Name: Geautomatiseerde Microfluïdische Blood Lysis Protocol voor de verrijking van circulerende cellen met een kern (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Leer een geautomatiseerd microfluïdisch protocol voor de verrijking van circulerende kernhoudende cellen uit bloed. Deze methode minimaliseert celverlies en behoudt de kwaliteit van monsters voor stroomcytometrie-analyse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Onderzoek werd ondersteund door de Wallace H. Coulter Stichting Early Career Award in Translationeel Onderzoek. Met dank aan Tim Andrews, Pediatrische Hematologie / Oncologie, voor hulp bij het bloedmonster collectie. Ook dank aan Dr Sam Wellhausen, flow cytometrie Core, James Graham Brown Cancer Center, voor hulp met het runnen van flowcytometrie monsters.

Deel 1. Microfluïdische apparaat fabricage Een silicium meester mal van de microfluïdische lysis apparaat is gemaakt met behulp van standaard fotolithografische technieken met de apparatuur in de Universiteit van Louisville cleanroom [1]. AutoCAD (Autodesk, Inc, San Rafael, CA) werd gebruikt om een ​​transparant masker te genereren (Fineline Imaging, Colorado Springs, CO) om de negatieve replica's van de kanalen te creëren. De microfluïdische lysis apparaat werd vervaardigd uit het silicium meester mal met behulp van zachte lithografische technieken met de elastomeer poly (dimethylsiloxaan) (PDMS, Dow Corning, Midland, MI). Het elastomeer met de gerepliceerde kanalen werd vrijgegeven, en het kanaal toegang gaten werden geponst met een 20-gauge naald (kleine onderdelen, Miramar, FL.). De PDMS wafer was onomkeerbaar gebonden aan een glasplaatje met behulp van zuurstof plasma en getest voor experimenten. Deel 2. Protocol voor het uitvoeren van lysis apparaat Na de microfluïdische apparaat is gefabriceerd en getest, experimenten met erytrocyten lysis zijn klaar om te beginnen. Het volgende hoofdstuk beschrijft de protocol voor de microfluïdische apparaat. 2.1 Monsterneming <ol><li> Verzamel vier milliliter bloed uit mediaan cubitaal ader, op de voorste onderarm ader van de patiënt met heparine als antistollingsmiddel in twee 2 ml groene top vaccutainers. </li><li> Gooi eerste 2 ml buis als het verdreven rijpe endotheelcellen (false positives) bevat. </li><li> Resuspendeer de tweede buis te heparine mengen met het bloed door het draaien op en neer, op te slaan onmiddellijk op ijs. </li><li> Breng 1 ml van het bloed naar een 1,5 ml Eppendorf buis. Onmiddellijk verwerken van het bloedmonster (binnen een uur van de collectie). </li></ol> 2.2 Prime microfluïdische apparaat met PBS <ol><li> Verkrijgen van een microfluïdische apparaat gebonden aan glas. Press-fit toegang buis (Small Parts, Miramar, FL) van iets grotere diameter in de inlaten en uitlaat (figuur 1). </li><li> Bevestig een 30-gauge naald (kleine onderdelen, Miramar, FL) om de slang op elk van de inhammen, die de macro naar micro-interface. </li><li> Vul een 1 ml spuit met 1X PBS en zorg ervoor om zich te ontdoen van de bubbels te krijgen door flicking de naald van de spuit. Sluit de PBS-loaded 1 ml spuit met inlaat 1 op de microfluïdische apparaat. Duw de spuit met de 1X PBS voorzichtig met de hand tot de oplossing stroomt uit inlaat 2, en dan onmiddellijk inlaat 2 klem met een standaard kantoor bindmiddel clip </li><li> Ga door het indrukken van de 1X PBS tot vloeistof bereikt de uitlaatpoort van de microfluidics apparaat. Zodra de oplossing stroomt uit het stopcontact, klem de afvoer buis met een ander bindmiddel clip. </li><li> Ga door het indrukken van de 1 ml spuit totdat de 1X PBS stroomt uit inlaat 3, en klem de inlaat 3 poort met een ander kantoor bindmiddel clip. Het microfluidics apparaat is nu volledig gevuld. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Schema van het apparaat met inlaten voor respectievelijke oplossingen en stopcontact. 2.3 Voorbereiding van de spuit pompen en oplossing <ol><li> Het ijken van de pompen als volgt te werk: <ol class="lalpha"><li> Voor de grote Harvard injectiepomp (Harvard, PHD 22/2000 Part # 702000): Stel de diameter configuratie naar 22,5 mm, debiet 600 pl / min. </li><li> Voor de kleine Harvard spuit pomp (Harvard, Pico Plus Part # 702213): de diameter configuratie ingesteld op 4,61 mm, debiet 20 pl / min. </li></ol></li><li> Vul een 30 ml spuit met steriel gedemineraliseerd water. Dit kan gedaan worden door de oplossing direct uit de 50 ml conische buis. (Label van de spuit) </li><li> Vul een tweede 30 ml spuit met 2X fosfaat-gebufferde-zoutoplossing (PBS), 2% paraformaldehyde (PFA) met behulp van de procedure die in stap 9. (Label van de spuit) </li><li> Vul een 1 ml spuit met 1X PBS van de fracties die in de 15 ml conische buizen, met behulp van de procedure die in stap 9. </li><li> Sluit de 30 ml gedeïoniseerd water spuit inlaat 2 en de 30 ml 2X PBS spuit op de inlaat-3 (zorg ervoor dat u don t val luchtbellen in de slang of microfluidics apparaat). Verwijder de klem van inhammen 2 en 3 en de uitlaat slang. Sluit de 1X PBS 1 ml spuit in inlaat 1. Voorkomen dat er luchtbellen door het vullen van de naald met vloeistof, het aansluiten van de spuit, en flicking de injectienaald om zich te ontdoen van de bubbels. </li></ol> 2.4 erytrocyten lysis <ol><li> Zet alle van de spuiten op de juiste Harvard pompen zoals hieronder beschreven: <ol class="lalpha"><li> Samen te stellen van de twee 30 ml spuiten (een met steriele, gedeïoniseerd water en de andere met 2X PBS, 2% PFA) op het grote Harvard injectiepomp. </li><li> Stel de 1 ml spuit (met 1X PBS) op de kleine Harvard injectiepomp. </li><li> Plaats de uitlaat slang in een afvalbak (50 ml conische buis die is voorzien waste). </li></ol></li><li> Zet de grote Harvard spuitpomp (met de 30 ml spuiten) en laat het uit te voeren gedurende een minuut. (Zorg ervoor dat er geen bubbels en geen lekkage in het apparaat of in de slang). </li><li> Zet de kleine Harvard spuitpomp en laat het uit te voeren voor een extra minuut. (Zorg ervoor dat er geen bubbels en geen lekkage in het apparaat of in de slang). Stop de pompen. Het microfluidics apparaat is nu klaar om gebruikt te worden. </li><li> Verwijder de 1 ml spuit met 1X PBS van de kleine Harvard injectiepomp. </li><li> Na het verkrijgen van een bloedmonster, vul de 1 ml spuit met 0,05 ml van de steriele 1X PBS zonder trapping het even welke bellen. Vervolgens vult u de spuit met 0,5 ml bloed verkregen uit de Eppendorf tube. (De 1 ml spuit bevat nu een uiteindelijk volume van 0,55 ml van het bloed en 1X PBS-buffer.) Opmerking: Houd de spuit verticaal tijdens het vullen om te voorkomen dat het mengen van de 0,05 ml PBS met het bloed. </li><li> Sluit de spuit met het bloed naar een inlaat en zorgvuldig monteren van de spuit (vermijd duwen het bloed door de slang in het apparaat) op de kleine Harvard spuit pomp (de spuit verticaal is gemonteerd in de pomp). </li><li> Haal de uitlaat slang van het afval buis en zet een schone centrifugebuis van 50 ml op zijn plaats en zet hem op een emmer met ijs. </li><li> Eerste schakelaar op het grote Harvard spuitpomp en laat het uit te voeren gedurende 1 minuut. Beginnen met het verzamelen van het monster uit het stopcontact in de centrifugebuis van 50 ml. </li><li> Schakelaar op de kleine Harvard injectiepomp. </li><li> Zodra het bloedmonster in de 1 ml spuit volledig reisde door het apparaat, stop beide pompen. Dit duurt ongeveer 20 minuten. </li><li> Centrifugeer de verzamelde monster gedurende 5 minuten bij 350 xg bij kamertemperatuur met de rem af. </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof door het plaatsen van pipetpunt aan de andere kant van de witte pellet. Verwijder zoveel supernatant mogelijk, vooral rode bloedcellen puin, zonder de witte pellet. </li><li> Resuspendeer het monster in 1 ml van flow buffer (1X PBS, 1% BSA [bovine serum albumine], 2% PFA) door en neer te pipetteren. Overdracht monster tot een 1,5 ml Eppendorf buis. </li><li> Microcentrifuge de verzamelde monster gedurende 5 minuten bij 4 xg bij kamertemperatuur. Gebruik dezelfde nauwkeurigheid als voorheen aan de supernatant te verwijderen. </li><li> Resuspendeer het monster in 1 ml van de stroming buffer door vortexen. </li></ol> 2.5 Voorbereiding voor flowcytometrische analyse <ol><li> Voor sample analyse met behulp van flowcytometrie, voeg 100 ul van het monster aan een flow cytometrie buis. </li><li> Om de 100 pi van het monster toe te voegen aangegeven antilichaam (let op de juiste concentratie). </li><li> Laat monster gedurende 30 minuten incuberen bij 40 C. </li><li> Was twee keer met stroom buffer voorafgaand aan de flowcytometrie. Was de stap omvat het toevoegen van 250 ul van de stroming buffer, vortexen, centrifugeren gedurende 5 minuten bij 350 xg, en het verwijderen van supernatant met een vloeistof draai van flowcytometrie buis. </li><li> Resuspendeer de pellet in 250 ui van flow buffer. Monster is klaar voor analyse door flowcytometrie. </li></ol> Representatieve resultaten Volbloed is uitgevoerd door de microfluïdische lysis apparaat en post-processing protocol, bevrijden van erytrocyten en het verrijken van circulerende cellen met een kern (CNCs). Ideaal resultaten zullen opleveren een schone flow cytometrie scatterplot met aparte CNC-populaties. Hieronder weergegeven in de figuren 2 en 3 zijn spreidingsdiagram vergelijkingen van een volbloed monster zonder erytrocyten lysis en met erythrocyt lysis door de microfluïdische protocol met bijlen als voorwaartse verstrooiing (FSC) versus kant verstrooiing (SSC) licht. Het kan worden gezien dat de microfluïdische verrijking protocol is nodig om een ​​schone flow cytometrie scatterplot te verkrijgen. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Flowcytometrie spreidingsdiagram van volbloedmonster zonder erytrocyten lysis met FSC en SSC assen. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Flowcytometrie spreidingsdiagram van circulerende cellen met een kern met microfluïdische erythrocyt lysis gelabeld door populaties met een FSC en SSC assen. Regio 1 (rood) staat voor lymfocyten, Regio 2 (groen) staat voor monocyten, Regio 3 (blauw) staat voor granulocyten en regio 4 (paars) moet nog worden gekarakteriseerd. Verwijdering van de rode bloedcellen puin met een pipet in het protocol is ook belangrijk wanneer dat nodig is. Hieronder in figuur 4 is een scatterplot met een overschot van de rode bloedcellen puin. Hoewel niet vertroebelt de scatterplot als in figuur 2, moet een rekening voor de extra gebeurtenissen te wijten aan erythrocyten afval tijdens de data-analyse. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Flowcytometrie scatterplot beeltenis van rode bloedcellen puin, gezien als een clustervan de gebeurtenissen in regio 5 (cyaan). Kleuring cellen voor bepaalde antilichamen fenotype markers zal genereren ook kenmerkende resultaten. In de volgende figuren zijn antilichamen fenotype vlekken voor 3 verschillende leukocyten populaties: lymfocyten, monocyten en granulocyten. Figuur 5 toont lymfocytenpopulaties geplot met bijlen CD3 en CD4. Monocyten en granulocyten worden getoond in de figuren 6-7 met bijlen als FSC-versus CD14 en CD66b, respectievelijk. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig5.jpg" alt="Figuur 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 5"> Figuur 5. Flowcytometrie scatterplot beeltenis van lymfocyten met CD3 en CD4 assen. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig6.jpg" alt="Figuur 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 6"> Figuur 6. Flowcytometrie scatterplot beeltenis van monocyten met FSC-en CD14-assen. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig7.jpg" alt="Figuur 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 7"> Figuur 7. Flowcytometrie scatterplot beeltenis van granulocyten met FSC-en CD66b assen.

<ol><li>White, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+application+of+microfluidic+leukocyte+enrichment+protocol+in+mild+phenotype+sickle+cell+disease+%28SCD%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Clinical application of microfluidic leukocyte enrichment protocol in mild phenotype sickle cell disease (SCD.</a> Biomedical Microdevices. 11 (2), 477-483 (2009).</li>
<li>Sethu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+Flow+Microfluidic+Device+for+Rapid+Erythrocyte+Lysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Continuous Flow Microfluidic Device for Rapid Erythrocyte Lysis.</a> Anal. Chem. 76 (21), 6247-6253 (2004).</li>
</ol>

Een geautomatiseerde microfluïdische bloed lysis protocol is gemeld. Binnen het protocol zijn kritische stappen vermeldenswaard. In paragraaf P.2.1, is het belangrijk om verwijder de eerste bloed flacon verzameld als het monster verjaagd mature endotheelcellen als false positives. Zorg er ook voor om het bloedmonster draaien binnen een uur van de collectie. Het vullen van de microfluïdische apparaat in paragraaf P.2.2, is het belangrijk om in eerste instantie af van de belletjes. Bovendien moet men voorkomen dat er luch...

geautomatiseerde microfluïdische blood lysis protocol voor de verrijking van circulerende cellen met een kern

Automated Microfluidic Blood Lysis Protocol for Enrichment of Circulating Nucleated Cells

In dit rapport het protocol voor een geautomatiseerde microfluïdische bloed lysis apparaat is gedetailleerd. Circulerende cellen met een kern (CNCs), waaronder leukocyten en endotheelcellen, bieden een ideaal platform voor een bijgewerkte status op het immuunsysteem conditie van een individu. De microfluïdische-protocol zorgt voor verrijking van CNCs zonder selectieve celverlies en monstervoorbereiding variabiliteit te wijten aan de gebruiker-gemedieerde stappen. Kortom, het protocol bevat apparaat fabricage, monsterneming, het apparaat instellen en het uitvoeren van bloed door de microfluïdische kamer. Binnen het apparaat vol bloed wordt snel vermengd met gedemineraliseerd water voor ongeveer 10 seconden in een 50 micron x 150 micron microfluïdische kanaal. In deze tijdspanne erytrocyten zijn te wijten aan hypotone voorwaarden gelyseerd. Visgraat-structuren op de bodem van het kanaal zorgen voor de grondige mengen en blootstelling van cellen aan een constante omgeving. Overige cellen worden teruggestuurd naar isotone omstandigheden bij de uitgang van het apparaat, bevestigd met 2% paraformaldehyde, gecentrifugeerd tot erythrocyten puin te scheiden van CNCs, en gesuspendeerd in flow buffer voor kleuring en analyse door flowcytometrie. De resultaten tonen schoon flowcytometrie puntgrafieken met opgeslagen CNC-populaties. Betekenis van dit apparaat en protocol komt in de studie en begrip van de ziekte pathogenese door de analyse van CNC-populaties. Vandaar dat automatisering, effectiviteit, en de eenvoud van de microfluïdische protocol aangetoond.

Een geautomatiseerde microfluïdische apparaat werd ontwikkeld voor het doen circuleren kernhoudende cel verrijking uit perifeer bloed via erythrocyten lysis dat de isolatie van hoge kwaliteit staal zorgt zonder cel verlies.

Geautomatiseerde Microfluïdische Blood Lysis Protocol voor de verrijking van circulerende cellen met een kern

In dit rapport wordt het protocol voor een geautomatiseerd microfluïdisch apparaat voor bloedlyse gedetailleerd. Circulerende kernhoudende cellen (CNCs), waaronder leukocyten en ...

Om circulerende kernhoudende cellen uit bloed te verrijken. Het microfluidische apparaat wordt eerst geprimd met één XPBS om luchtbellen te verwijderen; vervolgens worden gedeïoniseerd water en 2%paraldehyde in twee XPBS via spuitpompen door het apparaat geleid voorafgaand aan het laden van de bloedmonsters. Het bloed wordt vervolgens via het microfluidische apparaat verwerkt en opgevangen; de nabewerking van het monster omvat centrifugatie en het verwijderen van het supernatant.Tot slot wordt het monster geanalyseerd via flowcytometrie om fax-plots te genereren. Hallo, ik ben William White van het laboratorium Microscale Biotechnology van de afdeling Bioengineering aan de University of Wool. Vandaag laten we u een procedure zien voor de verrijking van circulerende kerncellen door lysis van volbloed via microfluidica.Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om ontsteking bij diverse ziekteprocessen te bestuderen, om zo verrijking van leukocyten en andere circulerende kernhoudende cellen te waarborgen zonder verlies of activatie. Laten we beginnen. Om deze procedure te starten, sluit u toegangsslangen aan met een diameter die iets groter is dan de toegangsgaten van het kanaal in de in- en uitlaatopeningen.Bevestig vervolgens een injectienaald van 30 gauge aan de slang van elk van de inlaatopeningen om de interface van macro naar micro te realiseren. Vul daarna een spuit van één milliliter met 1x PBS en zorg ervoor dat alle luchtbellen zijn verwijderd. Verbind de spuit met inlaat één en druk de spuit voorzichtig met de hand in totdat er 1x PBS uit inlaat twee stroomt.Klem vervolgens onmiddellijk inlaat twee af met een klemmetje. Blijf de spuit indrukken totdat de XPBS-oplossing de uitlaatpoort van het microfluïdische apparaat bereikt. Zodra de oplossing uit de uitlaat stroomt, klemt u de uitlaatslang af met een ander klemmetje.Blijf de spuit van 1 mL verder indrukken totdat er 1x PBS uit inlaat drie stroomt en klem de poort van inlaat drie af met een derde kantoorklem. Het microfluidische apparaat is nu volledig geprimed. Begin met het kalibreren van de spuitpompen met de grote Harvard-spuitpomp, waarbij de diameterconfiguratie op 22,5 mm wordt ingesteld en de stroomsnelheid op 600 µL per minuut.Voor de kleine Harvard spuitpomp. Stel de diameterconfiguratie in op 4,61 millimeter en de stroomsnelheid op 20 µL per minuut. Vul vervolgens één spuit van 30 milliliter met gedeïoniseerd water door een oplossing direct uit de conische buis van 50 milliliter op te zuigen.Vergeet niet de spuit te labelen; vul een andere spuit van 30 milliliter met twee XPBS 2%paraformaldehydeloplossing. Trek dit opnieuw direct uit een conische buis en label de spuit. Verbind nu de spuit met water met inlaat twee en de spuit met 2%paraformaldehyde in twee XPBS met inlaat drie, waarbij u ervoor zorgt dat er geen luchtbellen in de slangjes of in het microfluïdische apparaat vastzitten.Verwijder vervolgens de klemmen van inlaat twee, inlaat drie en de uitlaatslang terwijl alle drie de spuiten zijn aangesloten. Plaats de twee grote spuiten op de grote Harvard spuitenpomp en plaats de spuit van 1 mL op de kleine Harvard spuitenpomp. Plaats de uitlaatslang in een conische afvalopvangkolf van 50 mL.Zet nu de grote Harvard-spuitenpomp aan waarin de spuiten van 30 milliliter zijn geplaatst en laat deze één minuut lopen. Controleer of er geen luchtbellen aanwezig zijn en of er geen lekkages optreden in het apparaat of in de slangen. Zet vervolgens de kleine Harvard-spuitenpomp aan en laat deze hier ook een minuut lang lopen.Controleer op bellen en lekkages. Stop de pompen na twee minuten. Aangezien het microfluïdische apparaat nu klaar is voor gebruik met bloedmonsters, werden de te analyseren bloedmonsters verzameld zoals beschreven in het bijbehorende schriftelijke protocol en worden deze binnen één uur na afname gebruikt.De eerste buis met afgenomen bloed wordt weggegooid om fout-positieve resultaten te voorkomen. Verwijder de spuit van 1 mL uit de kleine Harvard-spuitenpomp en injecteer vervolgens XPBS vanuit de spuit van 1 mL om de spuitnaald te vullen. Om de introductie van luchtbellen te voorkomen, wordt een spuit van 1 mL gevuld met 50 µL XPBS zonder luchtbellen in te sluiten.Vul vervolgens de spuit met 0,5 milliliters bloed. Houd de spuit tijdens het vullen verticaal om menging van de PBS met het bloed te voorkomen. Sluit daarna de spuit met het bloed weer aan op inlaat één.Veeg eventueel overtollig vocht weg en monteer de spuit verticaal op de kleine Harvard-spuitpomp. Wees voorzichtig om het bloed niet door de slang in het apparaat te duwen. Verwijder de uitlaatslang uit de afvoerslang en plaats deze in een schone centrifugebuis van 50 milliliter in een ijsbad.Start nu de run door eerst de grote Harvard-spuitenpomp in te schakelen en deze één minuut te laten lopen. Schakel daarna de kleine Harvard-spuitenpomp in. Het monster zal via de uitlaatslang in de centrifugebuis van 50 milliliter worden opgevangen.Laat het bloedmonster in de spuit van één milliliter volledig door het apparaat stromen, wat ongeveer 20 minuten duurt. Stop daarna beide pompen. Nu de run voltooid is, centrifugeert u het verzamelde monster gedurende vijf minuten bij 350 ×g bij kamertemperatuur zonder rem.Verwijder het supernatant door de pipetpunt aan de tegenovergestelde zijde van de witte pellet te plaatsen. Verwijder zoveel mogelijk supernatant, in het bijzonder rode celresten, zonder de witte pellet te verstoren. Resuspendeer het monster door middel van pipetteren in één milliliter flowbuffer die 1%BSA en 2%paraformaldehyde in één XPBS bevat.Centrifuge het verzamelde monster gedurende vijf minuten bij 4×g in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Verwijder bij kamertemperatuur zorgvuldig het supernatant, zoals in de vorige centrifugatiestap is gedaan. Voeg ten slotte één milliliter flowbuffer toe en vortex om het monster opnieuw te suspenderen, waarna het monster kan worden geanalyseerd via flowcytometrie.Nu tonen we enkele representatieve resultaten in de vorm van fax-plots van een bloedmonster dat is verrijkt door het microfluïdische apparaat, waarbij de analyse is uitgevoerd met flowcytometrie. Het belang van verrijking door lysis is te zien aan een fax-plot waarin rode bloedcellen een wolk vormen. Het scatterplot dat is geproduceerd door het microfluïdische verrijkingsprotocol is een schoon scatterplot met gedefinieerde populaties van genucleerde cellen die in de circulatie zijn aangetroffen.Het rode gebied stelt lymfocyten voor, groen stelt monocyten voor, blauw stelt granulocyten voor, en het paarse gebied moet nog worden gekarakteriseerd. Wanneer rode celresten in het protocol niet worden verwijderd, ontstaat er een cluster van events in de fax-plot, te zien in het cyaanblauwe gebied. Celpopulaties kunnen worden gevisualiseerd in afzonderlijke fax-plots.Lymfocyten werden aangetoond met CD3 en CD4. Monocyten werden aangetoond met CD14 en granulocyten met CD66p. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u een bloedmonster voorbereidt en verwerkt met het microfluïdische bloedlyse-apparaat. Bij deze procedure is het belangrijk om het bloedmonster direct te verwerken, zodat de PBS zich niet met het bloed mengt voordat het het apparaat binnenkomt, en om te voorkomen dat er luchtbellen in de kanalen van het apparaat terechtkomen.Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

automated-microfluidic-blood-lysis-protocol-for-enrichment

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Lentivirale-gemedieerde Knockdown Tijdens het Ex Vivo Erytropoëse van humane hematopoietische stamcellen

Bloed leukocyten en bloedplaatjes kunnen worden gebruikt als een marker van algemene bio-energetische gezondheid van een individu en dus de potentie om pathologische processen en het effect van behandeling te controleren. Hier beschrijven we een werkwijze voor het isoleren en meten mitochondriale functie en de oxidatieve uitbarsting in deze cellen.

Bio-energetica en de oxidatieve Burst: Protocollen voor de Isolatie en evaluatie van menselijke leukocyten en bloedplaatjes

Dit protocol beschrijft de snelle niet-enzymatische dissociatie van verse menselijke weefselfragmenten voor kwalitatieve en kwantitatieve beoordeling van CD45+ cellen (lymfocyten/leukocyten) aanwezig in verschillende normale en kwaadaardige menselijke weefsels. Bovendien kan het supernatant verkregen uit het primaire weefsel homogenaat worden verzameld en bewaard voor verdere analyse of experimenten.

Een eenvoudige en snelle protocol bij niet-enzymatisch distantiëren Verse menselijke weefsels voor de Analyse van Infiltrating Lymfocyten

Het doel van dit protocol is om pathogeen-specifieke klinische graad T-cellen te produceren met behulp van een tafelblad, geautomatiseerde, tweede generatie celverrijkingsapparaat dat een gesloten cytokine-opvangsysteem bevat en geen toegewijd personeel of gebruik van een GMP-faciliteit vereist. De gegenereerde cytomegalovirus pp65-specifieke T-cellen kunnen direct aan patiënten worden toegediend.

Geautomatiseerde Cel Verrijking van Cytomegalovirus-specifieke T-cellen voor klinische toepassingen met het cytokine-beeldverwerkingssysteem

Neutrofielen spelen niet alleen een belangrijke rol bij de verdediging van het gastheerlichaam tegen binnendringende micro-organismen, maar zijn ook betrokken bij de immuunbewaking van tumorcellen. Hier beschrijven we technieken met betrekking tot de isolatie van neutrofielen met anti-tumoreigenschappen en methoden voor het monitoren van anti-tumor neutrofielen functie in vitro en in vivo.

Isolatie en karakterisering van neutrofielen met Anti-Tumor Properties

Dit protocol is te herstellen en zeldzame doelcellen een mengsel met de doelsoort achtergrond cellen voorbereiden moleculaire genetische karakterisering op het niveau van één cel. DNA kwaliteit is gelijk aan niet-behandelde afzonderlijke cellen en zorgt voor eencellige toepassing (beide screening gebaseerd en gerichte analyse).

Target cel pre verrijking en hele genoom versterking voor eencellige Downstream karakterisering

In dit onderzoek tonen we een label-vrije neutrofiele scheiding methode van klinische airway afscheidingen met kringloopsysteem bewerking van spiraal inertial microfluidics. De voorgestelde methode zou het uitbreiden van de klinische in vitro tests voor verschillende aandoeningen van de luchtwegen.

Label-vrije neutrofiele verrijking van patiënt-afgeleide Airway secretie met behulp van Closed-loop Inertial Microfluidics

De karakterisering van circulerende tumorcellen (Ctc's) is een populair onderwerp in translationeel onderzoek. Dit protocol beschrijft een semiautomatische immunofluorescentie (IF)-test voor PD-L1-karakterisering en inventarisatie van Ctc's in niet-kleincellige longkanker (NSCLC)-patiënt monsters.

Semi-automatische PD-L1 karakterisering en opsomming van circulerende tumor cellen van niet-kleincellige longkanker patiënten door immunofluorescentie

Dit protocol beschrijft een high-throughput automatisering-compatibele methode om menselijke perifere bloed mononucleaire cellen te isoleren voor biobanking en andere doeleinden.

Het isoleren van Menselijke Perifere Bloed Mononucleaire Cellen van Buffy Coats via de Scheiding van de Hoge Doorvoer Immunomagnetische Parel

Circulerende tumorcellen (CTC's) zijn van cruciaal belang voor de studie van kankerprogressie en metastase. Dit artikel presenteert een high-throughput, geïntegreerd protocol voor CTC-verrijking en single-CTC-sequencing, waardoor de opname-efficiëntie en CTC-zuiverheid worden verbeterd en tegelijkertijd de contaminatie- en sequencingkosten worden verlaagd, waardoor precisie-oncologisch onderzoek en klinische toepassingen worden bevorderd.

Op microfluïdica gebaseerde high-throughput circulerende tumorcelsortering en single-cell sequencing-technologie

Neutrofielen met lage dichtheid (LDN) nemen aanzienlijk toe bij verschillende ziekten. LDN worden meestal geïsoleerd door middel van celsortering. We presenteren een praktische methode om zuiver en levensvatbaar LDN te verkrijgen. Na dichtheidsgradiëntcentrifugatie van perifeer bloed worden cellen geïncubeerd met magnetische microbeads en vervolgens wordt LDN gescheiden door magnetische kolommen.

Snelle magnetische microbead-methode voor efficiënte zuivering van neutrofielen met lage dichtheid

Leer een geautomatiseerd microfluïdisch protocol voor de verrijking van circulerende kernhoudende cellen uit bloed. Deze methode minimaliseert celverlies en behoudt de kwaliteit van monsters voor stroomcytometrie-analyse.

Geautomatiseerde Microfluïdische Blood Lysis Protocol voor de verrijking van circulerende cellen met een kern

Meer video's verkennen