Een Multi-parametrische Islet Perifusion System binnen een Microfluïdische Perifusion Device
January 26th, 2010
Een microfluïdische eilandje perifusion apparaat werd ontwikkeld voor de beoordeling van dynamische insuline secretie van verschillende eilandjes en gelijktijdige fluorescentie beeldvorming van calcium influx en mitochondriale potentiële veranderingen.
In deze presentatie introduceren we een op microfluidica gebaseerde ooglidperfusie-systeem voor de gelijktijdige meting van dynamische insulinesecretie, calciuminflux en veranderingen in mitochondriaal potentieel van pancreasoogjes als reactie op insulinesecretie honden. Het perfusiesysteem bestaat uit een drie-laags microfluidisch apparaat, spuitpompen en een fractiecollector insuline. Secretagogen geïnduceerde calciuminflux en mitochondriale potentialen worden geïmageed met behulp van een fluorescente microscoopopstelling.
Hallo, mijn naam is Ola, een Waller uit het laboratorium van Dr. Val Holter in de afdeling Transplantatiechirurgie aan de Universiteit van Illinois in Chicago. Hallo, ik ben Don Lee, ook uit het October's Lab. Hallo, ik ben Tricia Hart, ook uit het lab van Dr. Al Holster.
Vandaag laten we je een procedure zien voor gelijktijdige ooglidbeeldvorming met behulp van een lineair glucosegradiënt. We gebruikten deze procedure in ons laboratorium om oogje visuals en functie te bestuderen. Dus laten we beginnen.
Het microfluïdische apparaat dat voor deze procedure wordt gebruikt, is samengesteld uit drie lagen genezen PDMS die zijn gegenereerd door standaard fotolithografie. De eerste laag, gegenereerd vanuit een siliconen master, heeft de putjes van het microfluïdische apparaat die de oogjes zachtjes op hun plaats houden, 150 micrometer diep en 500 micrometer in diameter. De tweede laag heeft kanalen van 500 micrometer hoog en twee millimeter breed.
Het midden van het kanaal is uitgebreid om de stroom te verspreiden voor een betere uitwisseling van oplossing. Binnen het apparaat wordt een uitwisselingsput gemaakt door een gat van drie millimeter hoog en zeven millimeter breed in het midden van de laag te prikken. De derde laag is een dikke plaat PDMS. Om deze laag voor te bereiden, prikt u kleine gaten aan beide kanten die zich uitlijnen met de inlaat en uitlaat van het kanaal.
Op de tweede laag, zodra alle drie de lagen zijn gegenereerd, wordt de eerste laag met de putjes naar boven op een glazen plaat gebonden. De tweede laag wordt vervolgens met de kanaalafstand naar boven aan de eerste laag gebonden. Ten slotte wordt de derde laag aan de tweede laag gebonden.
Zodra de lagen zijn gebonden, is het apparaat klaar voor gebruik in experimenten. Gebruik een 10 milliliter spuit gevuld met 70% ethanol en aangesloten op de inlaatpoort van het apparaat met Tai on-slangen om het microfluïdische apparaat te steriliseren door de ethanol door de kanalen van het apparaat te laten stromen. Gebruik vervolgens dezelfde instellingsstroom om de gedeïoniseerde water te wassen om het ethanol te verwijderen.
Zodra het apparaat is gesteriliseerd, plaatst u het op een verwarmde microscoopstandaard met behulp van tigon-slangen, sluit u de spuitpompen met hoge en lage glucoseoplossingen aan op een Y-connector. Verbind vervolgens de inlaat van het microfluïdische apparaat. Verbind de uitlaat van het microfluïdische apparaat naar een fractiecollector.
Zorg ervoor dat de slangen op een hotplate van 37 graden Celsius rusten. Het is erg belangrijk om de oplossingen gedurende het hele experiment op fysiologische temperatuur te houden. Gebruik vervolgens het labview-programma om de glucosegradiënt te starten die tijdens het experiment door het microfluïdische netwerk zal worden geperfundeerd.
Deze software varieert de stroomsnelheid van twee glucoseoplossingen. Door de spuitpompen te besturen, kunnen hier verschillende glucosegradiëntprofielen worden gemaakt, lineair, klokvormig en vierkant gevormde glucosegradiëntprofielen. In vergelijking met de berekende verwachte waarden worden in dit experiment de lineaire gradiënt van twee millimolair tot 25 millimolair glucose gebruikt met een variabele stroomsnelheid van 0,01 milliliter per minuut van de twee glucoseoplossingen en een constante stroomsnelheid van 0,25 milliliter per minuut die het apparaat binnenkomt nadat de oplossingen zijn gemengd.
Zodra het juiste gradiëntprofiel is geselecteerd, test u de stabiliteit van de gradiënt. Start eerst het gradiëntsysteem. Start vervolgens de fractiecollector en verzamel perfuseer acht in één milliliter eindbuizen.
Gebruik vervolgens een glucometer om de glucoseconcentratie in elke buis te testen met behulp van Excel. Analyseer de resultaten verkregen van de glucometer. Vervolgens vervangt u de hoge glucosespuiten met een spuit die 0,5% BSA-oplossing in Krebs ringer buffer bevat. Perfuseer 50 milliliter door het apparaat met een snelheid van één milliliter per minuut.
Dit voorkomt niet-specifieke absorptie van insuline op de microkanaalwanden om nauwkeurigheid te garanderen bij het later meten van gesecreteerde insulineniveaus na perfusie met BSA. Vervang het met de hoge glucoseoplossing opnieuw. Suspendeer 25 tot 30 handgeplukte muisoogjes in een twee millimolair glucose Krebs ringer buffer bevattende calciumindicatorkleurstof fira 2:00 AM en de mitochondriale potentiaalindicatorkleurstof roumien 1 2 3, incubeer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius.
Na incubatie ontkoppelt u het apparaat van het perfusiesysteem en laadt u de oogjes voorzichtig in het microfluïdische apparaat door de punt van de pipet, die de islets bevat, in de inlaatpoort te steken en de islets langzaam uit te spuiten na het laden, verbindt u het apparaat opnieuw met het perfusiesysteem. Wees voorzichtig om geen luchtbellen te introduceren. Start vervolgens de spuitpomp om de oogjes te perfunderen met KRB met twee millimolair glucose.
Deze stap zal de overtollige kleurstof uit het medium wassen, de excitatie- en emissiefiltersets en belichtingstijden die tijdens het experiment worden gebruikt, aanwijzen. Stel vervolgens de fractiecollector in om om de minuut te verzamelen terwijl de oogjes met de lage glucoseoplossing worden geperfundeerd. Gebruik het gebied van belang of ROI-gereedschap van de eenvoudige PCI-beeldvormingssoftware om de gebieden of oogjes te definiëren die u wilt beeldvormen.
Cirkelt ook het achtergrondgebied dat zal worden afgetrokken nadat de cellen gedurende 10 minuten zijn gewassen, start de glucosegradiëntfractiecollector en start tijd-lapse beeldvorming. Schakel na 30 minuten de software en de hoge glucosespuitenpomp uit
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie presenteert een microfluïdische islet perifusie-apparaat dat is ontworpen voor de dynamische beoordeling van insulinesecretie vanuit meerdere eilandjes. Het apparaat maakt gelijktijdige fluorescentiebeeldvorming mogelijk van calciuminflux en veranderingen in mitochondriaal potentieel.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Biologie
- Endocrinologie
Achtergrond
- Dynamische insulinesecretie is cruciaal voor het begrijpen van de pancreasfunctie.
- Calciuminflux en mitochondriaal potentieel zijn sleutelindicatoren van eilandjescelactiviteit.
- Microfluïdische apparaten bieden nauwkeurige controle over experimentele omstandigheden.
- Fluorescentiebeeldvorming biedt real-time inzichten in cellulaire processen.
Doel van het onderzoek
- Om een microfluïdisch systeem te ontwikkelen voor het beoordelen van insulinesecretiedynamiek.
- Om gelijktijdige meting van calcium en mitochondriale veranderingen mogelijk te maken.
- Om het begrip van eilandjescelreacties op secretagogen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Constructie van een microfluïdisch apparaat met drie lagen.
- Gebruik van spuitpompen voor gecontroleerde perfusi.
- Implementatie van een fractiecollector voor monsterverzameling.
- Fluorescentiemicroscopie voor beeldvorming van cellulaire reacties.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle meting van dynamische insulinesecretie uit eilandjes.
- Observatie van calciuminflux als reactie op secretagogen.
- Beoordeling van veranderingen in mitochondriaal potentieel tijdens experimenten.
- Demonstratie van de effectiviteit van het microfluïdische apparaat in real-time analyse.
Conclusies
- Het microfluïdische islet perifusie-apparaat is effectief voor het bestuderen van insulinedynamiek.
- Gelijktijdige beeldvorming biedt waardevolle inzichten in de fysiologie van eilandjescellen.
- Deze aanpak kan onderzoek naar diabetes en metabole stoornissen bevorderen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This microfluidic perifusion system enables real-time, multi-parametric assessment of pancreatic islet function, supporting early-stage target validation in diabetes research. By integrating dynamic insulin secretion measurements with calcium and mitochondrial potential imaging, the platform enhances mechanistic de-risking of therapeutic candidates. The system provides quantitative, reproducible data that improves predictive confidence in lead identification and preclinical progression.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by correlating insulin secretion dynamics with calcium influx and mitochondrial responses.
- Operational Value: Supports functional target validation through simultaneous, label-free readouts of key physiological pathways.
- Predictive Value: Improves portfolio triage by providing early, multi-parameter functional readouts that reduce mechanistic ambiguity.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream screening by standardizing islet handling and perfusion conditions.
- Reproducibility: Ensures consistent glucose gradient delivery and sample collection via fractionator, enabling reliable compound evaluation.
- Scalability: Supports multiplexed islet analysis within a single device, increasing throughput for assay optimization.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical workflows by maintaining disease-relevant glucose stimulation profiles.
- Risk-Adjusted Decisions: Provides longitudinal functional data that supports go/no-go decisions in preclinical advancement.
- Biomarker Alignment: Facilitates correlation of insulin secretion with calcium and mitochondrial biomarkers for mechanistic insight.
Pipeline & Workflow Integration
The system integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical assessment, enabling continuous functional monitoring of islet responses.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by linking secretagogue exposure to real-time metabolic responses.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible islet preparations with quantifiable outputs for compound screening.
- Analytics: Generates time-resolved insulin, calcium, and mitochondrial data that enable comparative condition analysis and EC50 determination.
- Translational Research: Maintains physiological relevance through dynamic glucose gradients that mimic in vivo stimulation patterns.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for iterative testing across multiple compound series and genetic models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence through multi-parametric, real-time functional readouts that reduce false positives.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility via controlled perfusion, fractionated sampling, and automated gradient generation.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of candidates before costly in vivo studies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing functional efficacy and mechanistic insight in parallel.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device handling, fluorescent microscopy, and glucose perfusion systems.
- Depends on syringe pumps, fraction collectors, and environmental control (37°C) for physiological relevance.
- Necessitates cross-team standardization of islet preparation, dye loading, and ROI selection for consistent imaging.
- Involves adaptation considerations for different islet sources (mouse, human) and indicator dyes.
- Limited by manual islet loading and potential bubble formation, which can disrupt perfusion and imaging.
