Fabricage en exploitatie van een zuurstof Inzetstuk voor hechtend Cellular Culturen

Het hypoxische inzetapparaat heeft zes pilaren die in de putjes van een six-wellplaat passen. Gas stroomt over het microfluïdische netwerk aan de basis van de pilaar en kan diffunderen door het gasdoorlatende PDMS-membraan, dat het gasnetwerk en de kweekmedia scheidt. Dit apparaat minimaliseert de diffusiepadlengte tussen de zuurstofbron, het microfluïdische netwerk aan de basis van de pilaar en de cellen, waardoor een snellere equilibratie van de zuurstofconcentratie mogelijk is.

Het apparaat biedt ook een veel grotere controle over het ruimtelijke patroon van zuurstof waaraan de cellen worden blootgesteld, wat wordt bepaald door het ontwerp van het microfluïdische gasnetwerk, vervaardigd via standaard fotolithografie met gebruik van fotomaskers. Hallo, ik ben Sean Ard van het lab van Dr. David Edington van de afdeling Bioengineering aan de University of Illinois in Chicago. Hallo, ik ben Ellie, ook van het Edington Lab.

Vandaag laten we u zien hoe u een op maat gemaakt apparaat kunt fabriceren, valideren en gebruiken om in vitro celculturen in een zeswellenplaat bloot te stellen aan verschillende zuurstofconcentraties. Wij hebben deze procedure in ons laboratorium gebruikt om het effect van zuurstof op wondgenezing, de generatie van reactieve zuurstofcomponenten en migratie te bestuderen. Laten we beginnen.

Om te beginnen met de fabricage van de oxygenerende insert, bereid Polymethylsiloxaan of PDMS voor in een verhouding van 10 op 1 tussen prepolymeer en uithardingsmiddel. Volgens de instructies van de fabrikant wordt het PDMS-mengsel toegevoegd aan een eerder gefreesde mal, waarvan het patroon de vorm van een standaard zes-well cultuurplaat nabootst. Zodra dit gedurende de nacht is uitgehard bij 75 °C, vormt de resulterende gegoten pijlermatrix het eerste van de drie componenten waaruit de oxygenerende insert bestaat, om vervolgens de tweede cruciale component van de oxygenerende insert te fabriceren.

Een SU-8 master wordt geprepareerd door eerst SU-8 2150 te spinnen. Op een siliciumwafer wordt een fotomasker aangebracht en de SU-8 wordt via het fotomasker blootgesteld aan UV-licht om een mastermal te creëren met een microkanaaldikte van 300 µm. Giet PDMS bovenop de SU-8 master en harden dit twee uur lang uit bij 75 °C om een positieve mal te verkrijgen die uiteindelijk de microkanalen aan de onderzijde van elke pilaar zal vormen.

Het derde onderdeel van het apparaat wordt gefabriceerd door PDMS op een siliciumwafer te spinnen bij 500 RPM gedurende 10 seconden, gevolgd door 900 RPM gedurende 30 seconden om een membraan van 100 micrometer dik te verkrijgen. Aangezien PDMS gasdoorlaatbaar is, kan zuurstof direct door dit membraan in de microkanalen worden geleverd. Zodra alle onderdelen zijn voorbereid, wordt elk hechtvlak gedurende één minuut onderworpen aan een zuurstofplasmabehandeling.

Bond eerst de zes microkanaalcomponenten aan de pilaarray met behulp van een handheld plasmatoestel, en maak vervolgens twee gaten in elke pilaar die dienen als gasinlaat en -uitlaat. Bond tot slot het membraan aan de onderzijde van het microkanaal om de hechting te vergemakkelijken en eventuele bellen te verdrijven. De plasmabehandelde oppervlakken worden ongeveer een minuut lang op elkaar gedrukt met het stompe uiteinde van een pincet; wacht één uur tussen elke bondingsstap om te garanderen dat het apparaat volledig is verbonden en gekalibreerd kan worden.

Zodra een compleet apparaat is gefabriceerd, moet het niveau van zuurstof dat cellen ontvangen bij het gebruik van de zuurstof-insert in daadwerkelijke experimenten worden gekalibreerd. Gebruik voor kalibratie een fluorescente zuurstofsensor of foxy-slide, die een fluorescerende rutheniumkleurstofcoating bevat die door zuurstof wordt gedoofd. Foxy-slides zijn voorgesneden om in de bodem van een zeswellenplaat te passen.

De foxy-slide moet worden gesneden zodat deze zoveel mogelijk van het well-oppervlak bedekt. Aangezien de foxy-slide een dikte van ongeveer één millimeter heeft, moet het apparaat worden aangepast om de gewenste afstand voor adequate membraandiffusie van de slide te handhaven.

Deze afstand is afhankelijk van het experiment, maar moet in de meeste gevallen minder dan één millimeter bedragen. Gebruik het handheld plasma-apparaat om glazen microscoopdia-steuntjes van ongeveer zes millimeter lang en vier millimeter breed en één millimeter dik aan de onderkant van het apparaat te bevestigen. Het apparaat zal rusten op de steuntjes bovenop het uitgesneden dia.

Glazen dekglasjes kunnen ook worden gebruikt voor een diffusiespleet van 0,17 millimeter om het zuurstofverbruik te valideren. Voeg drie milliliter gedeïoniseerd water op kamertemperatuur toe aan de wells van de six-wellplaat waarin het zuurstofgehalte zal worden gemeten. Plaats het apparaat in de plaat en selecteer met de Metamorph-software het aantal en de locatie van de gewenste posities op de foxy-sensor.

Schuif om de zuurstofconcentraties te analyseren. Verbind de tai gun-slangen tussen de zuurstofgastank en het hypoxische inzetstuk. Een precisiedoorstroomregelaar, ingesteld op een debiet van 50 tot 100 milliliters per minuut, wordt gebruikt voor een nauwkeurige regeling van het toegediende gas.

Zorg ervoor dat de precisiedrukreggelaar gesloten is. Open eerst de regelaar bovenop de tank, gevolgd door de precisiedrukreggelaar. Verlaag de stroomsnelheid na 15 minuten naar 10 tot 20 per minuut.

Om de vorming van luchtbellen in het water te voorkomen, dient de stroomsnelheid gedurende het volgende uur nauwlettend in de gaten te worden gehouden en indien nodig te worden aangepast, aangezien de drukval zal veranderen terwijl het systeem equilibrium bereikt, wat de stroomsnelheid beïnvloedt bij het vastleggen van beelden van de plaat en de foxy-sensoren. Er wordt gebruikgemaakt van een Olympus IX 71-microscoop uitgerust met fluorescentie, een charge-coupled device-camera van Q Imaging Tiga, en SRV- en Metamorpho-beeldacquisitiesoftware. De microscoop is uitgerust met een Olympus 3 1 0 2 0, een foxy-compatibel fluorescent filter met een excitatiegolflengte van 475 nanometers en een emissiegolflengte van 600 nanometers.

Om de equilibratietijd en de mate van oxygenatie van het apparaat te testen, kiest u drie punten op de foxy-dia om de zuurstofconcentratie te meten. Maak een afbeelding van de dia direct voordat de gasstroom wordt gestart. Maak afbeeldingen met intervallen van 10 seconden gedurende 30 minuten terwijl het gas door het apparaat stroomt om de heterogeniteit en de zuurstoftoevoer te testen.

Stel meerdere punten vast met intervallen van één millimeter over de breedte van het kanaal en meet de zuurstofconcentratie aan het oppervlak van de well met behulp van Metamorph. Exporteer de gemiddelde beeldintensiteit voor elke positie en zet de zuurstofconcentratie uit tegen de fluorescentie-intensiteit. Genereer een kalibratiecurve door lineaire curven te fitten aan de lijn van 0 tot 10% en de lijn van 10 tot 21%, waarbij de fluorescentie-intensiteit wordt gerelateerd aan de zuurstofconcentratie. Voor elke gemeten positie kunnen de ruwe intensiteitsgegevens uit Metamorph worden geëxporteerd en verder worden geanalyseerd met Microsoft Excel of andere statistische software.

Zodra het apparaat is gekalibreerd, kunnen experimenten zoals wondgenezingsassays beginnen; autoclaveer de gekalibreerde inzet bij 121 °C gedurende 15 minuten binnen 24 uur vóór het experiment en werk ermee in een laminaire flow-cultuurkap om daaropvolgende contaminatie te voorkomen. Week de gesteriliseerde PDMS-inzet 24 uur in serumvrij medium om gasbellen te voorkomen bij het plaatsen in de putjes van de plaat; cultiveer MDCK-cellen of andere adherente cellen tot 100% confluentie in een zes-putjesplaat en maak rechte krassen in de monoculturen met een P 200 pipetpunt. De krassen simuleren wonden in de adherente monocultuur.

Zuig het celmedium af zonder de monolaag te verstoren en spoel na met vijf milliliters medium. Zuig opnieuw af en vul de wells opnieuw met drie milliliters serumvrij medium. Plaats het apparaat voorzichtig in de plaat, waarbij u erop let dat er geen luchtbellen ontstaan.

Het schuin plaatsen van het apparaat tijdens de insertie helpt om luchtbellen uit één zijde te verdrijven. Wees voorzichtig om overmatige druk op het apparaat te vermijden, aangezien dit het PDMS zodanig kan vervormen dat de onderliggende cellen worden geplet. Plaats de plaat en het apparaat op een verwarmde microscooptafel van 37 °C en verbind de slang van de gastoevoer met de inlaat- en uitlaatpoorten van het apparaat.

De kweekincubator moet voorzien zijn van een opening om de instroom van buisjes mogelijk te maken, en de buisjes moeten worden aangesloten. Nadat het apparaat in de incubator is geplaatst, volgt u dezelfde procedure voor het starten van de gasstroom zoals eerder beschreven om de wondgenezing te beoordelen; maak elke 20 minuten gedurende 15 tot 18 uur time-lapse-opnamen van de cellen met de apparatuur en imaging-software zoals eerder beschreven. Een algoritme voor het meten van de 'scratch wound' kan worden gebruikt om het niet genezen oppervlak te analyseren na een gewenste experimentele duur. Stop de gasstroom, verwijder de plaat en ga over tot verdere celverwerking indien gewenst. Het hypoxische insert-apparaat heeft minder dan twee minuten nodig om te stabiliseren tot 0.5% oxygen, zoals hier wordt getoond.

De grootte van de opening aan de onderkant van de membraanput van het apparaat was een kritieke factor bij het bepalen van de equilibratie-efficiëntie, waarbij grotere openingen meer tijd vereisten om stabiele zuurstofconcentratiewaarden te bereiken. Het apparaat maakt bovendien een hoge mate van controle over de ruimtelijke oxygenatie in een enkele put mogelijk, waardoor meerdere condities kunnen worden gecreëerd en er zelfs een cyclisch zuurstofprofiel over het oppervlak van de put kan worden gegenereerd. MDCK-cellagen werden blootgesteld aan 10% of 21% zuurstof en het oppervlak van de wond werd in de loop van de tijd geanalyseerd met behulp van het MATLAB Ts scratch wound tailing-algoritme.

Na 11 van de in totaal 17 uur bleef 6,87% van de oorspronkelijke wond over bij blootstelling aan 10% zuurstof, terwijl 64,4% van de wond overbleef bij 21% zuurstof. Zoals hier getoond, zijn de zuurstofconcentraties negatief gecorreleerd met het open wondoppervlak voor beide zuurstofconcentraties. Gedurende de duur van het experiment hebben we aangetoond hoe de hypoxische insert-device kan worden gefabriceerd, gevalideerd en gebruikt voor een scratch wound healing assay. Het apparaat biedt een aantal voordelen ten opzichte van andere oxygenatiesystemen, zoals een kleinere ruimtebehoefte in het laboratorium en een veel grotere controle over de spatiale en temporele oxygenatie aan het celoppervlak.

Het apparaat kan worden gebruikt door vrijwel elk laboratorium dat het effect van zuurstof of andere gassen, zoals kooldioxide, op in vitro celculturen bestudeert. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om het gesteriliseerde apparaat en de cultuurmedia een nacht te laten weken, om de vorming van bellen tijdens het experiment te minimaliseren. Laat daarnaast het systeem equilibreren voordat u met het experiment begint.

Dit komt doordat de stroomsnelheid verandert naarmate de druk in het systeem zich stabiliseert. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.