Fabricage en exploitatie van een zuurstof Inzetstuk voor hechtend Cellular Culturen

Het hypoxische insert-apparaat heeft zes pilaren die in de putjes van een zes-putjesplaat passen. Gas stroomt over het microfluïdische netwerk aan de basis van de pilaar en kan diffunderen over de gasdoorlatende PDMS-membraan, waardoor het gasnetwerk en het kweekmedium worden gescheiden. Dit apparaat minimaliseert de diffusiepadlengte tussen de zuurstofbron, het microfluïdische netwerk aan de basis van de pilaar en de cellen, waardoor een snellere zuurstofconcentratie-equilibratie mogelijk wordt.

Het apparaat biedt ook veel meer controle over het ruimtelijke patroon van zuurstof dat aan cellen wordt blootgesteld, wat wordt bepaald door het ontwerp van het microfluïdische gasnetwerk dat is gemaakt door standaard fotolithografie met behulp van fotomaskers. Hallo, ik ben Sean Ard van het Dr. David Edington-lab in de afdeling Bio-Engineering aan de Universiteit van Illinois in Chicago. Hallo, ik ben Ellie ook van het Edington Lab.

Vandaag laten we u zien hoe u een aangepast apparaat maakt, valideert en gebruikt om in vitro celculturen in een zesvoudige plaat bloot te stellen aan verschillende zuurstofconcentraties. We hebben deze procedure in ons laboratorium gebruikt om het effect van zuurstof op wondgenezing, de vorming van reactieve zuurstofsoorten en migratie te bestuderen. Dus laten we beginnen.

Om te beginnen met de fabricage van de zuurstofinsert, bereid Polymethyl Sloane of PDMS voor in een 10 tot 1-verhouding tussen pre-polymeer en verharder. Volgens de instructies van de fabrikant wordt de PDMS-mix toegevoegd aan een eerder gemaakte Dell ran-mal gepateerd om de vorm van een standaard zes-putjesplaat na te bootsen. Na overnachting uitharden bij 75 graden Celsius, zal de resulterende replicagegoten pilaararray de eerste van de drie componenten vormen die het zuurstofinsert omvatten om de tweede sleutelcomponent van het zuurstofinsert te fabriceren.

Een SU-acht master wordt bereid door eerst SU 8 21 50 te draaien. Op een siliciumwafer wordt een fotomasker op de wafer aangebracht en de SU-acht wordt blootgesteld aan UV door de fotomasker om een mastermal met een microkanaaldikte van 300 micrometer te creëren. Giet PDMS op de SU acht master en laat twee uur uitharden bij 75 graden Celsius om een positief mal te verkrijgen dat uiteindelijk de microkanalen aan de onderkant van elke pilaar zal vormen.

Het derde onderdeel van het apparaat wordt gemaakt door PDMS op een siliciumwafer te draaien met 500 tpm gedurende 10 seconden, gevolgd door 900 tpm gedurende 30 seconden om een 100 micrometer dikke membraan te verkrijgen. Aangezien PDM's gasdoorlatend is, kan zuurstof rechtstreeks via dit membraan in de microkanalen worden afgegeven. Zodra alle onderdelen zijn voorbereid, wordt elke bindingsoppervlak gedurende één minuut onderworpen aan zuurstofplasmabehandeling.

Gebruik een handbediend plasmaapparaat om eerst de zes microkanaalcomponenten aan de pilaararray te hechten, vervolgens twee gaten in elke pilaar te prikken om als gasinlaten en -uitlaten te dienen. Bind tenslotte het membraan aan de onderkant van het microkanaal om binding te vergemakkelijken en eventuele luchtbellen te verdrijven. De plasmabehandelde oppervlakken worden ongeveer een minuut lang samengedrukt met behulp van het uiteinde van een stel pincetten, wacht een uur tussen elke binding om ervoor te zorgen dat het apparaat volledig is gebonden en kan worden gekalibreerd.

Zodra een compleet apparaat is gemaakt, moet het zuurstofniveau dat cellen ontvangen bij het gebruik van de zuurstofinsert in daadwerkelijke experimenten worden gekalibreerd. Gebruik voor kalibratie een fluorescerende zuurstofsensor of foxy-slide, die een fluorescerende rutheniumkleurstofcoating bevat die wordt geblust door zuurstof. Foxy-slides zijn voorgesneden om in de bodem van een zes-putjesplaat te passen.

De foxy-slide moet worden gesneden om zoveel mogelijk van het putjesoppervlak te bedekken. Omdat de foxy-slide een dikte van ongeveer een millimeter heeft, moet het apparaat worden aangepast om de gewenste afstand voor voldoende membraan te handhaven. Glijd om diffusie te bevorderen.

Deze afstand hangt af van het experiment, maar voor de meeste gevallen zou deze onder de één millimeter moeten zijn met behulp van het handbediende plasmaapparaat. Bond vier gesneden een millimeter dikke glazen microscoop. Plaats posts van ongeveer zes millimeter lang en vier millimeter breed op de bodem van het apparaat. Het apparaat rust op posts boven de snijde.

Glazen dekglasjes kunnen ook worden gebruikt voor een diffusieopening van 0,17 millimeter om het zuurstofgebruik te valideren. Bij drie milliliter gedeïoniseerd water bij kamertemperatuur in de putjes van de zes-putjesplaat waar het zuurstof zal worden gemeten. Plaats het apparaat in de plaat en selecteer met behulp van metamorf-software het aantal en de locatie van de gewenste posities op de foxy-sensor.

Schuif om de zuurstofconcentratie te meten. Verbind de tai-gun-buis tussen de zuurstofgastank en het hypoxische insert-apparaat. Een precisie-stroomregelaar ingesteld op een stroomsnelheid van 50 tot 100 milliliter per minuut wordt gebruikt voor fijne controle van het afgeleverde gas.

Zorg ervoor dat de precisie-stroomregelaar gesloten is. Open eerst de bovenregelaar van de tank, gevolgd door de precisieregelaar. Verlaag de stroomsnelheid tot tussen 10 en 20 per minuut na 15 minuten.

Om bubbels in het water te voorkomen, bekijk de stroomsnelheidswaarde aandachtig gedurende de volgende uur en pas indien nodig aan, aangezien de drukval zal veranderen terwijl het systeem zich zal richten op het vastleggen van afbeeldingen van de plaat en foxy-sensoren. Er wordt gebruik gemaakt van een op fluorescerende apparatuur uitgeruste Olympus IX 71-microscoop, een ladingskoppelapparaatcamera van Q Imaging Tiga, SRV en Metamorpho-beeldverwerkingssoftware. De microscoop is uitgerust met een Olympus 3 1 0 2 0, een foxy-compatibele fluorescente filter met een excitatiegolflengte van 475 nanometer en een emissi