitgevoerd met behulp van deze markeringen die ze niet vragen. Wanneer het experiment ongeveer 24 uur voor de verkoop is voltooid, moeten de L vier larven van elk genotype worden geplukt en overgebracht naar een AFL NGM-plaat met e coli-bacteriën en deze de volgende dag op 20 graden Celsius worden bewaard. Het experiment moet worden gestart met jonge volwassenen.

Plaats individuele worm van elke stam binnen de rustcirkel en volg elk dier tot het zijn reactie op de tic-barrière tijdstipt. 10 dieren van elke stam en minimaal drie replica-experimenten moeten worden uitgevoerd om een sluitend resultaat te krijgen. Degenen die de rode ring zes keer op rij vermijden, worden geclassificeerd als normaal.

Degenen die de ring in minder dan zes pogingen verlaten, worden beschouwd als defect in osmose gevoeligheid. Controlestammen moeten worden gebruikt in elke SA Bristol en twee dieren worden gebruikt als positieve controles omdat ze de ringbarrière zullen vermijden. Controlestammen reageren achteruitgaand wanneer ze een osmotische barrière vinden die bestaat uit vier molare fructose. Neuro-deficient mutanten bommen hebben een gedrag dat vergelijkbaar is met dit op een type sterkte.

Neuro-deficient mutanten kunnen deze osmotische barrière echter niet detecteren. Dubbele mutante sterktes car in verschillende ative neur en nout-allelen herstelden het wildtype-fenotype dat reageert op de osmotische sterkte voor het verkrijgen van down-wormen door RNA-interferentie voeding geïsoleerde kolonies van e coli HD 11 vijf stam die is getransformeerd met L 44 40-vector die een fragment bevat dat overeenkomt met het doelgen. Bacteriën worden geïsoleerd op LBA of plaat met koolzuur de volgende dag.

Kies een bacteriekolonie en inoculeer LV vloeibaar medium. Laat het ongeveer zeven uur groeien met schudden bij 37 graden. Giet het dropje van deze cultuur op een NGM-plaat met koolzuurplafond en IPTG en wacht een nacht bij kamertemperatuur, waardoor bacteriën kunnen groeien en de inductie van de expressie van het fragment van het doelgen kan beginnen.

Het is noodzakelijk om een positieve en niet-negatieve controle te gebruiken voor RNA-interferentie. Voedingsexperimenten. De negatieve controle is gelijk.

I HT 11 vijf stam getransformeerd met TL 44 40-vector. De positieve controles ELI HT 11 vijf cellen getransformeerd met de L 44 40-vector die een 22-gensequentie bevat. Het lockdown van dit gen veroorzaakt een fenotype dat gemakkelijk onder de steriele microscoop kan worden onderscheiden.

De eerste dag. L vier stadium één van NGM PLA met bacteriën worden overgebracht naar een plaat met bacteriën en Koeweit op 20 graden Celsius gedurende 12 uur. Dit is een vastenperiode.

De volgende dag verplaats je de jonge volwassene naar een plaat geïnoculeerd met bacteriën die het specifieke RNA-interferentie-doelgen tot expressie brengen. Laat ongeveer 48 uur staan bij 20 graden Celsius voor het verkrijgen van de F1 nakomelingen. Kies vervolgens een paar F1 volwassen bommen op een andere plaat geïnoculeerd met dezelfde bacteriën gedurende de volgende twee dagen.

Selecteer en isoleer jonge volwassenen uit de F twee nakomelingen Scorering voor fenotypes Bristol N twee wildtype-stam vet met bacteriën die empathie veroorzaken. L 44 40-vector ging achteruit wanneer fijn. De osmotische barrière.

Bristol en echte witte type-stam gevoed met bacteriën die een fragment van het neur-gen van de elegans uitdrukken, slaagden er niet in de toes voor molare oplossingen te detecteren. Echter, neur-deficient mutant die de osmotische barrière niet kan detecteren, herstelde dit vermogen toen het werd gevoed met bacteriën die een fragment van het nane-gen van de zee elegans uitdrukken. In deze video laten we een eenvoudige methode zien waarmee het effect van genen die de osmotische vermijdingsrespons in zee elegans beïnvloeden, kan worden bestudeerd.

Een ring van fructose formal tight met Congo Red wordt gebruikt om de reactie van de bom op osmotische sterkte te analyseren. Neurologie-deficient mutanten zijn defect in deze reactie, maar NU-mutanten zijn niet gehinderd om tomo-stress te detecteren en vertonen een reactie vergelijkbaar met het wildtype-stam. Deze video laat zien dat dubbele mutante stammen die verschillende tive knockout-allelen in ing en release-genen dragen, het wildtype-fenotype herstelden dat reageert op osmotische sterkte.

Deze observaties werden bevestigd met behulp van RNA-interferentie, voedingslockdown-aanpak. Op deze manier was de wild