Live-dissectie van Drosophila Embryo's: Gestroomlijnde methoden voor het screenen Mutant Collections door antilichaam kleuring
29 december 2009
We beschrijven een gestroomlijnde protocol voor het genereren van "filet" bereidingen van Drosophila embryo's van bepaalde genotypen. Dit protocol maakt een efficiënte uitvoering van een variëteit van genetische screens. Het maakt ook een uitstekende visualisatie van structuren in de late embryo.
Hier zien we de procedure voor het verzamelen van embryo's. Breng vliegen over van de flesjes naar de buizen van een vijfvakken verzamelkamer. Leg vervolgens een druivenboerderij plaat bovenop de kamer en laat de vliegen een paar uur eieren leggen.
Wanneer de embryo's in de juiste fase zijn, verplaats ze dan van de druivenaate naar dubbelzijdig plakband met een penseel. Rol nu de embryo's uit hun kons en lijn ze op op een agarblok met hun ventrale kanten. Bovenaan in het midden zien we een dia met een rechthoek van was en een stukje dubbelzijdig plakband Bij het ene uiteinde keer je het dubbelzijdige plakband om over het blok met de uitgelijnde embryo's en breng het in contact met de embryo's om ze naar de dia over te brengen.
Ze zullen nu onmiddellijk met de dorsale kant omhoog zijn. Voeg PBS toe aan het gebied van de dia dat is omsloten door het rechthoekige was om de embryo's te bedekken. De bovenkant toont een zijkant van de dia en de onderkant toont een bovenkant.
Snijd een spleet langs de viel membraan met een glazen dissectienet. Prik de embryo's in het hersengebied, til ze op en verplaats ze in rijen op het glas. Ontleed vervolgens elk embryo om een filet te maken.
Aan het einde van de procedure heb je een dia met rijen filet embryo's. Het is nu klaar om te fixeren. Hoi, ik ben Peter Lee, een poster in het Kaizens lab in de afdeling biologie aan Caltech.
Hallo, ik ben Ashley Wright, een afgestudeerde student aan Caltech in Kaizens Lab. Ik ben Kaizen, een professor aan Caltech, en mijn onderzoeksgroep werkt aan de ontwikkeling van het zenuwstelsel bij fruitvliegen. Vandaag laten we je een procedure zien voor het ontleden van levende opal embryo's.
We hebben deze methoden gebruikt om naar wees receptor liganden te zoeken. We doen dit door collecties van lijnen die celoppervlakte-eiwitten overexpresseren te screenen door embryo's te kleuren met receptorfusie-eiwitten. We gebruiken deze procedure ook in het lab om embryonale fenotypes te bestuderen en genetische screenings uit te voeren.
Ik heb een deficiëntiescherm uitgevoerd voor motorische acten op geleidingsfenotypes. Dus laten we beginnen. Peter gaat je laten zien hoe het gedaan wordt.
Om te beginnen, gebruik een spatel om een plekje gistpasta op een druivenboerderij ei verzamelplaat te plaatsen die overeenkomt met elk van de vakken van een embryo verzamelkamer. Injecteer vervolgens koolstofdioxidegas in de vliegflessen om de vliegen in slaap te brengen. Breng een paar honderd vliegen rechtstreeks over in de verzamelkamer.
Bedek vervolgens de kamer met de eiverzamelplaat en druk neer Gebruik een 20 inch lange strook etiketteringstape om de kamer en plaat samen te sjouwen, beginnend vanaf het midden van de agarplaat. De tape zal overlappen op de eiverzamelplaat. Nadat de vliegen zijn ontwaakt, incubeer op kamertemperatuur in het donker gedurende twee of drie uur in horizontale positie volgend op de incubatie, tik de vliegen naar beneden en vervang de verzamelplaat.
Als er minder dan 100 embryo's aanwezig zijn op elk sector van de verwijderde plaat. Blijf twee uur collecties uitvoeren totdat er voldoende embryo's zijn verzameld. Verzamelde embryo's kunnen worden gepoold volgens de specificaties in het bijbehorende schriftelijke protocol.
Om de embryo's te rijpen, plaats een nat stukje 90 millimeter cirkelfilterpapier in de deksel van een petrischaal en plaats de verzamelplaat met de embryo's ondersteboven erop. Incubeer de plaat voor de gewenste duur en bij de gewenste temperatuur, bereid een dia voor voor embryo-stadiëring en sortering door dubbelzijdig plakband op een dia te plaatsen. Plaats vervolgens een rechthoekige plak druivenagar op de S-schuif.
De egger moet groot genoeg zijn om vijf tot tien rijen van tien tot vijftien embryo's te bevatten. Zodra de embryo's het gewenste stadium hebben bereikt, verwijder de embryo's uit de incubator. Breng de bejaarde embryo's van de verzamelplaat over naar het dubbelzijdige plakband.
Gebruik een nat penseel om de embryo's gelijkmatig over het plakband te verspreiden. Onder een GFP dissectiemicroscoop SOAR embryo's voor geschikte GFP-expressie, wat de genotype aangeeft. In dit experiment wordt genotypering uitgevoerd door embryo's te selecteren die geen expressie van de balancer curly arm, GFP, missen.
Aangezien embryo genotypering zal variëren afhankelijk van de gebruikte balancer, verwijs naar het bijbehorende schriftelijke protocol voor meer informatie over het uitvoeren van deze stap. Gebruik vervolgens een stomp dissectiepen om de embryo's te coaten door ze voorzichtig over het dubbelzijdige plakband te rollen. In stadium 16 is de darm verdeeld in drie banden.
Daarna begint de darm diagonale banden te ontwikkelen nabij de staart en vervolgens krullen en wordt het embryo duidelijker. Gebruik vervolgens de dissectiepen om elk embryo bovenop het corion of andere embryo's te rollen. Vermijd contact met het plakband, til het embryo op en breng het over naar de plak druivenagar.
Lign de gecoate embryo's op deze plak met hun dorsale kanten tegen de agar plak en achteruiteinden naar beneden. Plaats vervolgens de dia in een petrischaal met nat filterpapier en incubeer de embryo's op kamertemperatuur tot ze de gewenste leeftijd hebben bereikt Voor dissectie, bereid een dia voor voor levende dissectie door een klein rechthoekig stukje dubbelzijdig plakband te snijden. Plaats het plakband in de buurt van een uiteinde van een super frost plus dia met behulp van een wasstift.
Teken een rechthoek met de breedte van de dia en 30 tot 40 millimeter lang rond het plakband. Er moet ongeveer drie millimeter ruimte tussen de was en het plakband zijn. Breng vervolgens de embryo's van de grote plak druivenagar over naar het plakband door de dia om te draaien en voorzichtig neer te laten zakken op de uitgelijnde embryo's zodat het plakband in contact komt met ze.
De embryo's moeten worden gepositioneerd met de achterste uiteinden naar beneden. Na de overdracht zullen de embryo's onmiddellijk met de dorsale kant omhoog op de dia worden gepositioneerd. Voeg meteen een XPBS toe boven de embryo'
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een gestroomlijnd protocol voor het genereren van "fillet" preparaten van Drosophila-embryo's met specifieke genotypen. Het protocol vergemakkelijkt een efficiënte uitvoering van verschillende genetische screenings en biedt uitstekende visualisatie van structuren in late embryo's.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Genetica
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- Drosophila-embryo's worden veel gebruikt in genetische studies.
- Fillet preparaten maken een gedetailleerde onderzoek van embryonale structuren mogelijk.
- Efficiënte protocollen verbeteren de mogelijkheid om genetische screenings uit te voeren.
- Visualisatietechnieken zijn cruciaal voor het begrijpen van ontwikkelingsprocessen.
Doel van de studie
- Om een protocol te ontwikkelen voor het genereren van fillet preparaten van Drosophila-embryo's.
- Om de efficiëntie van genetische screeningsmethoden te verbeteren.
- Om de visualisatie van embryonale structuren te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Verzameling van embryo's met behulp van een vijf-vakken kamer.
- Overbrengen van embryo's naar dubbelzijdig plakband voor uitlijning.
- Gebruik van agar blokken voor het positioneren van embryo's.
- Omgekeerd plakken van het plakband om embryo's over te brengen naar dia's voor observatie.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol maakt een eenvoudige verzameling en voorbereiding van embryo's mogelijk.
- Embryo's kunnen efficiënt worden uitgelijnd voor visualisatie.
- Hoge kwaliteit beelden van embryonale structuren kunnen worden verkregen.
- De methode ondersteunt verschillende genetische screeningstoepassingen.
Conclusies
- Dit gestroomlijnde protocol verbetert de studie van Drosophila embryogenese.
- Het biedt een waardevol hulpmiddel voor onderzoekers die genetische screenings uitvoeren.
- Verbeterde visualisatietechnieken dragen bij aan een beter begrip van de ontwikkelingsbiologie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This protocol enables high-throughput phenotypic screening of Drosophila mutant collections by combining live dissection with antibody staining, supporting target validation in neurodevelopmental pathways. It reduces time and labor compared to fixed dissection methods, allowing screening of up to 10 lines per day with quantitative scoring of 4-7 mutant embryos per line. The approach enhances predictive confidence in early discovery by facilitating detection of low-penetrance phenotypes across hundreds of balanced lines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through phenotypic screening of mutant collections for neurodevelopmental targets.
- Operational Value: Supports functional target validation by linking genotype to observable axon and muscle phenotypes in live embryos.
- Translational Value: Facilitates mechanistic de-risking by allowing direct visualization of motor axon guidance and muscle organization phenotypes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized fillet preparations suitable for antibody-based readouts of neuronal and muscular structures.
- Quantitative Output: Enables scoring of up to 70 hemisegments per line at high magnification with 40X water-immersion lens for robust phenotypic quantification.
- Scalability: Streamlined workflow accommodates screening of hundreds of balanced mutant lines in genetic screens for orphan receptor ligands.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Provides a disease-relevant system for studying neurodevelopmental phenotypes with conservation to human axon guidance pathways.
- Preclinical Continuity: Supports translational biomarker alignment by enabling consistent phenotyping from discovery through validation stages.
- Risk-Adjusted Advancement: Allows identification of subtle, low-penetrance mutations that may inform target selection and de-risking decisions.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing in neurodevelopmental biology and enabling scalable screening prior to lead identification efforts.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification through direct observation of motor axon and muscle phenotypes in genetically defined embryos.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible fillet preparations with quantitative immunofluorescence readouts for compound or genetic modifier evaluation.
- Analytics: Generates quantitative phenotypic data (e.g., axon branching patterns, muscle layering) that enable comparative analysis across genetic conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work through conservation of axon guidance mechanisms and muscle development pathways relevant to human neurodevelopmental disorders.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable screening platform for neurodevelopmental target validation across multiple projects and mutant collections.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing false negatives through high-content phenotypic screening.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization of embryonic dissections across users and experimental batches.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling screening of large mutant collections in compressed timelines (e.g., 200 lines in ~20 days).
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying phenotypes with variable penetrance that might be missed in lower-throughput assays.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila embryo handling, genotyping via GFP balancer screening, and microsurgical dissection techniques.
- Dependent on instrumentation including compound microscopes with 40X water-immersion lenses, wax-coated slides, and humidified chambers for antibody incubation.
- Necessitates standardization of embryo staging (stages 14-17), dissection timing, and antibody staining protocols across users.
- Involves adaptation considerations for different balancer systems (e.g., GFP, Curly) affecting genotyping strategies.
- Practical limitations include the need for trained personnel to achieve optimal throughput (10 lines/day) and sensitivity to embryo health and staging accuracy.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
1:21
Introduction
2:14
Collection of Embryos From Fly Crosses
4:15
Staging Embryos and Sorting for GFP Expression
6:34
Drosophila Embryo Live Dissection
8:31
Embryo Fixation and Antibody Staining
12:11
Immunofluoresent Imaging of Dissected Drosophila Embryos
12:58
Conclusion
