Name: A Novel RFP Reporter Steun in de visualisatie van het oog denkbeeldige Disc in Drosophila /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: Leer hoe je oogimaginaalschijven van Drosophila dissecteert met behulp van een RFP-reporter. Deze methode maakt visualisatie en identificatie van specifieke celtypen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door King&#39;s College Londen en de Royal Society.

<ol&gt;<li&gt; Plaats eerst een druppel PBS op een Sylgard schotel onder een dissectie microscoop.</li&gt;<li&gt; Volgende verwijder enkele omzwervingen derde instar larven uit een flacon of fles met behulp van een spatel en plaats ze in het PBS.</li&gt;<li&gt; Om te beginnen de dissectie met je linkerhand een pincet (als je rechts bent overhandigd) om een ​​larve greep twee derde van de weg naar de achterkant en dan het andere paar te gebruiken om de donker gekleurde mond haken houden aan het voorste einde.</li&gt;<li&gt; Nu voorzichtig uit elkaar te trekken van de larve door het bewegen van beide paren een pincet uit de buurt van elkaar. De monddelen moet uit de buurt komen van de rest van het lichaam met het oog / hersenen complex bevestigd.</li&gt;<li&gt; Om het oog schijven voor immunofluorescentie vast de schijven op dit moment vlek door ze te plaatsen in 4% paraformaldehyde / PBS-oplossing gedurende 30-45 minuten op ijs. Was daarna de schijven vier keer met PBST en vlek vervolgens met de juiste antilichamen.</li&gt;<li&gt; Het is het makkelijkst voor het oog schijven ontleden direct op een dia. Breng een druppel PBS op een dia en verplaats de schijven om de druppel PBS door die de monddelen.</li&gt;<li&gt; De imaginaire weefsels zijn doorzichtig en dus in eerste instantie het oog schijven zijn moeilijk te identificeren. Om het gemakkelijker te herkennen hen een dissectiemicroscoop gebruik met fluorescentie mogelijkheden. Met behulp van de eye-RFP reporter lijn in het oog schijven is duidelijk te zien als rood fluorescerend weefsel overlappen de sferische optische kwabben (zie figuur 1).</li&gt;<li&gt; Als u een fiber optic koude lichtbron met behulp van direct het licht onder een schuine hoek aan de dia, omdat dit zal de schijven groter contrast. Het oog / antennale schijven zijn aangesloten op de optische kwabben via de optische steeltje op het achterste en naar de monddelen via een steeltje uit de antennaal schijf op de voorste.</li&gt;<li&gt; Om ontleden het oog schijven houdt u de monddelen met behulp van een pincet en gebruik de andere paar op het oog schijven te scheiden van de larven hersenen. Volgende scheiden de ogen schijven uit de monddelen. Verwijder tenslotte de monddelen van de dia als deze kunnen de dekglaasje voorkomen plat.</li&gt;<li&gt; Als u ontleed alle oog schijven voorzichtig de slide kantelen en droog het overtollige PBS. Voeg dan een druppel Vectashield en voorzichtig plaats een dekglaasje bovenop.</li&gt;<li&gt; De schijven zijn nu klaar om te worden afgebeeld door een van beide epifluorescentie of confocale microscopie (figuur 2).</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"&gt; Representatieve resultaten</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Wanneer correct ontleed in het oog / antennaal schijf moeten plat liggen op de dia uit de buurt van een vreemde weefsel zoals de hersenen. De dorsale en ventrale polen van het oog schijf zijn gebogen en zo hebben de neiging op te vouwen, maar dit kan worden voorkomen door het nemen van een Z-serie over een confocale microscoop en het weglaten van deze onderdelen van de projectie. Hoewel de schijf is een monolaag epitheel de variabele posities van de kernen moet een Z-serie projectie om een ​​algemeen beeld van de schijf te krijgen. Een projectie van een typisch eye-RFP ogen / antennale schijf genomen op een confocale microscoop wordt weergegeven in figuur 2. We nemen meestal een urn secties door de schijf met behulp van een 20x of 40x lens. Het oog-RFP reporter is kernenergie gelokaliseerd en zo het patroon te zien in Figuur 2 geeft de kernen van de cellen die RFP.</p&gt;<p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/1617/1617fig1.jpg" alt="figure 1" /<br /<strong&gt; Figuur 1. Eerste dissectie van het oog / hersenen complex van een eye-RFP derde larvestadium Drosophila larven.</strong&gt; Het oog / antennale verbeelding disc (geschetste) gezien kan worden bevestigd aan de monddelen (MP) en bedekken de optische kwab (OL) van de hersenen. Het beeld werd gemaakt met behulp van een fluorescentie microscoop om het ontleden van de RFP uitdrukking in het oog disc te tonen. Anterior is aan de linkerkant. Schaal bar: 300 pm.</p&gt;<p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/1617/1617fig2.jpg" alt="figure 2" /<br /<strong&gt; Figuur 2. Expressie van de eye-RFP reporter in het oog imaginaire disc.</strong&gt; Een derde instar oog (ED) / antennale schijf (AD) ontleed van een eye-RFP larve met RFP expressie (rood). De schijf werd gekleurd met phalloidin (groen), die vlekken apicale celoppervlak en toont de morfogenetische groef (pijlpunt). RFP wordt uitgedrukt in voorloper cellen rondom de MF, in fotoreceptoren 1,6,7 en in de kegel cellen. Anterior is aan de linkerkant. Schaalbalk: 25 pm.</p

<ol><li>Doroquez, D. B., Rebay, I. Crit Rev Biochem Mol Biol. 41 (6), 339-339 (2006).</li>
<li>Kaul, A. K., Craig, G. M., McNeill, H., Bateman, J. M. , Forthcoming.</li>
<li>Barolo, S., Castro, B., Posakony, J. W. Biotechniques. 36 (3), 436-436 (2004).</li>
</ol>

Dissectie van de Drosophila oog denkbeeldige schijf is eenvoudig, maar kan de tijd nemen om te beheersen. De kritische stappen zijn de identificatie van het oog schijf en de dissectie uit de buurt van het larvale hersenen. Identificatie van het oog schijf is eenvoudiger met behulp van de eye-RFP lijn hier. Eventuele wijzigingen zijn aan de antennaal schijf of de peripodial membraan te verwijderen, of om de optische kwab aan de PR-axonen het invoeren van de hersenen te visualiseren verlaten. <p class="jove_c...

a novel rfp reporter steun in de visualisatie van het oog denkbeeldige disc in drosophila</em

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Oog is een krachtig modelsysteem voor de bestudering van gebieden, zoals neurogenese, signaaltransductie en neurodegeneratie. Veel van de ontdekkingen gemaakt met behulp van dit systeem gebruik gemaakt hebben van de spatio-temporele aard van de fotoreceptor differentiatie bij de ontwikkeling oog imaginaire disc. Voor het gebruik van dit systeem is het eerst nodig voor de onderzoeker om te leren te identificeren en ontleden het oog disc. Beschrijven we een nieuwe RFP verslaggever om te helpen bij de identificatie van het oog schijf en de visualisatie van specifieke celtypes in de zich ontwikkelende oog. We detail een methodologie voor dissectie van het oog denkbeeldige schijf uit derde instar larven en beschrijven hoe de eye-RFP reporter kan helpen in deze dissectie. Dit in het oog RFP reporter is alleen tot uitdrukking in het oog en kunnen worden gevisualiseerd met behulp van fluorescentie microscopie, hetzij in levend weefsel of na fixatie zonder de noodzaak voor signaalversterking. We laten ook zien hoe deze reporter kan worden gebruikt om specifieke cellen te typen in het oog schijf te identificeren. Dit protocol en het gebruik van de eye-RFP reporter zal helpen onderzoekers met behulp van de<em&gt; Drosophila</em&gt; Oog op het fundamenteel belangrijke biologische vragen te beantwoorden.

Beschrijven we een nieuw rood fluorescerend eiwit (RFP) reporter dat specifiek wordt uitgedrukt in de<em&gt; Drosophila</em&gt; Oog. We detail een methodologie voor dissectie van het oog denkbeeldige schijf en hoe deze verslaggever kan worden gebruikt om steun in de dissectie en identificatie van specifieke celtypes in de zich ontwikkelende oog.

A Novel RFP Reporter Steun in de visualisatie van het oog denkbeeldige Disc in Drosophila</em

Het oog van de Drosophila is een krachtig modelsysteem voor het bestuderen van gebieden zoals neurogenese, signaaltransductie en neurodegeneratie. Veel van de ontdekkingen ...

De nieuwe transgene IRFP Reporter Drosophila-lijn tot expressie van het rood fluorescerende eiwit of RFP in specifieke cellen in de I-imaginale schijf. Deze transgene lijn kan helpen bij de identificatie, dissectie en markering van specifieke celtypen in het ontwikkelende oog. Om de imaginale schijf van het oog te dissecteren, worden larven in het dwalende derde stadium met een spatel aan de zijkant van een vial verwijderd.De larven worden vervolgens in een druppel PBS op een sill guard-schaaltje geplaatst. De monddelen waaraan de oogschijven vastzitten, worden met een pincet van de rest van de larve verwijderd; de oogschijven worden vervolgens naar een objectglas verplaatst, waar ze worden gedisseceerd van de monddelen en de hersenen. Hallo, ik ben Amna Cole van het Joseph Bateman-lab in het Wolfson Center for Age Related Diseases, Kings College London.Vandaag laten we u een procedure zien voor het dissecteren van imaginale oogschijven van Drosophila. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de genen te bestuderen die betrokken zijn bij neurogenese. Laten we beginnen.Om te beginnen met het dissekeren van de imaginale oogschijven, plaatst u een druppel PBS op een met Sylgard gecoate Petrischaal. Onder een dissectiemicroscoop zal de Sylgard-coating helpen om te voorkomen dat de pincetten beschadigd raken tijdens de dissectie. Gebruik vervolgens een spatel om een derde-instarlarve op te pakken en plaats deze in de druppel PBS. Pak met een pincet in elke hand de larve vast, waarbij u met één set pincetten twee derde van de weg naar het posterieure uiteinde grijpt. Gebruik nu de andere set pincetten om de donkergekleurde monddelen aan het anterieure uiteinde van de larve vast te houden.Trek de larve voorzichtig uit elkaar door de pincetten van elkaar af te bewegen. De monddelen moeten loskomen van de rest van het lichaam, waarbij het oog-hersencenter aan blijft zitten. Plaats vervolgens een druppel PBS op een objectglas en breng de schijfjes over naar de druppel PBS door de monddelen vast te houden.Schakel nu over naar de fluorescentiemodus op de dissectiemicroscoop; aangezien alleen de oogimaginale schijven RFP tot expressie brengen, kunnen deze eenvoudig worden geïdentificeerd als rood fluorescent weefsel dat over de sferische optische lobben ligt om het contrast van de schijven te verhogen. Richt de glasvezel-koudlichtbron in een schuine hoek op het preparaat. De oogimaginale schijven zijn aan de posterieure zijde via de optische steel verbonden met de optische lobben en aan de anterieure zijde via een steel vanuit een antenneschijf verbonden met de monddelen.Om de imaginale schijven van het oog te dissekeren, houdt u de delen vast met één pincet en gebruikt u de andere om de imaginale schijven van het oog te scheiden van het larvale brein. Vervolgens scheidt u de imaginale schijven van het oog van de monddelen. Zodra de monddelen van de imaginale schijven van het oog zijn gescheiden, verwijdert u deze van het objectglas.De oogimaginale schijven moeten nu plat op het objectglas liggen en vrij zijn van enig vreemd weefsel, inclusief hersenweefsel. Ga verder met het dissekeren van de resterende imaginale schijven. Zodra alle oogimaginale schijven zijn gedissekeerd, kantelt u het objectglas voorzichtig en gebruikt u een klein stukje keukenpapier om het overtollige PBS te drogen.Voeg nu een druppel Vector Shield monteermedium toe en plaats voorzichtig een dekglas bovenop. De schijfjes zijn nu klaar om te worden afgebeeld met epi-fluorescentie- of confocale microscopie. Als de beeldvorming op een later tijdstip plaatsvindt, bewaar het preparaat dan bij vier graden Celsius.Het RFP blijft gedurende ten minste één jaar zichtbaar; bij beeldvorming moeten Z-stapelbeelden worden opgenomen op een confocale of Zeiss aome-microscoop met een tussenruimte van 1 µm met behulp van een 20 x of 40 x lens. Projectiebeelden kunnen vervolgens worden gegenereerd met de software van de microscoop. Imaginale schijven van vliegen die IRFP tot expressie brengen, werden gedisseceerd en gekleurd met Phin. Beeldvorming werd vervolgens uitgevoerd op een zes aome-microscoop met een tussenruimte van 1 µm met behulp van een 20 x lens. De cellen van de oogschijf die RFP tot expressie brengen, zijn in rood weergegeven.De morfogenetische groef wordt gevisualiseerd door foid en kleuring en is groen weergegeven. De dorsale en ventrale polen van de oogschijf zijn gebogen en neigen tot plooien. Deze secties kunnen uit het uiteindelijke projectiebeeld worden verwijderd.Hoewel de schijf een monolaags epitheel is, vereisen de variabele posities van de kernen een Z-serie projectie om een totaalbeeld van de schijf te verkrijgen. Aangezien de IRFP-reporter nucleair gelokaliseerd is, vertegenwoordigt het hier waargenomen patroon de nucleaire expressie van RFP. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe de procedure voor het dissekeren van vaginale oogschijven van drosophila wordt uitgevoerd.Bij het uitvoeren van deze procedure is het aanbevolen om een fijnne pincet te gebruiken en is het waarschijnlijk verstandig om koffie te vermijden. Bedankt voor het kijken en veel succes met al uw experimenten.

a-novel-rfp-reporter-to-aid-visualization-eye-imaginal-disc

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschrijven we een protocol om de migratie van gliacellen te onderzoeken in de zich ontwikkelende Drosophila oog met behulp van levende microscopische analyse gecombineerd met GFP gelabelde gliacellen.

Live-Imaging van gliale cel migratie in de Drosophila Eye verbeelding Disc

Een standaard aanpak voor volwassenen voor te...

De voorbereiding van Adult Drosophila Ogen voor Thin Sectioning en microscopisch onderzoek

Source: Hellerman, M. B., et al. Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye. J. Vis. Exp. (2015)The video demonstrates a live-imaging technique to study eye patterning in a Drosophila melanogaster pupa. Green fluorescent protein (GFP)-tagged markers enable visualization of cellular organization and differentiation during the formation of the developing eye structure.

Live Imaging of the Drosophila Pupal Eye Using Fluorescence Microscopy

De Tomaat / GFP-FLP / FRT methode houdt in het visualiseren van mozaïek fotoreceptorcellen in levende Drosophila. Het kan worden gebruikt om individuele fotoreceptor celtypes in het netvlies te volgen gedurende dagen of weken. Deze methode is geschikt voor studies van retinale degeneratie en neurodegeneratieve ziekten of fotoreceptorcel ontwikkeling.

De Tomaat / GFP-FLP / FRT Methode voor Live Imaging van Mozaïek Adult<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotoreceptorcellen

De volwassen structuren van Drosophila zijn afgeleid van zak-achtige structuren die imaginale schijven worden genoemd. Analyse van deze schijven biedt inzicht in vele ontwikkelingsprocessen, waaronder weefselbepaling, oprichting van compartimentgrenzen, celproliferatie, celbestemmingsspecificatie en cellulaire planaire polariteit. Dit protocol wordt gebruikt om imaginale schijven voor te bereiden op licht-/fluorescentiemicroscopie.

Dissectie en Immunokleuring van Imaginal schijven uit Drosophila melanogaster

Dit protocol presenteert een efficiënte methode voor het beeldvormen van het levende Drosophila pupale oogneuro-epitheel. Deze methode compenseert voor weefselbeweging en ongelijke topologie, verbetert de visualisatie van celgrenzen door het gebruik van meerdere GFP-gelabelde junctie-eiwitten en maakt gebruik van een eenvoudig te monteren beeldvormingsopstelling.

Live-beeldvorming van de Drosophila Pupal Eye

Het doel van deze techniek is om onderzoekers in staat te stellen dissectie, immunokleuring en montage van poppenoogschijfjes uit Drosophila melanogaster van elke leeftijd uit te voeren.

Dissectie en Plaatsing van<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Eye Discs

Dit protocol laat zien hoe fluorescent gemerkt, genetisch bepaald klonale tumoren in de Drosophila oog / antennaal verbeelding schijven (EAD) te genereren. Het beschrijft hoe de EAD en de hersenen ontleden van de derde instar larven en hoe ze te verwerken te visualiseren en te kwantificeren genexpressie veranderingen en tumor invasiviteit.

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Tumor Model: visualisatie en kwantificering van genexpressie en Tumor Invasiviteit met behulp van genetische Mozaïeken

Dit protocol beschrijft een gedetailleerde methode voor de lange termijn ex vivo cultuur en live beeldvorming van een Drosophila imaginaire disc. Het toont fotoreceptor differentiatie en ommatidial rotatie binnen de 10 uur periode van live-imaging van het oog disc. Het protocol is eenvoudig en niet duur setup nodig.

Langdurige Live-Imaging van<em&gt; Drosophila</em&gt; Disc Eye

De timing van blootstelling aan liganden kan invloed hebben op hun ontwikkelings gevolgen. Hier laten we zien hoe het beeld vrijkomen van een Drosophila bot morfogenetische eiwit (BMP) genaamd DPP uit cellen van de vleugel schijf.

Imaging DPP-release van een Drosophila -vleugel schijf

Dit artikel beschrijft een efficiënt protocol voor beeldende schijfdissectie en antistofkleuring dat zuinig is met reagentia en het hanteren van imaginale schijven in kleine aantallen vergemakkelijkt.

Kleinschalige dissectie en antilichaamkleuring van oog-antenne en vleugelbeeldschijven van Drosophila melanogaster

Leer hoe je oogimaginaalschijven van Drosophila dissecteert met behulp van een RFP-reporter. Deze methode maakt visualisatie en identificatie van specifieke celtypen mogelijk.

A Novel RFP Reporter Steun in de visualisatie van het oog denkbeeldige Disc in Drosophila

Meer video's verkennen