De voorbereiding van embryo's voor Elektronenmicroscopie van de Drosophila Embryonale hart buis

Deze video legt uit hoe transmissie-elektronenmicroscopie, ook wel bekend als TEM, wordt uitgevoerd op het embryonale hart van de drosophila. Het hart is een waardevol modelsysteem gebleken voor het bestuderen van celmigratie, cel-celadhesie en veranderingen in de celvorm. Deze techniek maakt de visualisatie van de vorm van het hartlumen mogelijk, evenals van ultrastructurele componenten zoals celmembranen, cel-celverbindingen en het basaalmembraan.

Om deze procedure te starten, wordt een fixeeroplossing bereid die geschikt is voor transmissie-elektronenmicroscopie van drosophila-embryo's. Vervolgens wordt een verzameling gecoate embryo's van 0 tot 20 uur in de fixeeroplossing geplaatst. Na voltooiing worden de embryo's uit de fixeeroplossing gehaald en gehanteerd terwijl ze zijn bevestigd aan dubbelzijdige tape.

In een petrischaal met gedeïoniseerd buffer drijven de embryo's in de buffer en worden ze met een pipet opgevangen. Vervolgens worden de embryo's gefixeerd en ondergaan ze een dehydratiegradiënt. Zodra ze zijn geïnfiltreerd met hars, worden ze overgebracht naar een inbeddingsvorm waarin ze worden uitgelijnd.

Het resulterende blok wordt gesneden met een diamantmes. De coupes worden op koperen grids geplaatst, gekleurd en onderzocht. Hallo, ik ben Nadine Lop van het laboratorium van Sunita Kramer in de afdeling Pathologie en Laboratoriumgeneeskunde aan de University of Medicine and Dentistry of New Jersey op de Robert Wood Johnson Medical School.

Ik ben Raj Patel. Ik ben de elektronenmicroscopist van de PON pathologie. Vandaag laten we u een procedure zien voor het prepareren en afbeelden van oph-embryo's voor transmissie-elektronenmicroscopie.

Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de hartmorfogenese van Drosophila te bestuderen. Laten we beginnen. Laten we beginnen.

Bereid vóór het verwerken van de drosophila-embryo's een verse fixeeroplossing voor de heptaan-permeatiemethode van embryofixatie. Pipetteer in een zuurkast twee milliliters van een vers bereide oplossing met 12,5% glutaraldehyde in Cate-buffer in een glazen scintillatiebuisje. Voeg acht milliliters ADA-heptaan toe en schud krachtig.

Wacht vervolgens één minuut. Nadat de twee fasen zijn gescheiden, bevat de bovenste fase het ADA-heptaan, verzadigd met glutaaraldehyde, wat de fixeeroplossing is. Pipetteer de bovenste fase in een schoon vials en zet deze apart. Om embryo's van 0 tot 20 uur te verzamelen, gebruikt u een embryo-opvangkamer, wat een klein mandje is met een uitneembare gaasinsert.

Begin met het verwijderen van de druivensapplaat met de embryo's en verwijder alle dode vliegen. Maak vervolgens de embryo's los van de druivensapplaat met behulp van water en een penseel en breng de embryo's over naar de verzamelkamer voor embryo's met een spuitfles gevuld met water.

Spoel eventuele overtollige gist van de embryo's vanaf de druivensapplaat. Verwijder het buitenste chorionmembraan door de embryo's twee tot drie minuten in een 50% bleekmiddeloplossing te weken of totdat de embryo's naar het oppervlak drijven. Spoel grondig na met gedestilleerd water en droog de embryo's op een papieren handdoek.

Pak met een pincet de maasinsert op, die nu bedekt moet zijn met gecoate embryo's. Plaats de insert in het fixeeriddel, zodat de embryo's van de maas vallen. Laat de embryo's anderhalf uur fixeren bij vier graden Celsius terwijl ze worden gemengd op een orbitale schudplaat.

Zodra de incubatie is voltooid, plaatst u de embryo's in een Petrischaal bekleed met dubbelzijdige plakband, waarbij u zo min mogelijk van het fixeermiddel meeneemt. Schud de schaal om de embryo's in een enkele laag te verspreiden en plaats deze vervolgens in de zuurkast om het heptaan te laten verdampen. Zodra de embryo's zijn opgedroogd, bedekt u de embryo's met buffer die 0,1% tween bevat en hand de vize.

Laatstadium 16-embryo's onder een dissectiemicroscoop met een stompe wolfraamnaald. Embryo's die zijn behandeld, drijven en kunnen worden opgevangen met een pasteurpijpje; overbreng de embryo's naar een 1,5 milliliter microcentrifugebuis. Spoel de embryo's in 0,1 molar caac-buffer en fixeer ze vervolgens na in 1% osmiumtetroxide gedurende één uur bij kamertemperatuur.

Spoel de embryo's na de incubatie af met Cate-buffer. Dehydrateer de embryo's opnieuw in een oplopende reeks ethanol en aceton. Begin met 50% ethanol gedurende 10 minuten, gevolgd door 70% ethanol gedurende 10 minuten, dehydrateer vervolgens in 90% aceton gedurende 10 minuten, en eindig met stappen van 10 minuten in 100% aceton.

Verwijder het aceton. Begin het infiltratieproces door een mengsel van ein-sprayhars en aceton in een verhouding van één-op-één toe te voegen. Zorg ervoor dat het monster onder vacuümdruk staat en behandel dit gedurende drie minuten in de magnetron.

Houd de vacuümdruk nog vijf minuten vast. Vervang het mengsel van hars en aceton door 100% hars en verhit opnieuw in de magnetron onder vacuümdruk. Vervang de hars en verhit in de magnetron onder druk.

Herhaal dit voor een derde en laatste infiltratiestap. Breng de embryo's over van de microcentrifugebuis naar een siliconen inbedmal. Lijn de embryo's in een rij uit, zodat het posterieure uiteinde van het embryo overeenkomt met de taps toelopende rand van de mal.

Spek wordt gedurende de nacht in een oven op 70 °C gehouden. Verwijder vervolgens het resulterende blok voor het maken van coupes. Gebruik een microtoom om coupes van één micrometer door de embryo's te snijden.

Zodra het blok is gesneden en het embryo is bereikt, wordt een lus gebruikt om een enkel coupesectie naar een objectglas te verplaatsen om vast te stellen of de juiste diepte voor de visualisatie van het hart is bereikt voordat de visualisatie plaatsvindt. Verhit de sectie kort op een warmteplaat en kleur de sectie met methyleenblauw door eerst een druppel op het objectglas aan te brengen en deze vervolgens kort te verhitten.

Spoel opnieuw met gedeïoniseerd water en bestudeer de sectie onder een microscoop op de gewenste snijdiepte. Het lumen van het hart moet met een lichtmicroscoop herkenbaar zijn om te voldoen aan de ruimtebeperkingen. Trim het blok opnieuw zodat er maximaal vijf embryo's in dwarsdoorsnede zijn opgenomen waarin het embryonale hart zichtbaar is.

Snijd secties van 90 nanometer met de microtoom. Neem meerdere secties op een kopergrid op. Kleur het grid gedurende 10 minuten met 3% al acetate en spoel daarna drie keer af met gedestilleerd water.

Kleur het raster nu gedurende twee en een halve minuut met loodcitraat in een kamer met natriumhydroxidepellets om een koolstofdioxidevrije omgeving te creëren. Spoel na de incubatie drie keer met gedestilleerd water. Examineer de coupes met een elektronenmicroscoop bij 80 kV en fotografeer deze met een CCD-camera.

Om vast te stellen of de sectiediepte en het stadium correct waren uitgevoerd, moet duidelijk zijn dat er een lumen van een volwassen hart is gevormd tussen de twee cardioblasten van de dorsale middellijn. Om te bepalen of de celmembranen intact zijn, dient het lumen van het hart te worden onderzocht op de aanwezigheid van extracellulaire matrix en moet er gezocht worden naar de aanwezigheid van cristae en mitochondriën. We hebben u zojuist laten zien hoe u de ultrastructuur van het embryonale hart van de drosophila kunt bepalen bij het uitvoeren van deze procedure.

Het is belangrijk om eraan te denken de drosophila-embryo's correct te stadioneren en de componenten van de hars nauwkeurig af te meten en goed te mengen. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experiment.