Het verkrijgen van Hemocytes van de Hawaiiaanse Bobtail Squid Euprymna scolopes En observatie van de Naleving van Symbiotische en niet-symbiotische bacteriën
11 februari 2010
Deze video zal laten zien hoe je hemocytes (bloedcellen) te verkrijgen van de Hawaiiaanse Bobtail inktvis, Euprymna scolopes Voor gebruik in de celbiologische en bacteriële hechting testen. Hemocytes wordt gekleurd met een fluorescerende kleurstof en blootgesteld aan GFP-gemerkte bacteriën.
Nadat volwassen bobtail-inktvissen uit hun tanks zijn gehaald en zijn verdoofd met een gefilterde zeewasseroplossing met 2% ethanol, worden ze bloedontlaad via het cephalische bloedvat. Met een spuit van 26,5 gauge ziet de geëxtraheerde hemolymfe er blauw uit.
Vanwege de aanwezigheid van hemocyanine worden de hemocyten verdund tot de gewenste concentratie en verdeeld over een dekglas met acht kamers. Zodra de hemocyten aan het dekglas zijn gehecht, worden ze gekleurd met CellTracker Orange, een fluorescerende kleurstof, en blootgesteld aan GFP-gelabelde bacteriën, die gevisualiseerd kunnen worden met een fluorescentiemicroscoop. Hallo, ik ben Spencer Olm van de afdeling Molecular and Cell Biology aan de University of Connecticut.
En ik ben Andrew Collins van het NY Home Lab. Vandaag laten we u een procedure zien voor het extraheren van hemolymfe of bloed uit de Hawaïaanse bobtail-inktvis. U bereidt dit opis voor.
De bobtail-inktvis is een nachtdier dat voorkomt voor de kust van Hawaï nabij koraalriffen; ze gebruiken het licht dat door hun symbionten wordt geproduceerd om zichzelf 's nachts te camoufleren wanneer ze op jacht zijn naar hun favoriete voedsel, garnalen. In het laboratorium maken we gebruik van deze associatie om te bestuderen hoe gunstige bacteriën dierlijke weefsels koloniseren. Wij passen deze procedure in ons laboratorium toe om de interacties te bestuderen tussen componenten van het aangeboren immuunsysteem van de gastheer en diens bioluminescente bacteriële partner VIO ide.
Laten we beginnen. Voordat u de hemolymfe extraheert, anesthetiseert u één volwassen inktvis in een bekerglas van één liter met een vers bereide oplossing van 2% ethanol in 500 milliliter filtergestabiliseerd kunstmatig zeewater. Na 10 minuten zal de inktvis stoppen met zwemmen en niet meer actief reageren op aanraking.
Er dient echter nog steeds ademhaling waarneembaar te zijn, aangeduid door bewegingen van de mantel en chromatofooractiviteit die wijst op de activiteit van de pigmentcellen. Giet een hoeveelheid van de steriele zeewater-ethanoloplossing uit het bekerglas in een standaard wasdissectieschaal en dompel de inktvis in de schaal onder met de ventrale zijde naar boven. Trek met één standaard 200 microliter pipetteertip de trechter en de mantel terug om het hoofdkopbloedvat bloot te leggen, dat zich tussen de twee ogen bevindt.
Gebruik een steriele spuit met een naald van 26,5 gauge om het cephalische bloedvat door te prikken en onttrek tussen 50 en 100 µL hemolymfe of 10 tot 20 µL. Als het dier meerdere keren als donor zal dienen, plaats de hemolymfe dan in een steriele buis van 1,5 mL op ijs. Let op dat het bloed van de inktvis donkerblauw moet kleuren als deze stap correct is uitgevoerd.
Plaats het dier in een aquarium met normaal zeewater om het te laten herstellen, centrifugeer vervolgens de hemolymfe in een microcentrifuge bij kamertemperatuur om de hemocyten te pelletteren en pipetteer het supernatant af. Resuspendeer de hemocyten in 500 µL inktvis-Ringer-oplossing om ze te wassen. Centrifugeer vervolgens opnieuw om de cellen te pelletteren en verwijder het supernatant.
Resuspendeer tot slot de hemos en de squid ringer-oplossing. Bepaal de celconcentratie met een hemocytometer. Voeg vervolgens ongeveer 2000 cellen toe aan elke kamer van een glazen dekglas.
Laat de cellen ongeveer 10 minuten hechten aan het glas. Bij deze dichtheid zouden de hemos een uniforme monolaag op het glasoppervlak moeten vormen. Houd de hemos op ijs terwijl de bacteriën worden voorbereid in een orbitale schudker op 28 °C.
Kweek één of meer stammen van Vireo-bacteriën die een groen fluorescent reportergen bevatten tot de midden-logfasen in zeewater-triton-medium. Gebruik een spectrofotometer om de optische dichtheid van de cultuur bij 600 nm te meten om de celdichtheid te bepalen; centrifugeer de bacteriën om een pellet te vormen, verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet. Voeg de bacteriën in één milliliter squid Ringer-oplossing toe aan de hemocyten.
In de kamerglasplaatjes met 100.000 bacteriën per kamer. Incubeer de plaatjes gedurende één uur bij kamertemperatuur. Om maximale binding te bereiken, voegt u cell tracker orange toe tot een eindconcentratie van 0,005% om het hemo-cytoplasma te kleuren.
Incubeer gedurende 30 minuten en was vervolgens met 150 µL verse squid ringer-oplossing. Bekijk de gekleurde hemocyten en de bijbehorende bacteriën met een confocale microscoop en tel de bacteriën over het gehele oppervlak van de hemocyt. We tonen u nu enkele representatieve beelden van hemocyten die zijn blootgesteld aan de GFP-gelabelde niet-symbiotische bacterie Vibrio harveyi en de natuurlijke inktvissymbiote Vibrio fischeri.
Hier is een afbeelding van een hemo-locatie die niet is blootgesteld aan bacteriën. De cel ziet er rood uit en is geactiveerd. Hierdoor zijn de pseudopodia-achtige uitlopers zichtbaar.
Wanneer de cel wordt blootgesteld aan de bacteriële symbiont filio fii, is te zien dat slechts enkele bacteriën aan het celoppervlak binden. Echter, wanneer de niet-symbiotische bacterie filio Harvey Harveyi aan de hemos wordt blootgesteld, binden significant meer bacteriën. We hebben zojuist aangetoond hoe hemolymfen uit een bobtail-inktvis kunnen worden geëxtraheerd, hoe de hemos kunnen worden geïsoleerd en hoe deze in experimenten kunnen worden gebruikt om de bacteriële adhesie aan deze inktviscellen te karakteriseren.
Dit protocol kan worden aangepast voor immunochemie door de hemocyten te fixeren nadat ze aan het oppervlak van het dekglas zijn gehecht. RNA, DNA en eiwitten kunnen ook worden geëxtraheerd zodra de hemocyten uit het dier zijn verkregen. Dat is alles.
Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze video demonstreert het proces voor het verkrijgen van hemocyten van de Hawaïaanse bobtailinktvis, Euprymna scolopes, voor gebruik in celbiologische assays en assays voor bacteriële adhesie. De hemocyten worden gekleurd met een fluorescerende kleurstof en blootgesteld aan GFP-gelabelde bacteriën voor visualisatie.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Celbiologie
- Microbiologie
- Neurowetenschappen
Achtergrond
- Hemocyten zijn de bloedcellen van koppootjes.
- Ze spelen een cruciale rol in de immuunrespons.
- Het bestuderen van hemocyten kan inzicht geven in cellulaire interacties.
- De Hawaïaanse bobtail-inktvis is een modelorganisme voor dergelijke studies.
Doel van de studie
- Om hemocyten te isoleren voor experimentele assays.
- Om bacteriële adhesie aan hemocyten te onderzoeken.
- Om cellulaire processen te visualiseren met behulp van fluorescente markers.
Gebruikte methoden
- Volwassen bobtail-inktvissen worden geanestheseerd en er wordt bloed afgenomen via het cefale bloedvat.
- Hemolymfe wordt geëxtraheerd en verdund tot de gewenste concentratie.
- Hemocyten worden verdeeld over een dekglas met acht kamers.
- Cellen worden gekleurd met een fluorescerende kleurstof en blootgesteld aan GFP-gelabelde bacteriën.
Belangrijkste resultaten
- Hemocyten zijn succesvol aan het dekglas gehecht.
- Fluorescente kleuring maakte visualisatie van de hemocyten mogelijk.
- GFP-gelabelde bacteriën werden effectief waargenomen onder een fluorescentiemicroscoop.
- De methodologie biedt een betrouwbare aanpak voor het bestuderen van cel-bacterie-interacties.
Conclusies
- Het protocol is effectief voor het isoleren en bestuderen van hemocyten.
- Fluorescente kleuring verbetert de visualisatie van cellulaire interacties.
- Deze methode kan worden toegepast voor verder onderzoek in de celbiologie en microbiologie.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Dit protocol maakt mechanistische risicoanalyse van gastheer-microbe-interacties mogelijk door een kwantitatieve assay te bieden voor bacteriële adhesie aan immuuncellen. Het ondersteunt doelwitvalidatie in symbiose-onderzoek door een gedefinieerd cellulair component van de aangeboren immuniteit te isoleren. Deze benadering biedt voorspellende zekerheid voor het screenen van modulerende verbindingen die de kolonisatie door gunstige bacteriën beïnvloeden.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & validatie van targets
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen over immuun-gemedieerde bacteriële herkenning bij de vestiging van symbiose.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbaar systeem voor functionele validatie van hemocyt-gemedieerde discriminatie tussen pathogenen of symbionten.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream screening van verbindingen die de bacteriële binding beïnvloeden.
- Operationele waarde: Maakt assay-standaardisatie mogelijk via kwantificeerbare adhesie-read-outs met behulp van fluorescent gelabelde bacteriën en celtracking.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt ziekte-relevante systeemmodellering door immuuncelstuncties te koppelen aan microbiota-homeostase.
- Operationele waarde: Faciliteert risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door middel van meetbare, orthogonale validatie van de interactie tussen gastheer en bacteriën.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen vroege discovery-workflows en biedt een immuuncelpreparatie die bijdraagt aan lead-identificatie via screening van het bindingsfenotype.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing van de rol van hemocyten bij het onderscheiden van symbiotische versus niet-symbiotische bacteriën.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid via gestandaardiseerde hemocytadhesie aan chambered coverslips en een gecontroleerde bacteriële challenge.
- Analytics: Genereert kwantitatieve metingen van de afhankelijke variabele (gebonden bacteriën per cel), waardoor vergelijking tussen condities mogelijk wordt.
- Translational Research: Sluit aan bij preklinische continuïteit door immuungemedieerde microbiota-interacties te modelleren die relevant zijn voor de gezondheid van de gastheer.
- Enterprise Reuse: Creëert een herbruikbaar platform voor adhesie-assays op basis van immuuncellen voor meerdere bacteriële stammen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit bij gastheer-microbe binding door directe visualisatie van bacteriële adhesiegebeurtenissen.
- Operationele waarde: Waarborgt standaardisatie via een gedefinieerde hemocytenconcentratie, adhesietijd en bacteriële input (100.000 bacteriën per kamer).
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door kwantificering van differentiële binding aan symbiotische versus niet-symbiotische stammen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk van verbindingen die interacties tussen immuuncellen en bacteriën moduleren.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in de anatomie van ongewervelden en aseptische technieken voor de extractie van hemolymfe.
- Afhankelijk van fluorescentiemicroscopie en spectrophotometrie voor de kwantificering van bacteriën en celvisualisatie.
- Vereist standaardisatie tussen teams van de protocollen voor de preparatie van hemocyten en het labelen van bacteriën.
- Omvat overwegingen voor aanpassingen voor verschillende Vibrio-stammen of alternatieve bacteriële reporters.
- Praktische beperkingen omvatten de levensvatbaarheidsduur van hemocyten en de behoefte aan verse exemplaren van inktvissen.
