Het meten van diffusiecoëfficiënten via twee-foton Fluorescence Recovery After Photobleaching
26 februari 2010
In dit artikel beschrijven we de procedure voor het meten van diffusiecoëfficiënten het gebruik van multi-foton fluorescentie herstel na fotobleken. We zullen beginnen met het uitlijnen van de laser langs de optische pad naar het monster en het bepalen van de juiste experimentele parameters, ga dan verder het genereren en tenslotte montage fluorescentie herstel curves.
De multi fotonfluorescentie. Herstel na de fotoblekingprocedure wordt eenvoudig gedemonstreerd met een vrij diffunderend monster van fluorescerende kleurstofmoleculen. Eerst wordt een laag intense laserstraal naar het monster gestuurd om een referentieniveau van fluorescentie te genereren van de D-moleculen binnen het focale volume van de laser.
Vervolgens wordt een korte, hoog intense laserflits gestuurd om een deel van de kleurstofmoleculen binnen het focale volume te fotobleken. Ten slotte wordt de laserstraal gedimd naar het vorige lage intensiteitsniveau en wordt de fluorescentie gemonitord terwijl fotobleke moleculen naar buiten diffunderen en worden vervangen door nog fluorescerende moleculen van buiten het focale volume. De resulterende fluorescentie als functie van de tijdcurve wordt geanalyseerd om de diffusiecoefficient te verkrijgen.
Hallo, ik ben Kelly Sullivan van het Laboratorium van Edward Brown in de Afdeling Biomedische Techniek aan de Universiteit van Rochester. Vandaag laten we u zien hoe u multi fotonfluorescentie herstel na fotobleking uitvoert. We gebruiken deze techniek in ons laboratorium om diffusie te bestuderen in zowel in vitro als in vivo biologische systemen.
Dus laten we beginnen. Om te beginnen stelt u de gewenste lasergolflengte in en plaatst u de juiste filter voor de fotomultiplierbuis of PMT. Om beschadiging van de pcal-cel te voorkomen, stelt u het laservermogen in op 200 milliwatt of minder.
Er zijn twee spiegels georiënteerd in een figuur vier stroomopwaarts van de pcal-cel. Deze spiegels zijn noodzakelijk en voldoende om de laserstraal door de pcal-cel uit te lijnen. Stel de spanningsoffset op de pcal-cel biascontroller op nul, pas de laserstraal door de pcal-cel zodanig aan dat de laser gecentreerd is in de voor- en achterramen.
Gebruik de spiegel stroomopwaarts in de figuur vier om de straal in het voorvenster te centreren en de spiegel stroomafwaarts in de figuur vier om de straal in het achtervenster te centreren. Stel nu de spanning over de pcal-celkristallen op de maximale waarde. De juiste waarde is golflengteafhankelijk en kan worden gevonden in de pcal-cel instructiehandleiding.
Pas de spiegels in de figuur vier stroomopwaarts van de pcal-cel aan tot het uitgangsvermogen van de pcal-cel gemaximaliseerd is. Schakel nu de spanning over de kristal uit op nul en pas de spanningsoffset op de biascontroller aan om het uitgangsvermogen van de pcal-cel te minimaliseren. Breng het laservermogen op de pcal-cel terug naar de waarde die vereist is voor het experiment.
Ga nu naar de microscoop, krijg een goede visuele focus op een gestandaardiseerd fluorescerend monster. Hier gebruiken we vaste fluorescerende pollenkorrels. Eenmaal scherpgesteld, verzegel de microscoop, pas het laservermogen aan op een geschikt niveau voor het beeldvormen van het monster door de spanning over de pcal-celkristallen te wijzigen.
Ten slotte zet u de lichten uit en schakel de PMT in. Start een herhaalde beeldscan van het gestandaardiseerde monster en pas de spiegels stroomafwaarts van de pcal-cel aan tot een scherp beeld van het monster is verkregen. Laten we nu kijken naar het bepalen van veilige monitorvermogens volksfocus binnen het monster.
Voor het doel van deze video zullen we een monster van waterige kleurstof gebruiken dat zich in een kuiltje in een glasplaat bevindt en bedekt is met een dekglas. Dim de laser tot een laag maar redelijk vermogen voor het genereren van fluorescentie binnen het monster. Verzegeld de microscoop, leidt de uitgang van de PMT om naar de fotonteller.
Zet de lichten uit, schakel de PMT in en begin met een puntscan op de microscoopsoftware. Stel de fotonteller in om te integreren over een tijdschaal die veel langer is dan de verwachte fluorescentie hersteltijd en neem een redelijk aantal datapunten op. Verhoog het vermogen en neem nog een reeks fotontellingsgegevens.
Ga door met het verhogen van het vermogen totdat de toename in fotontellingen significant lijkt af te nemen. Met betrekking tot de vermogenstoename plot, de logaritme van de fotontellingen als functie van de logaritme van het vermogen. Elke afwijking van een helling van twee geeft bleken aan.
Tijdens de monitor selecteert u een redelijk monitorvermogen dat onder deze grens ligt. Laten we nu de ingangsparameters naar de multikanaalschaler en de pulsgenerator bepalen. Op de pulsgenerator.
Stel de vooraf tijd in op een tot twee keer groter dan de verwachte halve hersteltijd en de bleektijd op een tiende van de verwachte halve hersteltijd op de schaler. Stel de binbreedte in op ongeveer de helft van de bleekduur en stel het aantal bins per record in, zodat het product van uw geselecteerde binbreedte en bins per record groter is dan uw verwachte volledige hersteltijd. Plus de preble en bleektijden, keer terug naar de pulsgenerator en stel de frequentie van de preble en bleeksequentie gelijk aan een waarde die net kleiner is dan het omgekeerde van het product van de binbreedte maal het aantal bins per record.
Stel ten slotte het aantal records per scan in op de schaler op basis van de signaalintensiteit bij uw gekozen monitorvermogen. Stel nu de monitorvermogen in op een veilig niveau en stel de bleekvermogen in op ongeveer 200 milliwatt boven de bleekgrens die tijdens de monitorbleekingstest werd bepaald. Deze vermogens worden beide ingesteld als verschillende spanningen over het al-cel kristal, sluit de microscoop, zet de lichten uit.
Schakel de PMT in. Begin met een puntscan op de beeldvormingssoftware. Start vervolgens de pulsgenerator en schaler.
Om de resulterende herstelcurve te analyseren, markeert u drie belangrijke punten. De preble fluorescentie, de fluorescentie direct na het bleken en de fluorescentie aan het einde van de dataset. Gebruik de fluorescentiewaarden vóór en direct na het bleken om de halve hersteltijd beter te schatten.
Gebruik nu de regels die in eerdere stappen zijn geschetst om de waarden voor de preble bleek en beginbreedte duur bij te werken. Neem een nieuwe curve en blijf de parameters aanpassen tot de resulterende curve een sterke bleek en een glad herstel vertoont. Controleer op excitatiesaturatie door de logaritme van de bleekdiepteparameter uit te plotten als functie van de logaritme van het vermogen.
Elke afwijk
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft de procedure voor het meten van diffusiecoëfficiëntenen met behulp van multi-foton fluorescentieherstel na fotobleken. Het proces omvat het uitlijnen van de laser langs het optische pad naar het monster en het fitten van fluorescentieherstelcurven.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Fluorescentiemicroscopie
- Diffusiemeting
- Fotobleaching-technieken
Achtergrond
- Multi-foton fluorescentieherstel na fotobleken is een techniek die wordt gebruikt om moleculaire diffusie te bestuderen.
- De methode biedt inzicht in de dynamiek van fluorescerende moleculen in een monster.
- Het begrijpen van diffusiecoëfficiënten is essentieel voor diverse biologische toepassingen.
- De procedure is toepasbaar op vrij diffuserende monsters van fluorescerende kleurstofmoleculen.
Doel van de studie
- Om de procedure voor het meten van diffusiecoëfficiënten te demonstreren.
- Om een gedetailleerde methodologie te bieden voor onderzoekers in het vakgebied.
- Om het begrip van de moleculaire dynamiek in biologische systemen te vergroten.
Gebruikte methoden
- Een laserstraal met lage intensiteit genereert een referentieniveau van fluorescentie.
- Een laserflits met hoge intensiteit zorgt voor fotobleaching van een deel van de kleurstofmoleculen.
- De fluorescentie wordt gemonitord terwijl gefotobleachte moleculen diffunderen en worden vervangen.
- Fluorescentieherstelcurves worden geanalyseerd om diffusiecoëfficiënten te bepalen.
Belangrijkste resultaten
- De procedure meet effectief de diffusiecoëfficiënten van fluorescerende moleculen.
- Fluorescentieherstelcurven leveren kwantitatieve gegevens over moleculaire dynamica.
- De methode is reproduceerbaar en kan op diverse monsters worden toegepast.
- De resultaten dragen bij aan het begrip van moleculaire interacties in biologische contexten.
Conclusies
- Multi-foton fluorescentieherstel na fotobleken is een waardevolle techniek voor het meten van diffusiecoëfficiënten.
- De beschreven methodologie kan door onderzoekers worden gebruikt om moleculaire dynamiek te bestuderen.
- Verdere toepassingen van deze techniek kunnen ons begrip van biologische processen vergroten.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Het meten van diffusiecoëfficiënten via tweefoton-fluorescentieherstel na fotobleken biedt kwantitatieve inzichten in de moleculaire dynamiek in biologische systemen, wat targetvalidatie en mechanistische risicoreductie in de vroege ontdekkingsfase ondersteunt. De techniek maakt een reproduceerbare, labelvrije beoordeling van macromoleculair transport mogelijk, wat bijdraagt aan de assayontwikkeling en het voorspellend vertrouwen in workflows voor leadidentificatie. De toepasbaarheid op zowel in vitro als in vivo systemen verbetert de translationele continuïteit en vermindert biologische onzekerheid bij preklinische besluitvorming.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door het kwantificeren van het diffusiegedrag van macromoleculen in ziekte-relevante systemen.
- Operationele waarde: Maakt biologische risicoreductie mogelijk door directe meting van de moleculaire mobiliteit in natuurlijke of gemanipuleerde omgevingen.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door het leveren van diffusiegebaseerde metrieken die correleren met target engagement en bindingskinetiek.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream screening door basisdiffusieparameters vast te stellen.
- Reproduceerbaarheid: Levert kwantitatieve, fluorescentiegebaseerde read-outs die de standaardisatie van de assay over verschillende runs en laboratoria ondersteunen.
- Schaalbaarheid: Integreert met automatiseringsplatforms zoals LabVIEW voor een verhoogde doorvoer in lead-screeningcampagnes.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Van toepassing op in vivo biologische systemen, waardoor beoordeling van diffusie in weefselachtige omgevingen mogelijk wordt.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen discovery- en preklinische workflows door consistente biofysische meetwaarden over verschillende modelsystemen te leveren.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Informeert go/no-go-beslissingen door moleculaire transporteigenschappen te kwantificeren die de drugdistributie en targettoegang beïnvloeden.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van vroege targetvalidatie via lead-identificatie tot preklinische evaluatie, en levert biofysische gegevens die het moleculaire ontwerp en de optimalisatie informeren.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothese-testen door te meten hoe macromoleculaire diffusie verandert onder experimentele omstandigheden, waardoor het gedrag van signaalpaden en targets wordt verduidelijkt.
- Screening: Maakt assay-gereedheid mogelijk via gestandaardiseerde metingen van fluorescentieherstel, wat een consistente evaluatie van verbindingen waarborgt.
- Analytics: Genereert kwantitatieve diffusiecoëfficiënten via kleinste-kwadratenmethode-fitting van herstelcurven, wat een objectieve vergelijking van moleculaire varianten mogelijk maakt.
- Translationeel Onderzoek: Sluit aan op preklinische continuïteit door diffusiemetingen in zowel in vitro als in vivo systemen mogelijk te maken, wat extrapolatie over verschillende schalen ondersteunt.
- Enterprise Reuse: Fungeert als een herbruikbaar biofysisch platform voor het beoordelen van moleculaire dynamiek over meerdere projecten en target-klassen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Biedt voorspellend vertrouwen bij targetvalidatie door mechanische ambiguïteit rond moleculaire mobiliteit en interacties te verminderen.
- Operationele waarde: Waarborgt standaardisatie en reproduceerbaarheid door gedefinieerde laserparameters, bleach-protocollen en geautomatiseerde gegevensverwerving.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroege risicoreductie van targets mogelijk te maken op basis van biofysische profielen afgeleid uit diffusie.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering door targets te identificeren met gunstige moleculaire transportkenmerken voor verdere ontwikkeling.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in tweefotonmicroscopie, fotobleachingtechnieken en fluorescentiekwantificering.
- Is afhankelijk van instrumentatie, waaronder gepulste lasers, Pockels-cellen, fotontellers en compatibele scanningsystemen.
- Vereist standaardisatie van laservermogen, bleachduur en bin-breedte-instellingen tussen gebruikers en locaties.
- Houdt rekening met adaptaties bij de overgang van waterige kleurstofmodellen naar complexe biologische monsters zoals cellen of weefsel.
- Wordt beperkt door de noodzaak van fluorescentielabeling of intrinsieke fluorescentie, wat optimalisatie kan vereisen voor targets met een lage abundantie.
