Name: Single-cell Suction Recordings van Mouse Cone fotoreceptoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-05T20:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 35 s
Description: Leer hoe je single-cell zuigelektrode-opnames maakt van muizenkegels om flitsreacties te meten. Deze methode toont de dissectie van het netvlies en de acquisitie van elektrofysiologische gegevens.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ondersteund door Career Development Award van Onderzoek om Blindheid, NIH subsidie ​​EY 019312, en de onbeperkte subsidie ​​Voorkomen Onderzoek om Blindheid en EY 02.687 (Department of Ophthalmology &amp; Visual Sciences aan de Washington University) te voorkomen.

Het maken van elektroden <ol><li> Maak de registrerende elektroden met behulp van een micropipet trekker en poets de elektroden met verwarming gloeidraad onder de microscoop. Voor muis kegel eencellige zuig-opname, de binnenste diameter van de elektrode tip is ongeveer 6-7 um. </li><li> Bereid referentie-elektroden. Weeg 1% agar in gedistilleerd water. Smelt de agar-oplossing in warm water bad. Vul de glazen pipetten (L = 100 mm, OD / ID = 1/0.75 mm) met 1% agar met behulp van spuit. Stollen van de agar bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. </li><li> Snijd de pipetten in twee helften met behulp van een diamant mes. </li><li> Genieten van de referentie-elektroden in de referentie-oplossing ten minste 24 uur bij 4 ° C. </li></ol> Het opzetten van het experiment <ol start="5"><li> Donker &#39;s nachts een muis aan te passen in een zwarte kooi. </li><li> Bereiding van 100 ml referentie-oplossing en een L perfusie-oplossing (zie hieronder) en filter de oplossing. </li><li> Los 0,1% BSA en 10 mM glucose in 20 ml standaardoplossing. </li><li> Kalibreer de lichtintensiteit van de optische stimulator met behulp van fotometer. </li><li> Monteer de opname kamer op het podium van de omgekeerde microscoop. </li><li> Bubble van de perfusie-oplossing met 95% O 2 / 5% CO 2, incubeer het in 40 ° C waterbad om de oplosbaarheid van CO 2 te verhogen. De oplossing vloeit voort uit de fles om de opname kamer die door een keramische weerstand opwarming het naar 36-38 ° C. De verwarming moet zo dicht mogelijk bij de opname kamer mogelijk zijn, idealiter in het stadium van de microscoop. </li><li> Stel de debietregelaar voor een debiet van ongeveer 1-1,5 ml / min. </li><li> Vul de registratie-elektrode met referentie-oplossing. Plaats de elektrode in een elektrode houder. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de elektrode. Monteer de houder op de headstage van de versterker. Sluit de houder een zuiginrichting, die is gebouwd door het aansluiten van leidingen gedeeltelijk gevuld met minerale olie om de side-poort van de elektrode houder. Het andere uiteinde van de slang is verbonden met een klein reservoir van minerale olie, waarmee de druk kan worden toegepast door de mond. </li><li> Sluit de referentie-elektrode naar de andere pool van de headstage. Bind de thermische koppel (TC) om de referentie-elektrode. Zorg ervoor dat de elektrode en TC tips liggen dicht bij elkaar, zodat de temperatuur wordt genomen zo dicht mogelijk bij de cel mogelijk te maken. </li><li> Schakel de infrarood verlichting van de elektrode te visualiseren. De elektrode wordt bekeken door middel van infrarood-camera is aangesloten op een monitor. Midden van de elektrode beeld op het visuele veld en van de monitor met behulp van een micro-manipulator. </li><li> Pas de positie van de referentie-elektrode dicht (2-4 mm) om de opname elektrode tip. </li><li> Stel de DC-spanning voor de verwarming zodat de temperatuur van de oplossing is ongeveer 36-38 ° C. </li><li> Voer een dichtheidsbeproeving om de weerstand van de registratie-elektrode controleren, normaal ongeveer 900 kΩ. </li></ol> Isoleren van de muis netvlies <ol start="18"><li> Onder gedimd rood licht, euthanaseren het donker aangepaste muis met CO 2 en cervicale dislocatie. Markeer de oogbollen met behulp van de punt van een hete metalen fakkel door verbranden van de meest dorsale punt van de sclera licht. Ophelderen de oogbollen met een schaar. Alle volgende procedures worden uitgevoerd onder infrarood licht. </li><li> Hemisect de oogbollen onder de microscoop met infrarood verlichting en beeldomzetters. </li><li> Verwijder het hoornvlies en de lens. Verwijder zoveel van het glasvocht mogelijk te maken. </li><li> Voor het opnemen van M-cone reacties, verwijder het ventrale deel van de oogschelp 4 met een scheermesje te oordelen naar de cauterisatie mark. </li><li> Schil het netvlies van het pigment epitheel laag. </li><li> Plat het netvlies en de plaats het op de bodem van de petrischaal gevuld met 1-2 mL referentie-oplossing. </li><li> Snijd het netvlies in kleine dunne stukjes met behulp van een scheermesje en incubeer de bereiding in een lichtdichte doos verzadigd met pure zuurstof. </li></ol> Opnamen <ol start="25"><li> Zet de verwarming tijdelijk. Schakel de perfusie stroom naar een bypass slang aan op de kamer te voorkomen drogen. </li><li> Giet het grootste deel van de oplossing in de kamer met behulp van een stukje Kimwipe weefsel. Overdracht het netvlies schorsing om de opname kamer met een glazen pipet. </li><li> Wacht ongeveer 2 minuten tot het netvlies plakken vestigen. Weer in te schakelen van de doorbloeding op. Schakel de verwarming. </li><li> Schakel infrarood verlichting aan de voorbereiding te visualiseren. Zoek naar een stukje van het netvlies liggen op de kamer met fotoreceptor buitenste segmenten uit te steken (zie voorbeeld figuur). Zuig binnenste segmenten in de elektrode door de zuiging. In deze configuratie moeten verschillende kernen en innerlijke segmenten worden getrokken in de elektrode. Noteer de photoresponse om een ​​heldere flits om te testen of een kegel innerlijke segment is in de elektrode, en of de cel is te genezenuw, te oordelen naar de reactie kinetiek en amplitude. </li><li> Laat de minerale reservoir tot lichte negatieve druk op de punt van de elektrode te helpen houden de binnenste segment in de elektrode toe te passen. </li><li> Record test-flash reacties van dim naar heldere intensiteit eens een goede cel is gevonden. Test flitsen zijn voorzien van een geijkte optische stimulator 5. Flitsintensiteit en golflengte worden gecontroleerd door een reeks van neutrale dichtheid filters en de smalle band interferentie filters, respectievelijk. Test flash duur (20 ms) wordt bestuurd door de computer-gestuurde rolluiken. </li></ol> Oplossingen <ol><li> Muis perfusie oplossing: 112,5 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 2,4 mM MgCl2, 1,2 mM CaCl2, 10 mM HEPES (pH 7,4), 20 mM NaHCO 3, 3 mM Na succinaat, 0,5 mM Na glutamaat, 0,02 mM EDTA, en 10 mM glucose. </li><li> Muis registratie-elektrode-oplossing: 140 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 2,4 mM MgCl2, 1,2 mM CaCl 2, 3 mM HEPES (pH 7,4), 0,02 mM EDTA. </li></ol>

<ol><li>Yau, K. W., Lamb, T. D., Baylor, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+fluctuations+in+membrane+current+of+single+toad+rod+outer+segments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-induced fluctuations in membrane current of single toad rod outer segments.</a> Nature. 269, 78-80 (1977).</li>
<li>Nikonov, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptors+of+Nrl+-%2F-+mice+coexpress+functional+S-+and+M-cone+opsins+having+distinct+inactivation+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Photoreceptors of Nrl -/- mice coexpress functional S- and M-cone opsins having distinct inactivation mechanisms.</a> J Gen Physiol. 125, 287-304 (2005).</li>
<li>Nikonov, S. S., Kholodenko, R., Lem, J., Pugh, E. N. JR <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+features+of+the+S-+and+M-cone+photoreceptors+of+wild-type+mice+from+single-cell+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Physiological features of the S- and M-cone photoreceptors of wild-type mice from single-cell recordings.</a> J Gen Physiol. 127, 359-374 (2006).</li>
<li>Applebury, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+murine+cone+photoreceptor%3A+a+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27, 513-523 (2000).</li>
<li>Cornwall, M. C., Fein, A., MacNichol, E. F. JR <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+that+underlie+bleaching+and+background+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms that underlie bleaching and background adaptation.</a> J Gen Physiol. 96, 345-372 (1990).</li>
<li>Calvert, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototransduction+in+transgenic+mice+after+targeted+deletion+of+the+rod+transducin+alpha+-subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Phototransduction in transgenic mice after targeted deletion of the rod transducin alpha -subunit.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 13913-13918 (2000).</li>
</ol>

Single-cell zuig opname van fotoreceptorcellen was drie decennia geleden ontwikkeld. Het stelt ons in staat om op te nemen trans-membraan huidige verandering veroorzaakt door licht stimulatie, zonder het penetreren van de celmembraan. Vanwege de hoge cel-cel adhesie, is het moeilijk om gezond single staafjes en kegeltjes isoleren van de muis netvlies, zoals amfibieën retina en het is moeilijk te vinden individuele kegels te wijten aan het lage percentage (3%) en de kleine omvang. De binnenste-segment-in (IS-in) opname m...

single-cell suction recordings van mouse cone fotoreceptoren

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Staafjes en kegeltjes fotoreceptoren in het netvlies zijn verantwoordelijk voor het licht detectie. In de duisternis, cyclisch nucleotide-gated (CNG) kanalen in de buitenste segment zijn open en laten kationen gestaag naar binnen stromen over het membraan, depolariserende de cel. Blootstelling aan licht leidt tot de sluiting van de CNG-kanalen, blokkeert de innerlijke kation stroom, en dus resulteert in een cel hyperpolarisatie. Op basis van de polariteit van fotoreceptoren, was een zuig-opname methode ontwikkeld in 1970 dat, in tegenstelling tot de klassieke patch-clamp techniek, vereist geen penetreren van de plasmamembraan<sup&gt; 1</sup&gt;. Het tekenen van de buitenste segment in een strak gesneden glazen pipet gevuld met extracellulaire oplossing kan het opnemen van de huidige veranderingen in individuele cellen op test-flitsbelichting. Echter, deze gerenommeerde &#39;buiten-segment-in (OS-in) &quot;zuig-opname is niet geschikt voor muis conus opnames, vanwege het lage percentage van de kegels in het netvlies muis (3%) en de moeilijkheden bij het identificeren van de kegel buitenste segmenten. Recent werd een innerlijke-segment-in (IS-in) het opnemen van de configuratie ontwikkeld om de binnenste segment / nucleaire regio van de fotoreceptor te trekken in de opname pipet<sup&gt; 2,3</sup&gt;. In deze video laten we zien hoe op te nemen van de individuele muis kegel photoresponses gebruik van single-cell zuigkracht elektrode.

We zullen laten zien hoe te knipperen de reacties op te nemen van enkele muis kegels met behulp van een zuig-elektrode.

Single-cell Suction Recordings van Mouse Cone fotoreceptoren

Stafjes- en kegeltjefotoreceptoren in het netvlies zijn verantwoordelijk voor de detectie van licht. In het donker zijn cyclisch nucleotide-gestuurde (CNG) kanalen in het buitenste segment ...

Deze video demonstreert de dissectie van de retina van een muis en de daaropvolgende acquisitie van single cell suction-opnames van kegeltjes. De oogbollen van een geëuthanaseerde, donker-geadapteerde muis worden gecauteriseerd aan het dorsale deel en genucleerd onder zwak rood licht. De oogbollen worden vervolgens hemisectieerbaar gemaakt.Langs de equator worden vervolgens het hoornvlies en de ventrale delen van de oogbollen verwijderd. Het dorsale netvlies wordt gescheiden van de pigmentepitheellaag en met een scheermesje in kleine, dunne stukjes gesneden. De plakjes netvlies worden vervolgens geplaatst in de registratiekamer die op een microscooptafel past.Verschillende cellichamen van fotoreceptoren worden in de registratie-elektrode gezogen. Wanneer een kegelfotoreceptor in de elektrode wordt gezogen, zal een heldere testflits een fotoreactie induceren met een amplitude van meer dan vier picoamps. Hallo. Ik ben Jin van het laboratorium van Dr. Mir Kops in de afdeling Oftalmologie en de visuele census aan de Washington University in St. Louis.Vandaag laten we u een procedure zien voor het registreren van fotoreacties van enkelvoudige Moscon-fotoreceptoren. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de adaptatie-eigenschappen van zoogdierkegeltjes te bestuderen, de fotoreceptoren die ons dagzicht bemiddelen. Laten we beginnen.Eén dag vóór de registratie vindt de donkeradaptatie van het experiment plaats. Adapteer een muis door deze gedurende de nacht in een lichtdichte kooi te plaatsen. Gebruik een micropipetpuller om registratie-elektroden te vervaardigen uit Borrow silicaatglazen buisjes onder een samengestelde microscoop.Gebruik een verhittingsfilament om te branden. Polijst de punt van elke elektrode om deze glad te maken en de opening te reduceren tot de gewenste diameter. Voor een single cell suction met een muizenconus moet de binnendiameter van de elektrodepunt ongeveer zes tot zeven µm zijn.Bereid een 1% agar-oplossing in gedestilleerd water. Plaats de oplossing in kokend water om de agar te smelten. Zodra de agar is gesmolten, brengt u deze over in een spuit en vult u de glazen pipetten met de oplossing.Om de referentie-elektroden voor te bereiden, laat u deze 10 minuten uitharden bij kamertemperatuur. Nadat de agar is gestold, gebruikt u een diamantmes om elke pipet in tweeën te snijden om twee referentie-elektroden te maken. Plaats de referentie-elektroden in een scintillatiebuisje gevuld met referentie-oplossing en laat ze minstens 24 uur weken bij 4 °C, zodat de oplossing in de agargel kan doordringen.Referentie-elektroden kunnen tot drie maanden na de datum van bereiding worden gebruikt. Gebruikte elektroden worden na het experiment weggegooid. Het registratiesysteem bestaat uit een omgekeerde microscoop die is gemonteerd op een luchtsuspensietafel om vibratieruis te minimaliseren, afgeschermd door een Faraday-kooi om elektromagnetische ruis te minimaliseren.Een gemotoriseerde micromanipulator wordt gebruikt voor het positioneren van de registratie-elektrode. De optische stimulator bestaat uit een wolfraamfilament, computergestuurde shutters en optische filters om de golflengte en lichtintensiteit te regelen. Een patchclamp-versterker wordt gebruikt om membraanstromen van individuele fotoreceptorcellen te detecteren.Gedurende de opnames zal het weefsel worden geperfuseerd. Plaats één liter van de bereide perfusiebuffer in een waterbad van 40 °C nabij het opnamesysteem. Sluit vervolgens via slangjes de perfusiebuffer aan op 95% zuurstof en 5% kooldioxide, zodat deze continu belucht wordt.Meet met een fotometer het ongedempte lichtvermogen van de optische stimulator, waarbij de detector van de fotometer op de microscooptafel wordt geplaatst in het vlak waar het preparaat zal worden geplaatst. Reken vervolgens de aflezing in microwatt om naar fotonen per vierkante micrometer per seconde om het aantal fotonen per testflits te schatten, rekening houdend met de demping van het licht door neutrale dichtheidsfilters.Nadat de niet-gedempte lichtintensiteit is gemeten, verwijdert u de fotometer van de tafel en plaatst u de opnamekamer die voor de experimenten zal worden gebruikt op de tafel van de omgekeerde microscoop. Verbind met behulp van slangjes de fles met perfusieoplossing via een regelklep met de opnamekamer. Leid de slangjes hierbij door een warmteweerstand.Zorg ervoor dat de verwarmingsweerstand direct vóór de registratiekamer is geplaatst. Sluit vervolgens de bypassslang van het regelventiel aan op de registratiekamer. Start de perfusie door het stroomregelventiel te openen en af te stellen op een stroomsnelheid van 1 tot 1,5 milliliters per minuut.De perfusie-oplossing loopt door zwaartekracht uit de registratiekamer in een opvangkolf. Gebruik een spuit met een stompe naald om de elektrodehouders te vullen met referentie-oplossing. Vul en spoel de registratie-elektrode met referentie-oplossing met behulp van een microfill-spuitnaald, waarbij u erop toeziet dat er geen luchtbellen in de elektrode aanwezig zijn.Plaats de referentie-elektrode in een elektrodehouder en verbind deze met de referentiepool van de versterker-headstage. Gebruik een rubberen ring om het thermokoppel aan de referentie-elektrode te bevestigen. Zorg ervoor dat de tips van de elektrode en het thermokoppel dicht bij elkaar geplaatst worden, zodat de temperatuurmeting zo dicht mogelijk bij de cel plaatsvindt.Plaats vervolgens de registratie-elektrode in een elektrodehouder en bevestig de houder aan de headstage van de versterker. Verbind met behulp van slang een klein reservoir met minerale olie met de zijpoort van de elektrodehouder. Door voorzichtig met de mond te zuigen via de slang die aan het reservoir is verbonden, wordt de cel in de elektrode getrokken.Open met de computersoftware een van de sluiter van de optische stimulator. Om het straalgebied van de testflits op de microscooptafel te visualiseren, stelt u de microscoop scherp op de bodem van de registratiekamer. Verplaats de elektrode met de micromanipulator naar het centrum van het straalgebied van de testflits.Positioneer de referentie-elektrode dicht bij de punt van de registratie-elektrode. Stel het voltage voor de verwarming zo in dat de temperatuur van de oplossing in de registratiekamer ongeveer 36 tot 38 °C is. Voer een sealtest uit, waarbij het voltage bij een vooraf ingestelde stroomamplitude wordt gemeten om de weerstand van de registratie-elektrode te berekenen, welke normaal gesproken ongeveer 900 kΩ bedraagt.De afdichtingstest maakt het mogelijk om bellen in de registratie- of referentie-elektroden of een onjuiste tipgrootte van de registratie-elektrode te detecteren. De afdichtingstest wordt softwarematig aangestuurd door het acquisitieprogramma clamp X. De weerstandswaarde wordt op het computerscherm weergegeven. Als de weerstand te laag is, minder dan 500 kilo ohms, is de tip van de elektrode waarschijnlijk te groot en moet er een nieuwe elektrode worden geplaatst.Als de weerstand hoger is dan één milliohm, kan er een luchtbel in de elektrode aanwezig zijn of is de punt te nauw, waardoor de elektrode gespoeld of vervangen moet worden. Zodra het registratieapparaat gereed is, worden de retinaal-slices onder een zwak rood licht voor het experiment voorbereid; gebruik de punt van de hete dissectienaald om de sclera op het meest dorsale punt van elk oogbool van een geëuthanaseerde, donkergeadapteerde muis te cauteriseren. Nucleer daarna de oogbollen met een schaar.Gebruik stompe pincetten om de oogbollen over te brengen naar een dissectiemicroscoop die is uitgerust met infraroodverlichting en infraroodbeeldomzetters. Alle verdere dissectiemanipulaties worden onder infraroodlicht uitgevoerd. Snijd vervolgens met microscharen de oogbol open langs de equator, behalve bij het cauterisatiepunt.Gebruik scherpe pincetten om de lens te verwijderen. Verwijder vervolgens zoveel mogelijk van het glaaslichaam, waarbij de cauterisatiepunt als referentie dient. Gebruik een scheermesje om het ventrale deel van de oogbeker te verwijderen.Verwijder vervolgens het hoornvlies. Gebruik daarna een pincet om het dorsale netvlies van de pigmentepitheellaag los te pellen. Plaats het netvlies vervolgens met de receptorzijde naar boven op de bodem van een nieuwe Petrischaal gevuld met 1 tot 2 milliliter van een 10 millimolaire glucose-referentieoplossing met 0,1% BSA en druk het netvlies voorzichtig plat met een scheermesje.Snijd het netvlies in kleine dunne stukjes. Incubeer de preparatie vervolgens in een lichtdoorlatende box die continu verzadigd is met zuivere zuurstof voordat de netvliessecties in de registratiekamer worden geplaatst. Schakel de verwarming tijdelijk uit.Schakel de perfusiestroom over naar de bypassleiding. Drain vervolgens met een Kimwipe het grootste deel van de oplossing uit de kamer. Schakel de infraroodverlichting in.Haal de retina-suspensie uit de incubator en breng de plakjes over naar de registratiekamer. Laat de plakjes twee minuten bezinken met behulp van een overbrengpipet met een wijde opening. Zodra de retinaplakkjes zijn bezonken, kunnen de directe perfusie en de verwarming weer worden ingeschakeld.Identificeer een stuk retina waarbij de buitenste segmenten van de fotoreceptoren uitsteken. Positioneer de punt van de registratie-elektrode boven de buitenste nucleaire laag van de retina met behulp van mondzuiging. Trek voorzichtig enkele cellichamen van fotoreceptoren in de elektrode, zodat de cellen in de elektrode getrokken worden.Geef een testflits van 20 milliseconden bij 500 nanometer. De door licht geïnduceerde verandering in de stroom die door de fotoreceptor vloeit, vertegenwoordigt de respons op de testflits. Een gezonde kegelcel zal een maximale responsamplitude van vier tot zeven pA produceren.Stimuleer de cel met een onverzwakte testflits. Zodra een geschikte cel is gevonden, verlaag het reservoir met minerale olie voorzichtig handmatig om een lichte negatieve druk op de tip van de elektrode uit te oefenen, zodat het binnenste segment van de cel beter in de elektrode wordt vastgehouden. Als de cel reageert, registreer dan een reeks responsen op testflitsen met een intensiteit variërend van de drempelwaarde tot verzadiging.Met deze techniek kunnen we, met behulp van een zuigelektrode, fotoreacties van kegeltjes verkrijgen uit retina-coupes van muizen. Hier wordt een overlay getoond van verschillende opnames van dezelfde cel. Fotoreacties van een enkel kegeltje werden opgewekt door testflitsen met een toenemende intensiteit, van zwak, wat hier een drempelrespons van ongeveer 1 pA genereert, tot een hoge intensiteit, wat een verzadigde respons van ongeveer 5,5 pA genereert.Naarmate de flitsintensiteit toeneemt, stijgt de amplitude van de fotoreactie totdat verzadiging wordt bereikt. De flitsen worden gegeven op tijdstip nul. We laten u zien hoe u fotoreacties van enkele moscon-fotoreceptoren kunt registreren met behulp van een zuigelektrode.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat u het juiste deel van het netvlies moet verkrijgen, het netvlies in dunne plakjes moet snijden, de elektrode vrij van bellen moet houden en zowel mechanische als elektromagnetische ruis tot een minimum moet beperken. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

single-cell-suction-recordings-from-mouse-cone-photoreceptors

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschrijven we een procedure voor het genereren van donker aangepaste plakjes van de muis netvlies voor elektrofysiologische opnames.

Patch Clamp Opnamen van Mouse Retinal Neuronen in een donker aangepaste Slice Voorbereiding

We beschrijven een relatief eenvoudige methode van transretinal electroretinogram (ERG) opnamen voor het verkrijgen van staafjes en kegeltjes photoresponses uit intacte muis netvlies. Deze aanpak maakt gebruik van het blok van synaptische transmissie van fotoreceptoren hun lichte reacties te isoleren en hen te registreren met behulp van elektroden veld geplaatst over de geïsoleerde platte gemonteerde netvlies.

Transretinal ERG Opnames van Mouse Retina: staafjes en kegeltjes Photoresponses

Source: Laboissonniere, et. al. Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells. J. Vis. Exp. (2017). This video demonstrates a fluorescent tracing technique to identify retinal ganglion cell (RGC) subtypes in a transgenic mouse retina. The process involves securing the isolated retina in a recording chamber, maintaining cell viability with oxygenated perfusion, and targeting fluorescently labeled RGCs using a pipette with a tracer. By analyzing dendritic morphology and...

Identification of Mouse Retinal Ganglion Cell Subtypes Through Fluorescent Tracing

Source: Kulkarni, M. et al. Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the use of two-photon microscopy to monitor calcium dynamics in cone photoreceptors of a transgenic mouse retina. It outlines the steps for preparing retinal slices, imaging FRET-based calcium biosensors, and analyzing fluorescence changes to quantify calcium levels under background illumination and light stimulation.

Two-Photon Microscopy for Monitoring Calcium Dynamics in Mouse Retinal Cone Photoreceptors

We beschrijven de bereiding van dunne netvlies plakken uit het water levende tijger salamanders...

Gelijktijdige Whole-cell Opnames van Photoreceptors en Tweede-orde neuronen In amfibievliegtuig netvlies Slice Voorbereiding

Neurale retina van een muis 8 dagen oud is op een 4% gelatine blok. Na isolatie van de fotoreceptor laag (200 pm) door vibratome, zijn de fotoreceptoren gezaaid na mechanische en enzymatische dissociatie voor cultuur. De fotoreceptor laag kan worden gebruikt voor moleculaire, biochemische analyses of transplantatie.

Vibratome Sectioning Mouse Retina te Fotoreceptor culturen Bereid

We zullen demonstreren hoe retinale plakjes van het muizenoog worden bereid en lichtreacties in retinale neuronen worden opgenomen. De hele procedure wordt uitgevoerd in donker-aangepaste omstandigheden.

Opname Light-evoked Postsynaptische Reacties in Neuronen in Dark-aangepaste, Mouse retinale Slice Voorbereidingen Gebruik Patch Clamp technieken

We beschrijven een protocol om Ca 2+ dynamiek in de axon terminals van de kegel fotoreceptoren met behulp van een ex-vivo slice voorbereiding van de muis netvlies controleren. Dit protocol maakt uitgebreide studies van de kegel Ca 2+ signalering in een belangrijke zoogdieren modelsysteem, de muis.

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamiek in Cone fotoreceptorcellen Axon Terminals van de Mouse Retina

We ontwikkelden een horizontale slice voorbereiding van de zoogdierretina volwassene met het vlak van snijden parallel aan het netvliesoppervlak. Dendritische gebied van nonradially georiënteerde retinale neuronen werden niet afgekapt, waardoor de studie van de signaalverwerking met patch-klem en beeldvormende technieken.

Voorbereiding van de Horizontale Schijfjes van Adult Mouse Retina voor elektrofysiologisch onderzoek

Hier presenteren we een combinatorische aanpak voor het classificeren van neuronale celtypes voorafgaand aan isolatie en voor de daaropvolgende karakterisering van enkelvoudige transcriptomen. Dit protocol optimaliseert de voorbereiding van monsters voor succesvolle RNA Sequencing (RNA-Seq) en beschrijft een methodologie die speciaal is ontwikkeld voor een beter begrip van cellulaire diversiteit.

Single-cell RNA-Seq van gedefinieerde subsetjes van retinale Ganglion-cellen

We beschrijven een methode om primaire culturen van kegelfotoreceptoren te verkrijgen van het netvlies van kippenembryo's en het gebruik ervan voor screening met een hoog gehalte.

Met kegels verrijkte culturen van het netvlies van kippenembryo's om staaf tot kegel cellulaire interacties te bestuderen

Leer hoe je single-cell zuigelektrode-opnames maakt van muizenkegels om flitsreacties te meten. Deze methode toont de dissectie van het netvlies en de acquisitie van elektrofysiologische gegevens.

Single-cell Suction Recordings van Mouse Cone fotoreceptoren

Meer video's verkennen