Lensless On-chip Beeldvorming van cellen verschaft een nieuw instrument voor High-throughput Cell-Biologie en Medische Diagnostiek

In deze video wordt het proof-of-concept getoond voor een lens-list on-chip imaging-systeem genaamd Lucas. Lucas staat voor lens list ultra wide field of view cell monitoring array platform gebaseerd op shadow imaging. In tegenstelling tot conventionele imaging-opstellingen vereist het Lucas-platform geen microscoopobjectieven of andere omvangrijke optische componenten.

Voor Lucas wordt het betreffende specimen op een microscoopglaasje geplaatst en voorzichtig afgedekt met een identiek dekglas. Met behulp van een vacuümpen wordt het monster geladen op het actieve gebied van de opto-elektronische sensorarray. Het beeldplatform registreert vervolgens de schaduwen of lensless digitale hologrammen van elke relevante cel binnen het gezichtsveld.

Geautomatiseerde digitale verwerking van deze cel-schaduwen kan het type, het aantal en de relatieve posities van cellen in de oplossing bepalen. Het gezichtsveld kan een grootte bereiken tot 18 centimeter squared met een scherptediepte van ongeveer vijf millimeter. De verkregen diffractiebeelden worden vervolgens digitaal verwerkt door een speciaal ontwikkeld beslissingsalgoritme om zowel de karakterisering als de identificatie van doelcellen of -deeltjes mogelijk te maken.

Lucas biedt een geminiaturiseerd platform dat de kosten verlaagt en de doorvoer voor beeldvormingsexperimenten aanzienlijk verhoogt, waardoor het compatibel is met geavanceerde state-of-the-art technologieën in microfluïdica en biologisch onderzoek. Hallo, ik ben van het ROM Bio and Nano Laboratory van de afdeling Electrical Engineering aan de University of California, Los Angeles, en ik ben Anthony Erlinger, ebenfalls van het Nano and Biophotonics lab. Vandaag laten we u een procedure zien voor high-throughput lensbeeldvorming van een heterogene SA-oplossing, zoals een volledig bloedmonster.

Deze procedure in ons laboratorium maakt gebruik van een nieuwe beeldvormingstechniek, die wij het lens list ultra wide field cell array monitoring platform based on shadow imaging noemen, afgekort als Lucas. Laten we beginnen. Om het proces te starten, neemt u drie milliliter volbloed en polystyreen microbeads van verschillende diameters, zoals 5, 10 en 20 µm, en laat u deze 30 minuten lang op kamertemperatuur komen.

Voeg met een serologische pipette twee milliliter RPMI 1640 classic vloeibaar medium als verdunningsmiddel toe aan een steriele polypropyleen buis van vijf milliliter. Neem na een sedimentatieperiode van 30 minuten 10 microliters van het erytrocytenmonster uit de bodem van de volbloedafnamebuis en breng dit over naar de RPMI-oplossing. Voeg een totaal volume van 20 microliters polystyreen microbeads toe aan de erytrocyten-RPMI-verdunning en homogeniseer de celoplossing door voorzichtig te pipetteren. Breng met een pincet vijf tot 15 microliters van de heterogene oplossing over op een dekglas.

Plaats een tweede identiek dekglas over de oplossing. Het monster moet gelijkmatig tussen de twee dekglazen geklemd zijn. Laad vervolgens het monster met een vacuümpen op het actieve gebied van de sensorarray voor beeldvorming.

Bereid vervolgens het waterige kleuringsreagens door 0,1% gebufferde as SNY en verdunde nieuw methylene blue (NMB)-oplossing te combineren in een volumeverhouding van twee op één; zie het bijbehorende geschreven protocol voor details over het bereiden van as SNY- en nieuw methylene blue-oplossingen. Combineer vervolgens in een polypropyleen bekerglas het ACOA-kleuringsreagens met het volbloedmonster in een volumeverhouding van één op één, onder twee minuten mengen met een magnetische roerder. Laat het geheel vervolgens nog 10 minuten incuberen bij kamertemperatuur, waarna 1,99 milliliters RPMI 1640 classic vloeibare oplossing in een vijf milliliter polypropyleen buis wordt geïncubeerd.

Breng vervolgens 10 µL van de gekleurde bloedoplossing over naar het RPMI om een volumeverhouding van 1:200 te verkrijgen. Vortex de oplossing daarna gedurende 30 seconden en pipetteer 10 tot 100 µL van de gekleurde celoplossing tussen dekglasplaatjes of in een microfluïdisch reservoir. Plaats het monster vervolgens met een vacuümpen op het actieve gebied van de sensorarray.

Het Lucas-platform maakt gebruik van een opto-elektronisch sensorarray om lensloze celhologrammen digitaal vast te leggen. Hiervoor worden charge-coupled devices of CCD's gebruikt om instelbare golflengte-illuminatie mogelijk te maken; een monochromator met een xenonlamp, samen met een standaard gefuseerde silicavezel die bestaat uit een bundel vezels en een pinhole met een diameter van ongeveer 100 micrometer, gesitueerd op ongeveer vijf tot 10 centimeter boven het sensoroppervlak, kan worden gebruikt voor de instelbare golflengte. Illuminatie biedt een flexibel platform waarbij de holografische signaturen van de cellen nauwkeurig kunnen worden afgesteld en hybride digitale signaturen kunnen worden gesynthetiseerd door meer dan één golflengte samen te voegen om de signaal-ruisverhouding en het contrast van het Lucas-beeld te verbeteren.

Voor een betere karakterisering worden monsters voor de nauwkeurigheid tussen twee dekglasplaatjes geplaatst op het actieve gebied van de sensorarray, die gelijkmatig wordt verlicht door de lichtbron. De diffractiehologrammen van elke cel of elk micro-object binnen een heterogene oplossing vallen op de sensorarray, waardoor een Lucas-beeld ontstaat. De verkregen Lucas-diffractiebeelden worden verwerkt door een speciaal ontwikkeld beslissingsalgoritme, dat gebruikmaakt van een statistische diffractiebeeldbibliotheek voor de geautomatiseerde karakterisering en identificatie van doelcellen of micro-objecten.

Deze figuur toont een conventionele afbeelding met een 40 x objectief van een heterogene oplossing van polystyreen microbeads van 5, 10 en 20 micrometer, en rode bloedcellen. De 3D-morfologie, brekingsindex en onderlinge complexiteit van deze deeltjes verschillen allemaal van elkaar.

Sommige van deze kenmerken kunnen worden onderscheiden onder een conventionele microscoop, maar over een zeer beperkt gezichtsveld van minder dan 0,5 vierkante millimeter in het Lucas-platform. Al deze microdeeltjes vertonen uniek verschillende holografische patronen, vergelijkbaar met een vingerafdruk. Daarom kunnen ze zonder enige ambiguïteit worden gekarakteriseerd op basis van hun 2D-texturen.

Lucas kan een ultra-breed gezichtsveld monitoren dat kan worden uitgebreid tot 10 tot 20 vierkante centimeter. Dit is orden van grootte groter dan standaard lensgebaseerde microscopen. Dit is een afbeelding met een 40 x objectief van een gekleurd volbloedmonster met gebruik van het Lucas-platform.

Interne kenmerken van gekleurde witte bloedcellen variëren effectief door het aanpassen van de brekingsindex en de verstrooiingseigenschappen van celkernen. Kenmerkende diffractiepatronen van elke individuele cel worden geregistreerd door de sensorarray. Dit toont een ander voordeel van het Lucas-platform als krachtig instrument voor point-of-care cytometrie en diagnostische doeleinden.

Als volledig geautomatiseerd platform voor de snelle karakterisering van cellen van belang worden Lucas-diffractiebeelden digitaal verwerkt met behulp van een speciaal ontwikkelde beslissingssoftware. In deze figuur wordt een heterogeen mengsel van rode bloedcellen en microbeads verwerkt door de interface. Het algoritme is robuust in het detecteren van regio's met een hoge dichtheid, evenals deeltjes met een lage signaal-ruisverhouding, zoals de 3 µm beads.

Hier wordt een bewerkte afbeelding in de aangepaste Lucas-interface getoond. De software maakt het mogelijk om diverse specificaties in te voeren, zoals de pixelgrootte van de sensor of de golflengte van de verlichting. Daarnaast kunnen selecties in de afbeelding worden gemaakt en kunnen celpatronen worden gedefinieerd.

Het monster wordt geteld op basis van deze gegevens en de gemarkeerde afbeelding wordt aan de gebruiker getoond. We hebben zojuist aangetoond hoe cellen kunnen worden afgebeeld en gekarakteriseerd met behulp van het high-throughput platform van Lucas. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de gedemonstreerde experimenten kunnen worden toegepast op een grote variëteit aan cellen en micropartikels.

Het maakt daarnaast ultra-breedveld- en high-throughput-celkarakterisering van een heterogene oplossing mogelijk. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.