Het visualiseren van RNA Lokalisatie in Xenopus Eicellen

In deze procedure worden fluorescent gelabelde RNA-transcripten geïnjecteerd in XUS-cyten en hun lokalisatie wordt gemonitord. Eerst wordt het RNA gelabeld met fluorescerende nucleotiden.

In een in vitro transcriptiereactie wordt het RNA vervolgens geladen in een micro-injectieapparaat. De eicellen worden op een injectieplaatje geplaatst en voorzichtig gemicro-injecteerd. Ten slotte worden de eicellen gekweekt om RNA-lokalisatie te laten plaatsvinden voordat ze worden afgebeeld op de confocale microscoop.

Hallo, ik ben James Gagnan van het laboratorium van Dr. Kimberly Mallory aan het Department of Molecular Biology, celbiologie en biochemie van Brown University. Vandaag laten we je een procedure zien voor het visualiseren van subcellulaire RNA-lokalisatie in Xap-eicellen. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de RNA-architectuur en eiwitfactoren te bestuderen die nodig zijn voor RNA-lokalisatie tijdens de vroege ontwikkeling van gewervelde dieren.

Dus laten we beginnen. Om deze procedure te starten, transcribeer mRNA, dat zowel radioactief als fluorescerend is gelabeld zoals beschreven in het bijbehorende geschreven protocol. Voeg DS toe om het sjabloon-DNA af te breken en stop vervolgens de reactie door EDTA toe te voegen.

Verwijder ongeïncorporeerde nucleotiden en andere kleine moleculen door door een G 50-kolom te centrifugeren. Het RNA wordt vervolgens geconcentreerd door ethanolprecipitatie, gewassen en opnieuw gesuspendeerd. Na het bepalen van de concentratie door scintillatietelling, verdunt u het RNA tot 50 nanomolair en bewaart u het in vijf microliter-aliquots bij min 80 graden Celsius.

Wanneer u klaar bent om de micro-injectie uit te voeren, ontdooit u een Eloqua van het gelabelde RNA, denatureert u het gedurende vijf minuten bij 70 graden Celsius. Draai vervolgens 10 minuten op maximale snelheid in een microcentrifuge bij kamertemperatuur om deeltjes te verwijderen en houd het op ijs. Isoleer vervolgens de cyten, snijd stukken van de xap-post lavu-eierstok in een 50 milliliter conische twee bevattende 25 milliliter van drie milligram per milliliter.

Collageenase in een 0,1 molaire kaliumfosfaatbuffer met een pH van 7,4. Schud voorzichtig bij 18 graden Celsius vanwege batch-tot-batch variatie. De tijd van de collageenasebehandeling kan variëren en moet zorgvuldig worden gecontroleerd door visuele inspectie.

Om defoliatie te garanderen, blijf 15 minuten schudden of totdat de eicellen zichtbaar gescheiden zijn van de eierstok, laat de eicellen naar de bodem van het conische buisje zakken. Verwijder de oplossing en vervang deze door MBSH-buffer. Herhaal dit, was twee keer meer voor een totaal van drie wasbeurten.

Sorteer vervolgens handmatig fase drie tot vier CYTES en MBSH-buffer onder een standaardlichtmicroscoop. Fase drie cyten zijn volledig ondoorzichtig, maar wit. Terwijl fase vier cyten iets groter zijn en bespikkeld met pigment.

Cyten die enigszins transparant zijn, zijn te jong en cyten die volledig gepigmenteerd zijn of een gepolariseerde pigmentverdeling vertonen, zijn te oud. Bereid ten slotte de naalden voor micro-injectie voor met behulp van 3,5-inch capillaire buisjes en beveel de naalden af om naalden met een buitendiameter van ongeveer 0,05 millimeter te maken. Nu de mRNA-eicellen en naalden klaar zijn, gaat u door met micro-injectie.

Begin met het kalibreren van de naald met desy-water om twee nanometer per injectie te leveren. Laad de naald met behulp van een gasgestuurde micro-injector en kalibreer de druppelgrootte met behulp van een micrometer. Nadat u de voorkant hebt geladen, laadt u het RNA dat in de naald moet worden geïnjecteerd. Plaats vervolgens de gesorteerd oocyte op een injectieplaatje in MBSH-buffer, het plaatje bevat een laag zwart schuimrubber.

De witte cyte staat goed af tegen een zwarte achtergrond. Injecteer vervolgens voorzichtig elke oocyte met twee liters RNA bij 50 nanomolair. Zorg ervoor dat u elke oocyte slechts één keer injecteert en controleer de naald regelmatig op verstopping wanneer de injectie voltooid is.

Verwijder het resterende RNA, spoel de naald met desy-water en laad de volgende RNA voor injectie. Na de injectie brengt u de geïnjecteerde cyten over naar een putje van een steriele 24-putjesplaat tot een duizend. CYTES kunnen per putje worden gekweekt.

Verwijder de buffer en vervang deze door 400 microliter cyte-kweekmedium per putje. Plaats vervolgens de kweekplaat in een plastic container met een natte papieren handdoek om een vochtig milieu te behouden tijdens de kweek. Incubeer de eicellen bij 18 graden Celsius gedurende tijdstippen variërend tussen acht en 48 uur na de gewenste incubatieperiode. De eicellen kunnen worden voorbereid voor microscopie na incubatie van de geïnjecteerde eicellen.

Sorteer alle dode eicellen uit en plaats overlevende eicellen in glazen buisjes. Overleving van groter dan 90% van de eicellen wordt routinematig waargenomen. Vervang de buffer door M-E-M-F-A fixatief en schudden de cyten gedurende 20 minuten.

Bescherm de eicellen tegen zonlicht tijdens de fixatie nadat de fixatieperiode voltooid is. Was de eicellen door het fixatief te verwijderen en te vervangen door een gelijk volume MBSH-buffer. Herhaal deze wasbeurt nog eens voor een totaal van twee wasbeurten.

Was vervolgens de eicellen in anhydrisch methanol. Verwijder eerst de helft van het volume en vervang het door methanol. Herhaal dit nog twee keer.

Na deze wasbeurten verwijdert u alle oplossing en vervangt u deze door methanol. Herhaal deze methanolwas nog een keer. De gefixeerde en gedehydrateerde eicellen kunnen worden bewaard bij min 20 graden Celsius totdat ze klaar zijn om te worden afgebeeld.

Voeg vóór het afbeelden Marie's clearing medium toe aan een glasbodem WPI-fluoroschaal om het afbeeldingsoppervlak te bedekken. Breng de eicellen voorzichtig over van methanol naar de fluoroschaal, minimaliseer het volume methanol dat wordt overgebracht, beeld de eicellen af op een omgekeerde confocale microscoop, zowel een Zeiss LSM five 10 als aica TCSs P g