Kristalliseren membraaneiwitten voor structuurbepaling met behulp van lipide mesofasen
21 november 2010
Hierin wordt beschreven de procedure geïmplementeerd in de Caffrey Membrane Structurele en Functionele Biologie Groep handmatig in te stellen tot kristallisatie onderzoeken van membraaneiwitten in lipide mesofasen.
Hallo en welkom bij de Membrane Structural and Functional Biology Group. Mijn naam is Martin Caffery. Het focus van ons onderzoek is de biologische membraan, waarvan het schema op de eerste dia wordt getoond, het membraan dat de cel en subcellulaire organellen omringt en aanwezig is een moleculair dunne structuur, slechts twee lipidemoleculen dik en bezaaid met eiwitten.
We zijn geïnteresseerd in structuur en functies toegepast op zowel lipiden als eiwitten. Voor de doeleinden van deze JO-serie zal ik mijn focus echter beperken tot membraaneiwitten. We streven ernaar te begrijpen hoe deze membraaneiwitten functioneren op moleculair niveau om twee redenen.
Ten eerste is er de intellectuele voldoening in het weten hoe iets werkt. Ten tweede, door te weten hoe het werkt, net als je fiets of auto, is er de mogelijkheid om het te repareren als het slecht functioneert. Geneesmiddelontwerp is een duidelijk resultaat van dit soort werk.
De aanpak die we hanteren om erachter te komen hoe een membraaneiwit op moleculair niveau werkt, is om de kristallografische structuur te bepalen. Dit omvat het vaststellen van de locatie in de driedimensionale ruimte van alle atomen, of tenminste alle niet-waterstofatomen die het eiwit vormen. De methode die we hiervoor gebruiken, wordt macromoleculaire röntgenkristallografie genoemd, kortweg MX.
Hier zien we een voorbeeld van een membraaneiwit waarvan de structuur werd bepaald met behulp van MX bij een fractiekwaliteit kristal van het eiwit dat nodig is om mx te doen. Zoals u zich kunt voorstellen, zijn er veel stappen bij de structuurbepaling met behulp van macromoleculaire kristallografie, zoals hier geïllustreerd. Meestal omvatten deze het identificeren van een membraaneiwitdoelwit en vervolgens het produceren, zuiveren en kristalliseren ervan.
Diffractiemetingen worden uitgevoerd op het kristal met behulp van een huis- of synchrotron-röntgenbron. De diffractiegegevens worden verwerkt, waardoor een elektronen dichtheids kaart ontstaat, die vervolgens wordt afgestemd met een moleculair model. Het model kan, wanneer verfijnd, worden gebruikt om het werkingsmechanisme van het eiwit te onderzoeken en voor op structuur gebaseerd geneesmiddelontwerp.
Het doel van dit JO-artikel is om u te laten zien hoe we fractiekwaliteit kristallen van membraaneiwitten produceren met behulp van lipide meso fasen door de zogenaamde in meso methode. Een recente beoordeling van de methode en het bereik ervan is beschikbaar in referentie een. Het stapsgewijze protocol dat we hier zullen volgen, wordt beschreven in verwijzing naar een stroomdiagram dat de stappen en de tijd die nodig is voor het opzetten van een eind meso membraaneiwitkristallisatieproef samenvat, wordt hier getoond.
Deze video behandelt de stappen die worden omsloten door rode stippellijnen. De items die u nodig hebt om in meso kristallisatie in de handmatige modus uit te voeren, worden hier getoond. Ze omvatten een geconcentreerde oplossing van het gezuiverde membraaneiwit lipide voor het creëren van de hosting mease, meestal mono ole om de lipide duidelijker te maken.
In deze video is het gedoteerd met rode kleurstof precipitant oplossingen, gezuiverd water buis knuffelen apparaten en wegwerp tips en een assortiment gaststrakke Hamilton spuiten, sommige met verwijderbare naalden, een smalle koppeling met smalle boring gebruikt om de eiwit oplossing te mengen met de lipide om de mease te produceren. Een herhalende dispenser van Hamilton glazen microscoopglazen en dekselglazen. Ideaal geïsoleerde geperforeerde dubbelzijdige dubbelzijdige plakband voor het maken van putjes, gechipt ijs weefsels, een rekenmachine en het belangrijkste van alles uw laboratorium notitieboek.
De volgende procedure wordt gebruikt om een glazen sandwichkristallisatieplaat voor te bereiden. Voor het laden, plaats een geïsoleerde microscoopslide op de werkbank. Verwijder het beschermende papierdeksel van één oppervlak van een strook geperforeerd dubbelzijdig plakband.
Plaats het plakband plakkerige kant naar beneden in contact met het oppervlak van de slide druk. Verzegel het plakband aan de slide. Met behulp van een brayer of roller kan aluminiumfolie tussen het plakband en de roller worden geplaatst om de basis van de putjes te beschermen.
Verwijder het tweede papierdeksel van het plakband om het bovenste plakkerige oppervlak bloot te leggen. Deze procedure genereert een glazen plaat die klaar is voor het laden en vervolgens het plakken zodra het laden voltooid is, plaats individuele geïsoleerde dekselglazen in de buurt van de plaat voor snel en efficiënt plakken van de putjes.
Plaats de lipide in een temperatuur gecontroleerde blok bij 45 graden Celsius gedurende drie minuten om deze gesmolten te maken. Merk op dat de gebruikte lipide meestal mono land is. In deze video is de lipide voorzien van een rode kleurstof voor zichtbaarheid terwijl de lipide smelt.
Bereid twee 100 microliter gasdichte Hamilton spuiten voor gebruik in de lipide-eiwit mengingsstap, verwijder de Teflon fur olie van de spuit die de eiwit oplossing zal bevatten. Plaats de spuit die de lipide zal bevatten ernaast. In dit geval wordt de fal op zijn plaats gelaten.
Plaats de koppeling met smalle boring tussen de twee spuiten en verbind vervolgens de koppeling met de lipide spuit vinger. Draai de koppeling vast aan de spuit, maar overdrijf het niet. Verwijder de plunjer van de vat van de lipide spuit.
Zorg ervoor dat de lipide gesmolten is. Stel de pipet in op 30 microliters en neem langzaam 30 microliters gesmolten lipide op. De lipide fles.
De lipide moet worden bewaard onder stikstof of argon bij minus 80 graden Celsius. Lever langzaam zoveel mogelijk van de gesmolten lipide als hij kan in de open uiteinden van de spuit. Zorg ervoor dat er geen luchtgaten worden geïntroduceerd.
Plaats de plunjer in de vat in contact met de gesmolten leopold en schuif de plunjer langzaam omhoog door de vat met de spuit verticaal gehouden. Zoals getoond, stijgt de per ongeluk gevangen luchtbel in het proces en wordt vrijgelaten. We hebben nu een plug van gesmolten lipide in de vat waarvan u het volume nauwkeurig moet bepal
Overzicht
Dit artikel beschrijft de procedure voor het handmatig opzetten van kristallisatieproeven van membraaneiwitten in lipidische mesofasen, zoals geïmplementeerd door de Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Kristallisatie van membraaneiwitten
- Macromoleculaire röntgenkristallografie
- Structuurbiologie
Achtergrond
- Biologische membranen zijn dunne structuren die cellen en organellen omringen.
- Het begrijpen van de functie van membraaneiwitten is cruciaal voor het ontwerp van geneesmiddelen.
- Kristallografische structuurbepaling is essentieel voor het bestuderen van membraaneiwitten.
- De in meso-methode is een specifieke aanpak voor het kristalliseren van deze eiwitten.
Doel van het onderzoek
- Om het proces van het produceren van hoogwaardige kristallen van membraaneiwitten te demonstreren.
- Om een stapsgewijs protocol voor de in meso-kristallisatiemethode te bieden.
- Om het begrip van membraaneiwitstructuren voor verder onderzoek te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Bereiding van een glas sandwich kristallisatieplaat.
- Gebruik van Hamilton spuiten voor het mengen van lipiden en eiwitten.
- Temperatuurcontrole voor lipide smelten.
- Opnemen van volumes en condities in een lab notitieboekje.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle opstelling van kristallisatieproeven met behulp van de in meso-methode.
- Demonstratie van lipide en eiwit mengen technieken.
- Illustratie van het kristallisatieproces en noodzakelijke apparatuur.
- Begeleiding bij het handhaven van condities voor optimale kristallisatie.
Conclusies
- De in meso-methode is effectief voor het kristalliseren van membraaneiwitten.
- Gedetalleerde protocollen verbeteren de reproduceerbaarheid in onderzoek naar structurele biologie.
- Begrip van kristallisatie draagt bij aan geneesmiddelontwerp en studies naar eiwitfunctie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Determining the three-dimensional structure of membrane proteins is a critical bottleneck in structure-based drug discovery, particularly for GPCRs and ion channels that represent major therapeutic targets. The lipidic mesophase (in meso) crystallization method enables high-resolution structural determination of challenging membrane proteins, directly supporting target validation and lead identification campaigns. By providing a reproducible pathway to obtain diffraction-quality crystals, this method reduces technical risk in early discovery and informs go/no-go decisions for costly downstream optimization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables atomic-level structural characterization of membrane protein targets, clarifying ligand-binding mechanisms and functional states.
- Operational Value: Provides a standardized approach to crystallize diverse membrane protein classes, including monomeric, multimeric, and chromophore-containing variants.
- Predictive Value: Supports structure-guided design of selective modulators, reducing attrition in lead optimization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces homogeneous, stable cubic phases suitable for high-throughput screening trials and ligand soaking experiments.
- Operational Value: Enables reproducible dispensing of nanoliter-scale mesophase boluses using repeating dispensers, ensuring assay consistency across plates.
- Scalability: Manual setup requires approximately one hour per plate, supporting medium-throughput feasibility in discovery labs.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Structures obtained via in meso crystallization (e.g., human β2-adrenergic and A2a adenosine receptors) directly inform preclinical candidate selection and mechanism-of-action studies.
- De-risking: Structural data reduce uncertainty in target engagement predictions, improving confidence in preclinical efficacy and safety assessments.
- Biomarker Alignment: Enables identification of allosteric sites and conformational states relevant to translational biomarker development.
Pipeline & Workflow Integration
The in meso method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical candidate support, providing structural insights that guide medicinal chemistry and pharmacology efforts.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing by revealing binding pocket architecture and conformational dynamics of membrane protein targets.
- Screening: Generates crystallization-ready samples compatible with fragment screening and ligand titration approaches.
- Analytics: Yields electron density maps and refined models that enable quantitative comparison of ligand-bound and apo states.
- Translational Research: Connects atomic structures to functional assays, supporting mechanism validation in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a platform capability applicable across multiple targets and projects, reducing redundant method development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target confidence through high-resolution structural data, enabling mechanistic de-risking of therapeutic hypotheses.
- Operational Value: Standardizes sample preparation and crystallization setup, improving reproducibility across teams and sites.
- Strategic Value: Accelerates lead identification by providing structural templates for virtual screening and fragment-based design.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by clarifying structure-activity relationships and binding modes early in the pipeline.
Implementation Considerations
- Requires expertise in membrane protein purification, lipid handling, and syringe-based mixing techniques to avoid sample loss and ensure homogeneity.
- Depends on access to temperature-controlled blocks, Hamilton syringes, repeating dispensers, and polarized light microscopy for crystal monitoring.
- Necessitates cross-team standardization of lipid-protein ratios, mixing protocols, and precipitant screening conditions for reproducible results.
- Involves adaptation considerations for different membrane protein classes (e.g., alpha-helical vs. beta-barrel) and lipid compositions.
- Limited by the need for fresh protein-loaded mesophase use, as some targets exhibit instability in the cubic phase without precipitant.
