Geautomatiseerde Microfluïdische Blood Lysis Protocol voor de verrijking van circulerende cellen met een kern

Om circulerende kernhoudende cellen uit bloed te verrijken. Het microfluidische apparaat wordt eerst geprimd met één XPBS om luchtbellen te verwijderen; vervolgens worden gedeïoniseerd water en 2%paraldehyde in twee XPBS via spuitpompen door het apparaat geleid voorafgaand aan het laden van de bloedmonsters. Het bloed wordt vervolgens via het microfluidische apparaat verwerkt en opgevangen; de nabewerking van het monster omvat centrifugatie en het verwijderen van het supernatant.

Tot slot wordt het monster geanalyseerd via flowcytometrie om fax-plots te genereren. Hallo, ik ben William White van het laboratorium Microscale Biotechnology van de afdeling Bioengineering aan de University of Wool. Vandaag laten we u een procedure zien voor de verrijking van circulerende kerncellen door lysis van volbloed via microfluidica.

Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om ontsteking bij diverse ziekteprocessen te bestuderen, om zo verrijking van leukocyten en andere circulerende kernhoudende cellen te waarborgen zonder verlies of activatie. Laten we beginnen. Om deze procedure te starten, sluit u toegangsslangen aan met een diameter die iets groter is dan de toegangsgaten van het kanaal in de in- en uitlaatopeningen.

Bevestig vervolgens een injectienaald van 30 gauge aan de slang van elk van de inlaatopeningen om de interface van macro naar micro te realiseren. Vul daarna een spuit van één milliliter met 1x PBS en zorg ervoor dat alle luchtbellen zijn verwijderd. Verbind de spuit met inlaat één en druk de spuit voorzichtig met de hand in totdat er 1x PBS uit inlaat twee stroomt.

Klem vervolgens onmiddellijk inlaat twee af met een klemmetje. Blijf de spuit indrukken totdat de XPBS-oplossing de uitlaatpoort van het microfluïdische apparaat bereikt. Zodra de oplossing uit de uitlaat stroomt, klemt u de uitlaatslang af met een ander klemmetje.

Blijf de spuit van 1 mL verder indrukken totdat er 1x PBS uit inlaat drie stroomt en klem de poort van inlaat drie af met een derde kantoorklem. Het microfluidische apparaat is nu volledig geprimed. Begin met het kalibreren van de spuitpompen met de grote Harvard-spuitpomp, waarbij de diameterconfiguratie op 22,5 mm wordt ingesteld en de stroomsnelheid op 600 µL per minuut.

Voor de kleine Harvard spuitpomp. Stel de diameterconfiguratie in op 4,61 millimeter en de stroomsnelheid op 20 µL per minuut. Vul vervolgens één spuit van 30 milliliter met gedeïoniseerd water door een oplossing direct uit de conische buis van 50 milliliter op te zuigen.

Vergeet niet de spuit te labelen; vul een andere spuit van 30 milliliter met twee XPBS 2%paraformaldehydeloplossing. Trek dit opnieuw direct uit een conische buis en label de spuit. Verbind nu de spuit met water met inlaat twee en de spuit met 2%paraformaldehyde in twee XPBS met inlaat drie, waarbij u ervoor zorgt dat er geen luchtbellen in de slangjes of in het microfluïdische apparaat vastzitten.

Verwijder vervolgens de klemmen van inlaat twee, inlaat drie en de uitlaatslang terwijl alle drie de spuiten zijn aangesloten. Plaats de twee grote spuiten op de grote Harvard spuitenpomp en plaats de spuit van 1 mL op de kleine Harvard spuitenpomp. Plaats de uitlaatslang in een conische afvalopvangkolf van 50 mL.

Zet nu de grote Harvard-spuitenpomp aan waarin de spuiten van 30 milliliter zijn geplaatst en laat deze één minuut lopen. Controleer of er geen luchtbellen aanwezig zijn en of er geen lekkages optreden in het apparaat of in de slangen. Zet vervolgens de kleine Harvard-spuitenpomp aan en laat deze hier ook een minuut lang lopen.

Controleer op bellen en lekkages. Stop de pompen na twee minuten. Aangezien het microfluïdische apparaat nu klaar is voor gebruik met bloedmonsters, werden de te analyseren bloedmonsters verzameld zoals beschreven in het bijbehorende schriftelijke protocol en worden deze binnen één uur na afname gebruikt.

De eerste buis met afgenomen bloed wordt weggegooid om fout-positieve resultaten te voorkomen. Verwijder de spuit van 1 mL uit de kleine Harvard-spuitenpomp en injecteer vervolgens XPBS vanuit de spuit van 1 mL om de spuitnaald te vullen. Om de introductie van luchtbellen te voorkomen, wordt een spuit van 1 mL gevuld met 50 µL XPBS zonder luchtbellen in te sluiten.

Vul vervolgens de spuit met 0,5 milliliters bloed. Houd de spuit tijdens het vullen verticaal om menging van de PBS met het bloed te voorkomen. Sluit daarna de spuit met het bloed weer aan op inlaat één.

Veeg eventueel overtollig vocht weg en monteer de spuit verticaal op de kleine Harvard-spuitpomp. Wees voorzichtig om het bloed niet door de slang in het apparaat te duwen. Verwijder de uitlaatslang uit de afvoerslang en plaats deze in een schone centrifugebuis van 50 milliliter in een ijsbad.

Start nu de run door eerst de grote Harvard-spuitenpomp in te schakelen en deze één minuut te laten lopen. Schakel daarna de kleine Harvard-spuitenpomp in. Het monster zal via de uitlaatslang in de centrifugebuis van 50 milliliter worden opgevangen.

Laat het bloedmonster in de spuit van één milliliter volledig door het apparaat stromen, wat ongeveer 20 minuten duurt. Stop daarna beide pompen. Nu de run voltooid is, centrifugeert u het verzamelde monster gedurende vijf minuten bij 350 ×g bij kamertemperatuur zonder rem.

Verwijder het supernatant door de pipetpunt aan de tegenovergestelde zijde van de witte pellet te plaatsen. Verwijder zoveel mogelijk supernatant, in het bijzonder rode celresten, zonder de witte pellet te verstoren. Resuspendeer het monster door middel van pipetteren in één milliliter flowbuffer die 1%BSA en 2%paraformaldehyde in één XPBS bevat.

Centrifuge het verzamelde monster gedurende vijf minuten bij 4×g in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Verwijder bij kamertemperatuur zorgvuldig het supernatant, zoals in de vorige centrifugatiestap is gedaan. Voeg ten slotte één milliliter flowbuffer toe en vortex om het monster opnieuw te suspenderen, waarna het monster kan worden geanalyseerd via flowcytometrie.

Nu tonen we enkele representatieve resultaten in de vorm van fax-plots van een bloedmonster dat is verrijkt door het microfluïdische apparaat, waarbij de analyse is uitgevoerd met flowcytometrie. Het belang van verrijking door lysis is te zien aan een fax-plot waarin rode bloedcellen een wolk vormen. Het scatterplot dat is geproduceerd door het microfluïdische verrijkingsprotocol is een schoon scatterplot met gedefinieerde populaties van genucleerde cellen die in de circulatie zijn aangetroffen.

Het rode gebied stelt lymfocyten voor, groen stelt monocyten voor, blauw stelt granulocyten voor, en het paarse gebied moet nog worden gekarakteriseerd. Wanneer rode celresten in het protocol niet worden verwijderd, ontstaat er een cluster van events in de fax-plot, te zien in het cyaanblauwe gebied. Celpopulaties kunnen worden gevisualiseerd in afzonderlijke fax-plots.

Lymfocyten werden aangetoond met CD3 en CD4. Monocyten werden aangetoond met CD14 en granulocyten met CD66p. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u een bloedmonster voorbereidt en verwerkt met het microfluïdische bloedlyse-apparaat. Bij deze procedure is het belangrijk om het bloedmonster direct te verwerken, zodat de PBS zich niet met het bloed mengt voordat het het apparaat binnenkomt, en om te voorkomen dat er luchtbellen in de kanalen van het apparaat terechtkomen.

Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.