Een Multi-parametrische Islet Perifusion System binnen een Microfluïdische Perifusion Device

In deze presentatie introduceren we een op microfluidica gebaseerde ooglidperfusie-systeem voor de gelijktijdige meting van dynamische insulinesecretie, calciuminflux en veranderingen in mitochondriaal potentieel van pancreasoogjes als reactie op insulinesecretie honden. Het perfusiesysteem bestaat uit een drie-laags microfluidisch apparaat, spuitpompen en een fractiecollector insuline. Secretagogen geïnduceerde calciuminflux en mitochondriale potentialen worden geïmageed met behulp van een fluorescente microscoopopstelling.

Hallo, mijn naam is Ola, een Waller uit het laboratorium van Dr. Val Holter in de afdeling Transplantatiechirurgie aan de Universiteit van Illinois in Chicago. Hallo, ik ben Don Lee, ook uit het October's Lab. Hallo, ik ben Tricia Hart, ook uit het lab van Dr. Al Holster.

Vandaag laten we je een procedure zien voor gelijktijdige ooglidbeeldvorming met behulp van een lineair glucosegradiënt. We gebruikten deze procedure in ons laboratorium om oogje visuals en functie te bestuderen. Dus laten we beginnen.

Het microfluïdische apparaat dat voor deze procedure wordt gebruikt, is samengesteld uit drie lagen genezen PDMS die zijn gegenereerd door standaard fotolithografie. De eerste laag, gegenereerd vanuit een siliconen master, heeft de putjes van het microfluïdische apparaat die de oogjes zachtjes op hun plaats houden, 150 micrometer diep en 500 micrometer in diameter. De tweede laag heeft kanalen van 500 micrometer hoog en twee millimeter breed.

Het midden van het kanaal is uitgebreid om de stroom te verspreiden voor een betere uitwisseling van oplossing. Binnen het apparaat wordt een uitwisselingsput gemaakt door een gat van drie millimeter hoog en zeven millimeter breed in het midden van de laag te prikken. De derde laag is een dikke plaat PDMS. Om deze laag voor te bereiden, prikt u kleine gaten aan beide kanten die zich uitlijnen met de inlaat en uitlaat van het kanaal.

Op de tweede laag, zodra alle drie de lagen zijn gegenereerd, wordt de eerste laag met de putjes naar boven op een glazen plaat gebonden. De tweede laag wordt vervolgens met de kanaalafstand naar boven aan de eerste laag gebonden. Ten slotte wordt de derde laag aan de tweede laag gebonden.

Zodra de lagen zijn gebonden, is het apparaat klaar voor gebruik in experimenten. Gebruik een 10 milliliter spuit gevuld met 70% ethanol en aangesloten op de inlaatpoort van het apparaat met Tai on-slangen om het microfluïdische apparaat te steriliseren door de ethanol door de kanalen van het apparaat te laten stromen. Gebruik vervolgens dezelfde instellingsstroom om de gedeïoniseerde water te wassen om het ethanol te verwijderen.

Zodra het apparaat is gesteriliseerd, plaatst u het op een verwarmde microscoopstandaard met behulp van tigon-slangen, sluit u de spuitpompen met hoge en lage glucoseoplossingen aan op een Y-connector. Verbind vervolgens de inlaat van het microfluïdische apparaat. Verbind de uitlaat van het microfluïdische apparaat naar een fractiecollector.

Zorg ervoor dat de slangen op een hotplate van 37 graden Celsius rusten. Het is erg belangrijk om de oplossingen gedurende het hele experiment op fysiologische temperatuur te houden. Gebruik vervolgens het labview-programma om de glucosegradiënt te starten die tijdens het experiment door het microfluïdische netwerk zal worden geperfundeerd.

Deze software varieert de stroomsnelheid van twee glucoseoplossingen. Door de spuitpompen te besturen, kunnen hier verschillende glucosegradiëntprofielen worden gemaakt, lineair, klokvormig en vierkant gevormde glucosegradiëntprofielen. In vergelijking met de berekende verwachte waarden worden in dit experiment de lineaire gradiënt van twee millimolair tot 25 millimolair glucose gebruikt met een variabele stroomsnelheid van 0,01 milliliter per minuut van de twee glucoseoplossingen en een constante stroomsnelheid van 0,25 milliliter per minuut die het apparaat binnenkomt nadat de oplossingen zijn gemengd.

Zodra het juiste gradiëntprofiel is geselecteerd, test u de stabiliteit van de gradiënt. Start eerst het gradiëntsysteem. Start vervolgens de fractiecollector en verzamel perfuseer acht in één milliliter eindbuizen.

Gebruik vervolgens een glucometer om de glucoseconcentratie in elke buis te testen met behulp van Excel. Analyseer de resultaten verkregen van de glucometer. Vervolgens vervangt u de hoge glucosespuiten met een spuit die 0,5% BSA-oplossing in Krebs ringer buffer bevat. Perfuseer 50 milliliter door het apparaat met een snelheid van één milliliter per minuut.

Dit voorkomt niet-specifieke absorptie van insuline op de microkanaalwanden om nauwkeurigheid te garanderen bij het later meten van gesecreteerde insulineniveaus na perfusie met BSA. Vervang het met de hoge glucoseoplossing opnieuw. Suspendeer 25 tot 30 handgeplukte muisoogjes in een twee millimolair glucose Krebs ringer buffer bevattende calciumindicatorkleurstof fira 2:00 AM en de mitochondriale potentiaalindicatorkleurstof roumien 1 2 3, incubeer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius.

Na incubatie ontkoppelt u het apparaat van het perfusiesysteem en laadt u de oogjes voorzichtig in het microfluïdische apparaat door de punt van de pipet, die de islets bevat, in de inlaatpoort te steken en de islets langzaam uit te spuiten na het laden, verbindt u het apparaat opnieuw met het perfusiesysteem. Wees voorzichtig om geen luchtbellen te introduceren. Start vervolgens de spuitpomp om de oogjes te perfunderen met KRB met twee millimolair glucose.

Deze stap zal de overtollige kleurstof uit het medium wassen, de excitatie- en emissiefiltersets en belichtingstijden die tijdens het experiment worden gebruikt, aanwijzen. Stel vervolgens de fractiecollector in om om de minuut te verzamelen terwijl de oogjes met de lage glucoseoplossing worden geperfundeerd. Gebruik het gebied van belang of ROI-gereedschap van de eenvoudige PCI-beeldvormingssoftware om de gebieden of oogjes te definiëren die u wilt beeldvormen.

Cirkelt ook het achtergrondgebied dat zal worden afgetrokken nadat de cellen gedurende 10 minuten zijn gewassen, start de glucosegradiëntfractiecollector en start tijd-lapse beeldvorming. Schakel na 30 minuten de software en de hoge glucosespuitenpomp uit