Name: Kristalliseren membraaneiwitten voor structuurbepaling met behulp van lipide mesofasen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-21T17:00:00.000+00:00
Duration: 22 min
Description: Leer de in meso methode voor kristallisatie van membraaneiwitten met lipide mesofasen. Dit protocol toont stapsgewijs hoe je hoogwaardige kristallen produceert voor structuurbepaling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Er zijn velen die hebben bijgedragen aan dit werk en de meeste zijn afkomstig uit de Caffrey Membrane structurele en functionele Biology Group, zowel in het verleden en de huidige leden. Om alle breiden wij onze hartelijke dank en waardering. Dit werk werd mede ondersteund door subsidies van Science Foundation Ireland (07/IN.1/B1836), de National Institutes of Health (GM75915), en de Universiteit van Limerick.

Een belangrijk aandachtspunt op het gebied van structurele en functionele biologie is de biologische membraan (figuur 1). Het membraan, die de cel en sub-cellulaire organellen indien aanwezig omringt, is een moleculair dunne structuur slechts twee lipide moleculen door en is bezaaid met eiwitten. Structuur en functie, zoals toegepast op zowel de lipide en eiwitten van belang zijn. Echter, is de focus van dit artikel beperkt tot membraaneiwitten. Een beter begrip van de manier waarop membraaneiwitten functie op een moleculair niveau wordt gevraagd om twee redenen. Ten eerste is er de intellectuele voldoening om te weten hoe ze werken. Ten tweede, door te weten hoe een eiwit werkt, is er altijd het vooruitzicht te kunnen repareren moet het storing of zelfs te verbeteren of aanpassen van het voor specifieke toepassingen. Drug design is een voor de hand liggende uitkomst van dit soort werk. Een benadering om het uitzoeken hoe een membraaneiwit werkt op moleculair niveau is om te bepalen de structuur. Dit houdt in tot oprichting van de locatie in 3-dimensionale ruimte van alle atomen, of in ieder geval alle niet-waterstofatomen, die deel uitmaken van het eiwit. De methode die wij gebruiken voor dit doel is macromoleculaire X-ray kristallografie (MX). Figuur 2 toont een voorbeeld van een membraan eiwit waarvan de structuur werd bepaald met behulp van MX. Een diffractie kwaliteit kristal van het eiwit is nodig om MX doen. Het is duidelijk, er zijn veel stappen in de structuur bepalen met behulp van macromoleculaire kristallografie. Dit wordt geïllustreerd in figuur 3. Typisch, deze omvatten het identificeren van een membraaneiwit doel, en dan produceren, zuiveren en kristalliseren het. Diffractie metingen worden uitgevoerd op het kristal met behulp van een woning of een synchrotron X-ray source. De diffractie gegevens worden verwerkt waardoor een elektronendichtheid kaart, die vervolgens wordt voorzien van een moleculair model. Het model, wanneer verfijnd, kan worden gebruikt om het werkingsmechanisme van het eiwit te verkennen en voor het structure-based drug design. De focus van dit artikel is te laten zien hoe we diffractie kwaliteit kristallen van membraan eiwitten met behulp van lipide mesofasen te produceren, door de zogenaamde in meso-methode. Een recent overzicht van de methode en het toepassingsgebied is verkrijgbaar in Referentie 1 (Caffrey, 2009). De stap-voor-stap-protocol zullen we hier volgen is beschreven in referentie 2 (Caffrey en Cherezov, 2009). Een stroomschema een overzicht van de stappen die betrokken zijn bij en de tijd die nodig is voor het opzetten van een in meso membraaneiwit kristallisatie proces is weergegeven in figuur 4. Dit artikel heeft betrekking op die stappen omsloten door onderbroken rode lijnen. Deel 1: Voorbereiden van de Kristallisatie Platen <ol><li> Plaats een gesilaniseerd microscoopglaasje op de werkbank. </li><li> Verwijder het beschermende papier deksel van een oppervlak van een strook van geperforeerde dubbele stok spacer tape (in de handel verkrijgbaar, zie Tabel van specifieke reagentia en apparatuur hieronder). </li><li> Naar beneden plaats de tape, plakkerige zijde, in contact met het oppervlak van de dia. </li><li> Druk-seal de tape aan de dia met behulp van een Brayer of roller. Aluminiumfolie kan worden geplaatst tussen de band en de roller aan de basis van de putten te beschermen. </li><li> Verwijder het tweede paper deksel van de tape in de bovenste plakkerig oppervlak bloot te leggen. </li><li> Plaats individuele gesilaniseerd dekglaasjes in de nabijheid van de plaat voor een snelle en efficiënte afdichting van putten, zodra het laden is voltooid. </li></ol> Deel 2: Voorbereiden van de Lipid spuit <ol><li> Plaats de lipide (vaak monoolein) in een temperatuur-gecontroleerde blok bij 45 ° C gedurende 3 minuten te maken is gesmolten. </li><li> Terwijl de lipide aan het smelten is voor te bereiden twee 100-pi gasdichte Hamilton spuiten voor gebruik in de lipide-eiwit mengen stap. Haal de teflon beentje van de spuit, dat het eiwit-oplossing zal bevatten. Plaats de spuit die de lipide zal houden ernaast (het verlaten van de huls op zijn plaats). </li><li> Verbind de koppeling (zie Tabel van specifieke reagentia en apparatuur hieronder en referentie 3 (Cheng et al.., 1998)) om de lipide spuit. Vinger Draai de koppeling aan de spuit, maar niet te strak aandraaien. Verwijder de zuiger uit de loop van de lipide spuit. </li><li> Merk op dat de lipide moet zijn gesmolten voordat u verder gaat. Zet de pipet op 30 pi en langzaam nemen ongeveer 30 pi van gesmolten lipide. Langzaam leveren als een groot deel van het gesmolten lipide als je kunt in het open uiteinde van de spuit zorg niet te luchtspleten te introduceren. </li><li> Plaats de zuiger in het vat in contact met het gesmolten lipide en langzaam de zuiger van tevoren op het vat met de spuit verticaal gehouden zoals blijkt in de video. Luchtbellen die per ongeluk kan worden gevangen moeten stijgen in het proces en worden vrijgegeven. </li><li> Zorgvuldig bepalen van het volume van lipiden in de spuit door het lezen van de markeringen op de spuit. </li><li> Schuif de ferrule op de naald zich uitstrekt van de koppeling. Gebruik de zuiger om het gesmolten lipide opdrijven het vat en langzaam en voorzichtig in de naald in de kern van de koppeling. </li></ol> Deel 3: Voorbereiden van de Protein spuit <ol><li> Het eiwit oplossing dient te worden gecentrifugeerd bij 14.000 g gedurende 5 tot 10 minuten bij 4 ° C om grote aggregaten te verwijderen voordat u kristallisatie onderzoeken. Verwijder het eiwit-oplossing van het ijs en laat hem in evenwicht bij kamertemperatuur. </li><li> Bereken het volume van de eiwit-oplossing te gebruiken om de kubieke fase bij te vormen of om volledige hydratatie te sluiten. Voor monoolein bij 20 ° C, volledige hydratatie met water treedt op bij bijna 40% water (massa) als in de fase diagram 5 (figuur 5). </li><li> Met een 25 of 50 pL Hamilton spuit nemen van de benodigde hoeveelheid eiwit-oplossing. Breng de oplossing op de Teflon uiteinde van de zuiger in de loop van het eiwit spuit zorg om luchtbellen te voorkomen. </li><li> Voorzichtig te trekken van de naald en meet het volume van de eiwit-oplossing in de spuit. Het moet overeenkomen met de waarde geleverd in de vorige stap. </li><li> Langzaam inch van de eiwit-oplossing tot het vat om uiteindelijk spoelen met zijn open einde. </li><li> Schroef het eiwit spuit in het open uiteinde van de koppeling aan de lipide spuit. Het is van cruciaal belang dat het apparaat niet overdreven worden aangescherpt. Over-het aandraaien van de verzamelde menginrichting in dit stadium zal schade aan de kappen en veroorzaken lekken. Onder-aanscherping zal ook leiden tot lekken. </li></ol> Deel 4: Het mengen van proteïne-oplossing en Lipid: Het maken van de mesofase <ol><li> Van kracht te mengen, vooraf de zuiger op het eiwit kant van de verzamelde mengeenheid tot het uiterste, met de duim of wijsvinger het besturen van de eiwit-oplossing uit het eiwit spuit, door middel van de koppeling en in de lipide spuit. </li><li> De zuiger aan de lipide kant wordt nu gebruikt om terug te rijden de inhoud van de lipide spuit door de koppeling en in het eiwit spuit. </li><li> Het proces wordt vele malen herhaald, af en toe, een honderd passages of meer nodig om een ​​homogene mesofase te produceren. Aan het begin van het mengen, vervoer van materiaal en weer via de koppeling kan worden onregelmatig en soms is extra kracht nodig is om effect te mengen. Initial mengen gaat meestal gepaard met de ontwikkeling van een niet-uniforme vertroebeling in het monster. Als homogenisering vordert, de textuur wordt meer uniforme en karakteristiek van de viskeuze kubieke fase, net als het uiterlijk van de opkomende kubieke mesofase. </li><li> Als de omstandigheden geschikt zijn en de kubieke fase vormt, moet de dispersie optisch transparant worden weergegeven in het reservoir zit. Daarom moet de markeringen op de spuit duidelijk leesbaar zijn door de mesofase in het vat. </li><li> Zeer lichte afkoeling van het monster tijdens het mengen door het plaatsen van de spuit mixer voor een korte tijd op het ijs kunnen versnellen homogenisering en de verwezenlijking van de doorzichtigheid. Het is echter belangrijk om niet te Overkoel het monster. </li><li> Zorg moeten worden genomen om te voorkomen dat extreem krachtig mengen, omdat dit kan leiden tot monster temperatuur te laten oplopen als gevolg van wrijving verwarming 3. </li></ol> Deel 5: Het laden van de dispenser <ol><li> Verwijder de naald en de zuiger van een 10-pi Hamilton spuit. Laat de Teflon ferrule op zijn plaats. </li><li> Verwijder de borgmoer van de dispenser met behulp van een klein muntje. </li><li> Met de ratel arm volledig teruggetrokken, plaatst u de spuit - zonder zuiger en de naald - door het houden ring van de dispenser. </li><li> Vervang de borgmoer, pakking zijde naar de spuit, en schroef het in goed op het open uiteinde van de spuit. Zorg moeten worden genomen om ervoor te zorgen de spuit goed gecentreerd op het bedrijf ring en dat het vat is parallel aan de ratel arm. Beide kunnen worden beoordeeld door het oog. Deze twee eisen zijn van cruciaal belang om lekkage te voorkomen. </li><li> Passeren van de zuiger door de aangrijpende ring met de grijper moer losgeschroefd een paar slagen en begeleiden de zuiger in het open uiteinde van de spuit. Trap het ratel arm. Verplaats de zuiger in de cilinder en controleer of het reizen vrij en waar in het vat. Het kan helpen om de schroef los van het zaagblad aan de zuiger vrij bewegen te vergemakkelijken. Zorg ervoor dat het doet. Druk de zuiger totdat de Teflon tip lijn ligt met de nul-il streep op het vat. Als de schroef van het zaagblad was los, draai het en controleer dat de zuiger vrij kan bewegen. </li><li> Verplaats de zuiger aan de ene kant van de verzamelde mengeenheid om de nul ui deelstreep aan de mesofase naar de andere spuit en de koppeling. </li><li> Koppel de lege spuit (met de huls op zijn plaats) van de meng-unit en sluit onmiddellijk de geladen spuit - met de koppeling eenttached - de schroefdraad beëindiging van de 10-pi doseren spuit. De mate van dichtheid waarmee koppeling wordt gedaan is van cruciaal belang, zoals reeds vermeld. </li><li> Laad de verstrekking spuit door het indrukken van de zuiger van de 100-il spuit, zodat de mesofase transfers via de koppeling. </li><li> Veilige een korte, platte punt naald om de stalen beëindiging van de verstrekking spuit en draai voorzichtig op zijn plaats. </li><li> Klem de zuiger naar de ratel arm door het aandraaien van de moer in de pakkende ring. Zorg ervoor dat u niet over-draai de moer, want dit kan scoren en vervormen van de zuiger waardoor deze onbruikbaar wordt. Het is belangrijk dat het traject aan de ratel arm in de geklemde toestand worden beperkt tot niet meer dan een centimeter, zoals blijkt in de video. Afgezien van deze, zal de zuiger de neiging hebben om gesp en levering kan falen. </li><li> Druk op de ratel trommel een paar keer aan de zuiger vooruitgang in het vat, waardoor het vullen van het dode volume van de naald en het laden van de naald. Deze stap moet worden herhaald (tot tien keer) tot een continue reeks van de mesofase blijkt uit de punt van de naald. </li><li> Kristallisatie onderzoeken dient onmiddellijk te beginnen, omdat sommige eiwitten zijn instabiel in de kubieke fase zonder toegevoegde neerslagmiddel. </li></ol> Deel 6: Het opzetten van Kristallisatie Platen <ol><li> Plaats een multi-well plaat en kristallisatie dekglaasje op een oppervlak een paar centimeter boven de werkbank verhoogd voor het gemak van het laden. Een optimaal contrast en verbeterde zichtbaarheid worden bereikt wanneer het oppervlak is iets donkerder. </li><li> Homogeniseer de neerslag oplossingen en verkondigen van de flacons. Stel de neerslag dispenser pipet om een ​​ui. </li><li> Met de verstrekking spuit verticaal gehouden in de ene hand, gebruik dan de vrije hand om de punt van de naald in het centrum en direct boven de basis van goed nummer 1 positie. Druk op de knop op de herhalende dispenser om een ​​bolus van mesofase verdrijven op het glas oppervlak. De bolus volume is 200 nL wanneer de standaard te herhalen dispenser wordt gebruikt met een 10-pi spuit. De tip van de naald mag niet meer dan een paar honderd micrometer boven de basis van het goed om een ​​goede levering te garanderen. </li><li> Na vier aangrenzende putten worden geladen met mesofase, plaats een ul neerslagmiddelen oplossing op de top van elke mesofase bolus met behulp van een 2-il pipet en standaard wegwerp tips. </li><li> Zo snel mogelijk, vierkant plaats een dekglaasje over de gevulde putten gelijkmatig dek ze af. Voor het uitvoeren van een waterdichte afdichting, gebruik een spatel om druk uit te oefenen op de dekglaasje waar hij contact maakt met de blootgestelde plakkerige oppervlak van de spacer tape. </li><li> De mesofase en neerslagmiddelen dosering proces kan worden herhaald totdat alle putjes op de plaat worden geladen en verzegeld. </li><li> Duidelijk label de plaat voor het bijhouden doeleinden. Lichtgevoelige eiwitten worden meestal behandeld door de platen wikkelen in aluminiumfolie alvorens ze in de incubatiekamer. </li><li> Leg de platen in een temperatuur-gecontroleerde ruimte, meestal bij 20 ° C. </li><li> Op een regelmatig schema, inspecteer de putten voor kristalgroei het gebruik van een gepolariseerd licht microscoop met een 10 of 20-voudige doelstelling. Het schema wordt gebruikt in het labo van de auteur is als volgt: dag 0, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 21, 30 en 60 post-setup. Inspecteer zorgvuldig de mesofase bolus het aanpassen van de diepte van de focus binnen de 0,14 mm dikke monster. Onderzoek moet worden gedaan, zowel in normaal licht en tussen de gekruiste polarisatoren-. </li></ol> Deel 7: representatieve resultaten Het uiterlijk van de resulterende kristallen zal variëren met de inherente kleur van het membraan eiwit, de polarisatie van het licht gebruikt voor inspectie van (of het gebrek daarvan) en de methode en de kwaliteit van de verlichting. Figuur 6 toont een aantal mogelijke kristal optredens. Natuurlijk gekleurde membraaneiwitten groeien in meso wanneer bekeken met normaal licht kunnen lijken op die in figuur 6 (Panels b en d). Kleurloze membraaneiwit kristallen groeien in de kubieke fase waarin bekeken met een normale licht kunnen lijken op die in figuur 6 (Panel e). Ten slotte kunnen kleurloze membraaneiwit kristallen groeien in meso wanneer bekeken met gepolariseerd licht zien als in figuur 6 (Panels a en c). De volgende stappen in het totale proces van structuur vastbesloten zijn om te oogsten en cryo-cool de kristallen en op te nemen en X-ray diffractie analyseren van hen. Deze onderwerpen worden behandeld in afzonderlijke Jupiter artikelen. <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Schematische voorstelling van een biologisch membraan met de lipide dubbellaag in en op die gelegen zijn een verscheidenheid van eiwitten. <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. De structuurvan de vitamine B-12 transport van eiwitten, BtuB, opgelost met behulp van MX en kristallen gegroeid door de in meso methode 6 geïllustreerd in dit artikel Jupiter. <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. De structuur-functie cyclus illustreert veel van de stappen die betrokken zijn bij het ​​verkrijgen en het gebruik volledige structurele informatie over een eiwit. <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Het stroomschema samenvatting van de stappen betrokken bij de productie van membraan eiwitkristallen door de in meso methode. Alleen die stappen, omgeven door de gestippelde rode lijn komen aan bod in dit artikel Jupiter. Van Reference 2. <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig5.jpg" alt="Figuur 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 5"> Figuur 5. Een vereenvoudigde temperatuur-samenstelling fase diagram voor de lipide (monoolein) / water-systeem. Kristallisatie onderzoeken zijn ingesteld op 20 ° C, waar de lipide verzadigd raakt met water op 40% hydratatie. De gedetailleerde fasediagram is verkrijgbaar in Reference 5. <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig6.jpg" alt="Figuur 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 6"> Figuur 6. Kristallen van membraaneiwitten groeien in de lipidische mesofase. (A) vitamine B-12 transport van eiwitten, BtuB 6, (b) light-harvesting complex II 7, (c) de adhesine / invasin OPCA 8, (d) bacteriorhodopsin 9, (e) een koolhydraat transporter van Pseudomonas. Beelden die met normaal licht (b, d, e) en tussen gekruiste polarisatoren (a, c).

<ol><li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+for+structure+determination.+Use+of+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins for structure determination. Use of lipidic mesophases.</a> Annu. Rev. Biophys. 38, 29-51 (2009).</li>
<li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallising+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Crystallising membrane proteins in lipidic mesophases.</a> Nat. Protoc. 4, 706-731 (2009).</li>
<li>Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+mechanical+mixer+for+small+viscous+lipid-containing+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Phys.+Lipids%22%5BJournal%5D)">A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples.</a> Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).</li>
<li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano-volume+plates+with+excellent+optical+properties+for+fast%2C+inexpensive+crystallization+screening+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Cryst%22%5BJournal%5D)">Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins.</a> J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).</li>
<li>Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phase+diagram+of+the+monoolein%2Fwater+system%3A+metastability+and+equilibrium+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The phase diagram of the monoolein/water system: metastability and equilibrium aspects.</a> Biomaterials. 21, 223-234 (2000).</li>
<li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+meso+structure+of+the+cobalamin+transporter%2C+BtuB%2C+at+1.95+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In meso structure of the cobalamin transporter, BtuB, at 1.95 A resolution.</a> J. Mol. Biol. 364, 716-734 (2006).</li>
<li>Cherezov, V., Clogston, J., Papiz, M. Z., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Room+to+move%3A+crystallizing+membrane+proteins+in+swollen+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Room to move: crystallizing membrane proteins in swollen lipidic mesophases.</a> J. Mol. Biol. 357, 1605-1618 (2006).</li>
<li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+meso+crystal+structure+and+docking+simulations+suggest+an+alternative+proteoglycan+binding+site+in+the+OpcA+outer+membrane+adhesin%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%22%5BJournal%5D)">In meso crystal structure and docking simulations suggest an alternative proteoglycan binding site in the OpcA outer membrane adhesin.</a> Proteins. 71, 24-34 (2008).</li>
<li>Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robotic+system+for+crystallizing+membrane+and+soluble+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases.</a> Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 60, 1795-1807 (2004).</li>
</ol>

De kubieke fase is een delicate en dynamische omgeving die drastisch kan veranderen met de wijziging van een aantal variabelen. Het is niet mogelijk om een beschrijving van de opzet van in meso-kristallisatie onderzoeken in de handmatige modus die alle potentiële valkuilen beschrijft. Echter, veel problemen worden voorkomen door het beoefenen van de techniek alvorens het naar dure eiwit-oplossingen en door het gebruik matiging druk uitgeoefend op spuiten tijdens het mixen. Correct gedaan, de in meso-methode kan kristallen van een breed scala aan eiwitten opleveren, is het aantal waaraan steeds meer. De hier gegeven beschrijving van de opzet van in meso-kristallisatie onderzoeken is gericht op de handmatige modus. Het proces kan worden, en vaak wordt aangepast om automatisch instellen van de kristallisatie platen te vergemakkelijken in die gevallen dat grootschalige screening van kristallisatie omstandigheden vereisen.

* Volledige details voor het bewerken van uw eigen nauwe boring Coupler zijn voorzien in Reference 3.

kristalliseren membraaneiwitten voor structuurbepaling met behulp van lipide mesofasen

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Een gedetailleerd protocol voor het kristalliseren van membraaneiwitten door gebruik te maken lipidische mesofasen wordt beschreven. Deze methode is op verschillende manieren wordt aangeduid als de lipidische kubieke fase of in meso-methode. De methode is aangetoond dat het heel veelzijdig in dat het is gebruikt om de X-ray kristallografische structuren van prokaryote en eukaryote eiwitten, eiwitten die monomere, homo-en hetero-multimere, chromofoor-bevattende en de chromofoor-vrij op te lossen, en alfa -helix en beta-vat eiwitten. Recente successen met behulp van in meso kristallisatie zijn de menselijke ontworpen beta2-adrenerge en adenosine A2a G-eiwit gekoppelde receptoren. Protocollen worden gepresenteerd voor het bereiden van de membraaneiwit in de monoolein-based mesofase, en voor het opzetten van kristallisaties in de handmatige modus. Extra stappen in het totale proces, zoals kristal oogsten, moeten worden aangepakt in de toekomst video artikelen. De tijd die nodig is om het eiwit geladen mesofase te bereiden en het opzetten van een kristallisatie-plaat handmatig is ongeveer een uur.

Hierin wordt beschreven de procedure geïmplementeerd in de Caffrey Membrane Structurele en Functionele Biologie Groep handmatig in te stellen tot kristallisatie onderzoeken van membraaneiwitten in lipide mesofasen.

Kristalliseren membraaneiwitten voor structuurbepaling met behulp van lipide mesofasen

Er wordt een gedetailleerd protocol beschreven voor het kristalliseren van membraaneiwitten met behulp van lipide mesofasen. Deze methode is op verschillende manieren aangeduid als de ...

Hallo en welkom bij de Membrane Structural and Functional Biology Group. Mijn naam is Martin Caffery. De focus van ons onderzoek ligt op het biologisch membraan, waarvan het schema op de eerste dia wordt getoond; het membraan dat de cel en, indien aanwezig, subcellulaire organellen omringt, is een moleculair dunne structuur, slechts twee lipidemoleculen dik en bezet met eiwitten.Wij zijn geïnteresseerd in de structuur en functies die van toepassing zijn op zowel lipiden als eiwitten. Voor deze JO-serie zal ik mijn focus echter beperken tot membraaneiwitten. Wij streven ernaar te begrijpen hoe deze membraaneiwitten op moleculair niveau functioneren om twee redenen.Ten eerste is er de intellectuele voldoening van het weten hoe iets werkt. Ten tweede is er, net als bij uw fiets of auto, door te weten hoe het werkt de mogelijkheid om het te repareren als het defect raakt. Geneesmiddelenontwerp is een voor de hand liggend resultaat van dit type werk.De aanpak die wij hanteren om te achterhalen hoe een membraaneiwit op moleculair niveau functioneert, is het bepalen van de kristallografische structuur ervan. Dit houdt in dat de positie in de driedimensionale ruimte van alle atomen, of op zijn minst alle niet-waterstofatomen die het eiwit vormen, wordt vastgesteld. De methode die we hiervoor gebruiken wordt macromoleculaire röntgendiffractie genoemd, afgekort als MX.Hier zien we een voorbeeld van een membraaneiwit waarvan de structuur is bepaald met MX; voor MX is een kristal van het eiwit van een bepaalde kwaliteit vereist. Zoals u zich kunt voorstellen, zijn er veel stappen betrokken bij structurele bepaling met behulp van macromoleculaire kristallografie, zoals hier geïllustreerd. Deze omvatten doorgaans het identificeren van een membraaneiwit-doelwit en vervolgens het produceren, zuiveren en kristalliseren ervan.Diffractiemetingen worden op het kristal uitgevoerd met behulp van een eigen röntgenbron of een synchrotron-röntgenbron. De diffractiegegevens worden verwerkt, wat resulteert in een elektronendichtheidskaart, die vervolgens wordt gefit met een moleculair model. Het model kan na verfijning worden gebruikt om het werkingsmechanisme van het eiwit te onderzoeken en voor structuurgebaseerd geneesmiddelontwerp.Het doel van dit JoVE-artikel is om te laten zien hoe we kristallen van membraanproteïnen van fractiekwaliteit produceren met behulp van lipide mesofasen via de zogenaamde in meso-methode. Een recente review van de methode en de reikwijdte ervan is beschikbaar in referentie één. Het stapsgewijze protocol dat we hier zullen volgen is beschreven in referentie twee; een stroomdiagram dat de betrokken stappen en de benodigde tijd voor het opzetten van een in meso-kristallisatie-experiment voor membraanproteïnen samenvat, wordt hier getoond.Deze video behandelt de stappen die zijn omkaderd door rode stippellijnen. De handelingen die u moet uitvoeren voor meso-kristallisatie in de handmatige modus worden hier getoond. Deze omvatten een geconcentreerde oplossing van het gezuiverde membraaneiwitlipide voor het creëren van de gastheer-mesofase, meestal monooleïn om het lipide duidelijker zichtbaar te maken.In deze video zijn de volgende benodigdheden gebruikt: oplossingen van rode kleurstofprecipitanten, pipetteerapparaten voor gezuiverd water en wegwerptips, een assortiment gasdichte Hamilton-spuiten (sommige met afneembare naalden), een nauwe koppeling om de eiwitoplossing met het lipide te mengen voor de productie van de mease, een herhaaldispenser van Hamilton, glazen microscoopglaasjes en dekglasjes, bij voorkeur gesiliconiseerde geperforeerde dubbelzijdige afstandhouderstape voor het maken van wells, pincetten, crushed ijs, tissues, een rekenmachine en, bovenal, uw laboratoriumnotitieboek.De volgende procedure wordt gebruikt om een glazen sandwich-kristallisatieplaat te bereiden. Plaats voor het laden een gesilicatiseerde microscopiglasklaartje op de werkbank. Verwijder de beschermende papieren laag van één zijde van een strook geperforeerde dubbelzijdige afstandhoudende tape.Plaats de tape met de plakzijde naar beneden op het oppervlak van het objectglas. Druk de tape stevig op het objectglas aan. Er kan aluminiumfolie tussen de tape en de roller worden geplaatst bij gebruik van een brayer of roller om de bodem van de wells te beschermen.Verwijder de tweede papieren afdekking van de tape om het bovenste kleverige oppervlak bloot te leggen. Deze procedure resulteert in een glasplaat die klaar is voor het laden en het daaropvolgende afdekken; zodra het laden is voltooid, kunnen de individueel gesiloiseerde dekglasjes in directe nabijheid van de plaat worden geplaatst voor een snelle en efficiënte afdekking van de wells.Plaats het lipide in een temperatuurgecontroleerd blok bij 45 °C gedurende drie minuten om het te smelten. Let op dat het gebruikte lipide doorgaans mono land is. In deze video is er een rode kleurstof aan het lipide toegevoegd voor de zichtbaarheid tijdens het smelten.Bereid twee gasdichte Hamilton-spuiten van 100 µL voor voor gebruik. Verwijder bij de stap voor het mengen van lipide-eiwitten de Teflon-olie uit de spuit die de eiwitoplossing zal bevatten. Plaats de spuit voor het lipide daarnaast. In dit geval blijft de olie op zijn plaats.Plaats de koppeling met kleine boring tussen de twee spuiten en verbind de koppeling vervolgens met de aansluiting van de lipidspuit. Draai de koppeling vast op de spuit, maar draai deze niet te strak aan. Verwijder de zuiger uit de cilinder van de lipidspuit.Zorg ervoor dat het lipide gesmolten is. Stel de pipet in op 30 µL en neem langzaam 30 µL gesmolten lipide op vanuit het dopje. De lipide-vial.De lipide dient onder stikstof of argon bij min 80 graden Celsius te worden bewaard. Breng langzaam zoveel mogelijk van de gesmolten lipide over in het open uiteinde van de spuit, waarbij zorgvuldig wordt voorkomen dat er luchtbellen ontstaan.Plaats de zuiger in de cilinder in contact met het gesmolten lipide en beweeg de zuiger langzaam omhoog in de cilinder terwijl de spuit verticaal wordt vastgehouden. Zoals getoond, stijgt de onbedoeld ingesloten luchtbel tijdens dit proces en ontsnapt deze. We hebben nu een plug gesmolten lipide in de cilinder waarvan u het volume nauwkeurig moet bepalen.Dit kan worden gedaan door de markeringen op de spuitcilinder af te lezen. In dit geval is het volume 23 microliters, wat wordt genoteerd in het labjournaal. Schuif de vacht over de naald die uit de koppeling steekt.Gebruik de zuiger om het gesmolten lipide door de cilinder en langzaam en voorzichtig in de naald in de kern van de koppelaar te drukken. Als de naald enigszins te vol is, zal het lipide aan het open uiteinde naar buiten komen. Door de zuiger iets terug te trekken, kan het overtollige lipide in de koppelaar worden teruggezogen totdat het precies gelijk ligt met de punt van de naald van de koppelaar.In dit geval is de spuitkoppelingseenheid volledig geladen en klaar om te worden gecombineerd met de eiwitspuit. De oplossing moet 10 min bij 14.000 G gecentrifugeerd worden, vijf tot 10 minuten bij vier graden Celsius, om grote aggregaten te verwijderen. Haal de eiwitoplossing uit de ijsbak en laat deze equilibreren bij kamertemperatuur voordat de kristallisatieproeven worden opgezet.Bereken het volume proteïne-oplossing dat nodig is om de kubische fase te vormen bij of nabij volledige hydratatie voor olean bij 20 °C. Volledige hydratatie met water vindt plaats bij ongeveer 40% gewichtsprocent water, zoals aangegeven in het fasediagram. Houd er rekening mee dat we de lipidspuit hebben gevuld met 23 µL mono bij een dichtheid van 0,94 mg/µL.Dit komt overeen met 21,6 milligram lipiden; dus 21,6 maal vier gedeeld door zes, oftewel 14,4 milligram of 14,4 microliter eiwitoplossing is nodig. Neem met een Hamilton-spuit van 25 of 50 microliter het benodigde volume eiwitoplossing op en breng de oplossing over op de Teflon-tip van de zuiger in de cilinder van de eiwitoplossing. Trek de naald voorzichtig terug, waarbij u erop let dat er geen luchtbellen ontstaan, en meet het volume eiwitoplossing in de spuit. Dit moet overeenkomen met de waarde uit de vorige stap.Ter voorbereiding op het combineren met de met lipiden gevulde spuit. Verschuif de eiwitoplossing voorzichtig naar boven in de cilinder tot deze gelijk ligt met het open uiteinde. Dit kan worden gecontroleerd door door het uiteinde van de cilinder te kijken.De lipide- en proteineloplossingen in de gevulde spuiten kunnen nu worden gecombineerd. Draai hiervoor de eiwitspuit in het open uiteinde van de koppeling die aan de lipidespuit is bevestigd. Nadat de twee spuiten via de koppeling zijn verbonden, moet er een continu volume vloeistof aanwezig zijn, vanaf de lipiden in de ene spuit via de koppeling tot de proteineloplossing in de andere spuit.Ter voorbereiding op het mengen wordt de gemonteerde eenheid vastgehouden met één spuit in de rechterhand en de andere in de linkerhand. Er wordt koppel uitgeoefend op beide cilinders via de koppeling, waarbij de vingers en duimen van beide handen worden gebruikt om ervoor te zorgen dat de afdichting tegen de groeven in de koppeling intact blijft tijdens het vastdraaien. Een in dit stadium onjuist gemonteerd mengapparaat zal het ALS beschadigen en lekkage veroorzaken; overmatig vastdraaien zal eveneens tot lekkage leiden.Het is een kwestie van ervaring, met de onvermijdelijke methode van trial-and-error en het incidentele verlies van monsters. Daarom is het zinvol om eerst te oefenen met lipiden en water of een bufferoplossing om een gevoel voor het systeem te krijgen voordat men waardevolle eiwitoplossingen gebruikt om te mengen; duw de zuiger aan de eiwitzijde van de gemonteerde mengunit met de duim of wijsvinger tot de limiet, waardoor de eiwitoplossing uit de eiwitspuit via de koppeling in de lipidenspuit wordt gedreven. Als de unit effectief is afgedicht, zal deze actie een gelijke en tegengestelde beweging van de zuiger aan de lipidenzijde veroorzaken.De zuiger aan de lipidzijde wordt nu gebruikt om de inhoud van de lipidspuit terug door de koeler en in de eiwitspuit te drukken. Dit proces wordt herhaaldelijk uitgevoerd. Soms zijn honderd passages of meer nodig om een homogene misa-fase te verkrijgen.Aan het begin van het mengen kan de beweging van het materiaal heen en weer door de koppeling ongelijkmatig zijn, waardoor er soms extra kracht nodig is om het mengen te bewerkstelligen. Dit is te verwachten. De initiële menging gaat meestal gepaard met de vorming van een niet-uniforme troebeling in het monster, wat eveneens wordt verwacht.Naarmate de homogenisatie vordert, wordt de textuur, zoals waargenomen door de kracht die nodig is om de zuigers heen en weer te bewegen, uniformer en kenmerkend voor de viskeuze kubische fase, evenals het visuele aspect van de ontstane kubische fase. Indien de omstandigheden passend zijn en de kubische fase zich vormt, moet de dispersie er optisch transparant uitzien in de spuitcilinder.De markeringen op de spuitcilinder moeten dus duidelijk leesbaar zijn door de mesofase in de cilinder. In het geval van gekleurde eiwitten heeft de mesofase de kleur van het eiwit, maar blijft deze optisch transparant. Het zeer licht koelen van het monster tijdens het mengen door de spuitmenger korte tijd op ijs te plaatsen, kan de homogenisatie en het bereiken van transparantie versnellen.Het is echter belangrijk om het monster niet overmatig te mengen; er moet voorzichtigheid worden betracht om extreem krachtig mengen te vermijden, aangezien dit kan leiden tot een stijging van de monstertemperatuur door wrijvingswarmte. Op dit punt is de cubische mesofase gevormd en is het eiwit gereconstitueerd in de lipide dubbellaag. De mesofase is nu klaar om in de individuele putjes van de kristallisatieplaten te worden gedoseerd.Eerst moet de meso-fase echter worden overgebracht naar een Hamilton-spuit van 10 µL die is gemonteerd op een repeterende dispenser. Begin dit proces door de spuit aan de dispenser te koppelen. Vul de spuit met de kubische meso-fase.Verwijder de naald en de zuiger uit de spuit. Laat de Teflon-ring op zijn plaats. Verwijder de borgmoer van de dispenser met behulp van een kleine munt.Zorg dat de palarm volledig is ingetrokken. Plaats de spuit zonder zuiger en naald door de houdring van de dispenser. Plaats de borgmoer met de pakking naar de spuit toe en draai deze stevig vast op het open uiteinde van de spuit.Er moet zorgvuldig worden gecontroleerd of de spuit correct in het midden van de houdering is geplaatst en of de cilinder parallel aan de palletarm is uitgelijnd. Beide kunnen door I worden beoordeeld. Deze twee vereisten zijn belangrijk, omdat er anders druk kan ontstaan in de bronspuit tijdens het laden als de zuiger niet vrij beweegt, wat kan leiden tot lekkage. Voer de zuiger met de grijpmoer, enkele slagen loss gedraaid, door de grijpring en geleid de zuiger in het open uiteinde van de spuit.Druk de ratelarm volledig in om de zuiger in de cilinder te bewegen en controleer of deze ongehinderd en volledig door de cilinder kan bewegen. Indien de schroef en de geleidestang waren losgedraaid, draai deze dan opnieuw vast en controleer opnieuw of de zuiger vrij kan bewegen. De doseerspuit is nu klaar om te worden geladen.Beweeg de zuiger aan één zijde van de gemonteerde mengunit naar de nul microliter-graduatiemarkering. Om de mesofase over te brengen naar de andere spuit en de koppelaar. Koppel de lege spuit, met de UL op zijn plaats, los van de mengunit en verbind onmiddellijk de geladen spuit, met de bevestigde koppelaar, met de schroefdraadaansluiting van de 10 microliter doseerspuit.De mate van stevigheid waarmee de koppeling wordt uitgevoerd is van kritiek belang. Zoals reeds vermeld, wordt de doseerspuit gevuld door de zuiger van de 100 microliter spuit in te drukken, zodat de meso-fase via de koppelaar wordt overgedragen. Als de koppeling stevig is en de zuiger in de doseerspuit vrij kan bewegen, dan moet de zuiger in de richting van de beweging van de vulzuiger beginnen te bewegen naarmate de doseerspuit zich vult.Koppel de laadspuit met de bevestigde koppeling los van de doseerspuit. Bevestig een korte naald met een platte punt aan de stalen aansluiting van de doseerspuit en draai deze voorzichtig vast. Klem de zuiger aan de ratelarm door de knoop in de grijpring aan te trekken.Er moet erop worden gelet dat de knoop niet te strak wordt aangetrokken, omdat dit de zuiger kan beschadigen en vervormen, waardoor deze onbruikbaar wordt. Het is belangrijk dat de bewegingsruimte van de ratelarm in geklemde toestand beperkt blijft tot maximaal een inch.Zoals hierna wordt getoond, zal de zuiger de neiging hebben om door te buigen en kan de afgifte mislukken. Druk meerdere keren op de ratelcilinder om de zuiger in de cilinder naar voren te bewegen, waardoor het lege volume van de naald wordt gevuld en de naald wordt geladen. Deze stap moet tot 10 keer worden herhaald totdat er een continue draad van de mesa-fase uit de punt van de naald komt.De naald is nu klaar voor gebruik bij het opzetten van crystallisatieproeven, welke onmiddellijk moeten worden gestart. Het is niet aanbevolen om de met proteïne geladen kubische fase te lang te bewaren voordat de crystallisatieproeven worden opgezet. Omdat sommige proteïnen onstabiel zijn in de kubische fase zonder toegevoegd precipitant, plaatst u een multi-well crystallisatieplaat en een dekglas op een oppervlak dat enkele inches boven de workbench is verhoogd om het laden te vergemakkelijken.Optimaal contrast en verbeterde zichtbaarheid worden bereikt wanneer het oppervlak licht donker is. Homogeniseer de precipitante-oplossingen en verwijder de doppen van de vials. Stel de dispenser voor de precipitant in op één µL; houd de doseerspuit met één hand verticaal en gebruik de vrije hand om de naaldpunt in het midden en direct boven de bodem van de well te positioneren.Stap één. Druk op de knop van de herhalende dispenser om een bolus van de vloeistof op het glasoppervlak te brengen. Het volume van de bolus is 200 nanoliters.Wanneer de standaard herhalende dispenser wordt gebruikt met een spuit van 10 µL, moet de punt van de naald niet meer dan enkele honderden µm boven de bodem van het putje zich bevinden. Om een correcte aflevering te waarborgen, is een reproduceerbare aflevering eenvoudig te bereiken; dit vereist enkel wat oefening. Nadat de vier aangrenzende putjes met mease zijn gevuld, wordt er 1 µL precipitantoplossing bovenop elke mease-bolus geplaatst.Plaats met behulp van een pipet van twee microliter en standaard wegwerptips zo snel mogelijk een dekglas recht over de gevulde putjes, zodat deze gelijkmatig worden afgedekt om een waterdichte afsluiting te bewerkstelligen. Gebruik een spatel om druk uit te oefenen op het dekglas op de plaatsen waar het in contact komt met het blootgestelde kleverige oppervlak van de afstandhouder-tape. Het proces van het toevoegen en dispenseren van het precipitaat kan worden herhaald totdat alle putjes op de plaat zijn gevuld en afgesloten.De plaat is nu klaar voor inspectie en incubatie. Label de plaat duidelijk voor trackingdoeleinden. Lichtgevoelige eiwitten worden gewoonlijk behandeld door de platen in aluminiumfolie te wikkelen voordat ze in de incubatiekamer worden geplaatst.Deze kunnen worden verwijderd en onder de microscoop worden onderzocht bij gedimd of passend gekleurd licht. Plaats de platen op regelmatige basis in een temperatuurgecontroleerde kamer, gewoonlijk bij ongeveer 20 °C. Inspecteer de wanden op kristalgroei met behulp van een polarisatiemicroscoop met een 10x of 20x objectief.Doelstelling: het schema dat in het laboratorium van de auteur wordt gebruikt is als volgt: dag 0, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 21, 30 na het zetten. Inspecteer de mease-bolus zorgvuldig. Pas de scherptediepte aan binnen het monster van 140 micron dik.De inspectie dient zowel onder normaal licht als tussen gekruiste polarisatoren te worden uitgevoerd; kleurloze membraaneiwitkristallen die groeien in de kubische fase zien er onder normaal licht zo uit. Kleurloze membraaneiwitkristallen die groeien in meso zien er onder gepolariseerd licht zo of zo uit, en natuurlijk gekleurde membraaneiwitten die groeien in meso zien er onder normaal licht zo of zo uit.De volgende stappen in het algemene proces van structuurbepaling zijn het oogsten en cryogeen koelen van de kristallen, en het opnemen en verwerken van de röntgendiffractie daarvan. Deze onderwerpen worden behandeld in afzonderlijke JoVE-artikelen in deze serie.

crystallizing-membrane-proteins-for-structure-determination-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Evaluatie van twee-dimensionale (2D) kristallisatie onderzoeken voor de vorming van de bestelde membraaneiwit arrays is een zeer kritische en moeilijke taak in elektron kristallografie. Hier beschrijven we onze aanpak in het screenen en identificeren van 2D-kristallen van overwegend kleine membraaneiwitten in de range van 15 - 90kDa.

Het beoordelen van twee-dimensionale Kristallisatie Trials van kleine membraaneiwitten voor Structurele Biologie Studies van Electron Kristallografie

De protocollen beschrijven de essentiële stappen voor het verkrijgen van diffractie kwaliteit kristallen van een membraaneiwit vanaf reconstructie van het eiwit in een lipidische kubieke fase (LCP), het vinden van de eerste voorwaarden met LCP-FRAP pre-kristallisatie assays, het opzetten van LCP kristallisatie onderzoeken en oogsten kristallen .

Kristallisatie van membraaneiwitten in lipide mesofasen

Bicelles zijn lipide / amfifiele mengsels die membraaneiwitten (MP's) te behouden binnen een lipide bilaag, maar hebben een unieke fase gedrag dat high-throughput screening vergemakkelijkt door kristallisatie robots. Deze techniek heeft met succes geproduceerd een aantal hoge resolutie structuren van zowel prokaryotische en eukaryotische bronnen. Deze video beschrijft protocollen voor het genereren van de lipidische bicelle mengsel, waarin parlementsleden in de bicelle mengsel, het opzetten van...

High-throughput Kristallisatie van membraaneiwitten Met behulp van de lipidische Bicelle Method

Hierin beschreven een robot benadering high-throughput kristallisatie van membraaneiwitten in lipidische mesofasen voor gebruik in structuurbepaling met macromoleculaire X-ray kristallografie. Drie robots staat de behandeling van de viskeuze en kleverige eiwit beladen mesofase een integraal onderdeel van de methode worden geïntroduceerd.

Gebruik van een robot voor High-throughput Kristallisatie van membraaneiwitten in lipide mesofasen

Hierin beschreven procedures uitgevoerd in de Caffrey Membrane Biology Structurele en functionele groep te oogsten en cryo-cool membraaneiwit kristallen gegroeid lipidische kubieke spons fasen voor gebruik in structuurbepaling met macromoleculaire X-ray kristallografie.

Oogst en Cryo-koeling kristallen van membraaneiwitten Grown in lipide mesofasen voor structuurbepaling door Macromoleculaire Kristallografie

Procedures voor volledige reconstructie van een prototype voltage-gated kalium kanaal in lipide membranen beschreven. De gereconstitueerde kanalen zijn geschikt voor biochemische assays, elektrische opnamen ligand screening en elektronenmicroscopie kristallografische studies. Deze methoden kunnen hebben algemene toepassingen om de structurele en functionele studies van andere membraaneiwitten.

Reconstructie van een Kv kanaal in Lipid Membranen voor structurele en functionele studies

β-vat buitenmembraaneiwitten (OMP's) hebben veel functies binnen de buitenmembraan van gramnegatieve bacteriën, mitochondriën en chloroplasten. Hier hopen we een bekende knelpunt in structurele studies te verlichten door protocollen te presenteren voor de productie van β-vat OMP's in voldoende hoeveelheden voor structuurbepaling door röntgenkristallografie of NMR-spectroscopie.

Van Constructen naar Crystals - Naar Structuur Bepaling van β-barrel Outer Membrane Proteins

We beschrijven procedures voor de bereiding en aflevering van membraaneiwitmicrokristallen in lipidische kubieke fase voor seriële kristallografie bij röntgenvrije-elektronlasers en synchrotronbronnen. Deze protocollen kunnen ook worden toegepast voor de incorporatie en aflevering van oplosbare eiwitmicrokristallen, wat leidt tot een aanzienlijk verminderde sampleconsumptie in vergelijking met vloeibare injectie.

Voorbereiding en Levering van Protein Microcrystals in lipidische Cubic fase voor Serial Femtoseconde Kristallografie

Lipide monolagen worden al tientallen jaren gebruikt als basis voor het vormen van tweedimensionale (2D) eiwitkristallen voor structurele studies. Ze zijn stabiel op het lucht-water interface en kunnen dienen als een dun ondersteunend materiaal voor elektronenbeeldvorming. Hier presenteren we de bewezen stappen voor het voorbereiden van lipide monolagen voor biologische studies.

Monstervoorbereiding met behulp van een lipide monolaagmethode voor elektronenkristallografische studies

Dit protocol beschrijft een opstelling voor de kristallisatie van de steroltransporter ABCG5/G8. ABCG5/G8 wordt gereconstitueerd tot bicelles voor kristallisatie met hangende druppels. Het protocol vereist geen gespecialiseerde materialen of substraten, waardoor het toegankelijk en gemakkelijk aan te passen is in elk laboratorium voor het bepalen van de eiwitstructuur door middel van röntgenkristallografie.

ABCG5/G8-kristallisatie in een lipidenbicelle-omgeving voor röntgenkristallografie

Leer de in meso methode voor kristallisatie van membraaneiwitten met lipide mesofasen. Dit protocol toont stapsgewijs hoe je hoogwaardige kristallen produceert voor structuurbepaling.

Kristalliseren membraaneiwitten voor structuurbepaling met behulp van lipide mesofasen

Meer video's verkennen