Venster op een Microworld: Eenvoudig Microfluïdische Systemen voor het bestuderen van microbiële transport in poreuze media

We tonen aan dat fysieke structuren en drukhoofden constant kunnen worden gehouden of kunnen worden gevarieerd door het gebruik van eco-chipapparaten. Terwijl de invloed van oppervlaktechemie, vloeistofeigenschappen of de kenmerken van de deeltjes of microben systematisch worden onderzocht via transportexperimenten met een niet-pathogene VIO-bacteriestam die groen fluorescerend eiwit tot expressie brengt, illustreren we het belang van habitatstructuur, stroomcondities en inoculumgrootte voor fundamentele transportfenomenen. Microfluïdische software biedt een overtuigend beeld van een verborgen wereld.

Hallo, ik ben Dimitri Marker van het Vanderbilt Institute for Integrative Biosystem Restoration Education aan de Vanderbilt University. En ik ben David Schafer, een onderzoeks- en ontwikkelingsingenieur hier bij Viro Laboratories. Hallo, ik ben Leslie Sho van het Department of Chemical Materials and Biomolecular Engineering in het Center for Environmental Science and Engineering aan de University of Connecticut, en ik ben added Dicot, ook van Zebra.

Vandaag laten we u een procedure zien voor het creëren van modulaire microfluïdische habitat-arrays voor fundamenteel onderzoek in de milieuwetenschappen en engineering. In ons laboratorium gebruiken we deze procedure om de effecten van structuren op micrometer-schaal op microbiële transportinteracties in bosmedia te onderzoeken. Laten we beginnen.

De eerste stap bij het maken van een microfluïdisch apparaat is het tekenen van een tweedimensionale lay-out van het apparaat in een computerondersteund tekenprogramma of CAD-programma. Wij hebben AutoCAD gebruikt, maar andere tekenprogramma's zijn ook beschikbaar, zoals Clue-in of CorelDRAW. De software stelt de ontwerper in staat om fysieke structuren getrouw te reproduceren over een macroscopisch veld, terwijl individuele kenmerken worden gedefinieerd met een resolutie van minder dan vijf micron.

Op basis van de CAD-tekening wordt een fotografisch masker gemaakt. We gebruiken een chroommasker vervaardigd door Advanced Reproductions Corporation, in het noordelijke deel van Massachusetts. De volgende stappen van de productie van het microfluïdische apparaat vinden plaats in een cleanroom om een master te maken.

Een schone siliciumwafer wordt met een spin-coater voorzien van een laag fotoresist. Eerst wordt de wafer op het platform van de spin-coater bevestigd en worden enkele gram SU 8 20 25 fotoresist op het centrum van de wafer gegoten. Vervolgens wordt de wafer gedurende een initiële spreidingscyclus van 15 seconden op 500 RPM gesponnen, gevolgd door een dunne coatingscyclus van 35 seconden op 4 000 RPM.

Na het centrifugeren wordt de wafer 10 minuten lang op een warmteplaat bij 95 °C geplaatst om overtollig oplosmiddel te laten verdampen. De laatste stap bij het voorbereiden van de wafer is het verwijderen van de randrand (edge bead). Dit gebeurt door de wafer terug te plaatsen in de spin-coater en een gestage stroom SUA edge speed remover aan te brengen op de buitenrand van de gecoate wafer.

De volgende stap is het patroon aanbrengen in de fotorezist door selectieve blootstelling aan UV-licht. Eerst wordt de gecoate wafer op een vlak oppervlak geplaatst en wordt het chroommasker direct daarop geplaatst. Rubylith rode maskeringsfolie blokkeert de overdracht van patronen buiten het gewenste gebied.

Vervolgens wordt een dosis UV-licht van 300 mJ/cm² via het masker op de gecoate wafer afgeleverd met behulp van een spot-transportsysteem. Ten slotte wordt de wafer 15 minuten gebakken bij 95 °C om de door licht belichte regio's van de fotorezist te crosslinken, waardoor deze onoplosbaar worden. De laatste stap bij het maken van de master is het verwijderen van de niet-gecrosslinkte regio's van de fotorezist, waardoor verhoogde reliëfstructuren achterblijven.

Ten eerste wordt de wafer nogmaals in de spin-coater geplaatst en bedekt met de ontwikkelaarsoplossing. De ontwikkelaar blijft ongeveer vijf minuten op de gecoate wafer en wordt vervolgens weggeslingerd, wat resulteert in een duidelijk zichtbaar patroon op de wafer. Eventuele resterende residuen worden weggewassen door isopropylalcohol op de draaiende wafer te spuiten.

Voor deze stap gebruiken we een spinsnelheid van 2200 RPM gedurende ongeveer vijf tot 10 seconden. Ten slotte wordt de voltooide master gedroogd met een stikstofgasstroom en bewaard in een schaaltje tot deze nodig is voor het gieten van een device. We vervaardigen microfluidische devices met behulp van het siliconen elastomeer polymethylsiloxaan.

Eerst worden het basismateriaal en het hardingsmiddel in een gewichtsverhouding van 10 op 1 in een plastic beker gedaan. Vervolgens wordt het mengsel gemengd. Andy ontluchtte dit met behulp van een Thinky AR 100 conditioner-menger.

Zodra de cyclus is voltooid, wordt vloeibare PDMS gelijkmatig over de master gegoten. De schaal met de master en de ongeharde PDMS wordt vervolgens in een vacuümkamer geplaatst om te ontgassen. De polymeerbellen verschijnen vrijwel onmiddellijk.

Het ontgassen gaat door totdat alle bellen zijn verdwenen. De schaal wordt in een waterpas gestelde oven bij 65 °C geplaatst voor ten minste vier uur om de volledige cross-linking van het polymeer mogelijk te maken. Vervolgens wordt het uitgeharde PDMS voorzichtig van de herbruikbare master verwijderd.

De eerste vier randen worden met een scalpel ruim buiten het gepatroneerde gebied gesneden, waarna het apparaat met een pincet van de gepatroneerde wafer wordt gepeld. De randen van het apparaat kunnen naar wens met een schaar worden bijgesneden. Een gedeelte van het apparaat kan worden gescheiden van de rest van het gegoten PDMS-apparaat.

Vervolgens worden er toegangsgaatjes door het PDMS geponst. Hiervoor gebruiken we biopsieponsen in verschillende commercieel verkrijgbare maten, gemonteerd op een klein steelje. De PDMS-kernen worden met een pincet verwijderd.

Ten slotte wordt het bijgesneden en geponste apparaat gereinigd met isopropylalcohol en een polypropyleen wattenstaafje met schuimtop. Het apparaat wordt gedroogd met stikstof en vervolgens in de oven geplaatst om alle sporen van oplosmiddel te verwijderen. De laatste stap bij het maken van een microfluidisch apparaat is het hechten van de PDMS aan een substraat van een glasplaat, gevolgd door het vullen met vloeistof.

Het PDMS-apparaat en een glazen objectglas worden met de te verbinden oppervlakken naar boven geplaatst in een plasmareiniger. In dit experiment gebruiken we een PDC 32 G herrick plasmareiniger. Zodra het vacuüm is gevestigd en het blauwviolette plasma zichtbaar is, wordt een timer ingesteld op 30 seconden.

De plasmagenerator wordt uitgeschakeld. De kamer wordt opnieuw onder druk gezet, waarna het apparaat en de schuif uit de kamer worden gehaald en de hechtvlakken met elkaar in contact worden gebracht. Bij het verwijderen van de geactiveerde componenten uit de kamer is het belangrijk om snel te handelen, zodat de oppervlakken geactiveerd blijven.

Lichte druk helpt om een goede binding te waarborgen. De kwaliteit van de binding wordt gecontroleerd door met een pincet aan een hoek te trekken. Het hydrofiele binnenste kan vervolgens eenvoudig worden gevuld met een waterige oplossing, zoals buffermedia of gedeïoniseerd water.

Water wordt toegediend in elke bronput en via de overeenkomstige microporeuze flowcel. Zodra alle kamers vol zijn, wordt een dunne laag uitgehard PDMS over het gehele apparaat geplaatst om verdamping te remmen en steriliteit te behouden. Om de drukgestuurde flow in het apparaat te kalibreren, worden de gestructureerde flowcellen vooraf gevuld met gedeïoniseerd water en wordt er een flowmodule, die dient als interface voor vloeistoftoediening en als steriele afdichting, bovenop het apparaat geplaatst.

Deze stromingsmodule kan zelfstandig worden gebruikt of worden aangesloten op een extern vloeistofreservoir, zoals een plastic spuit. Sluit een vloeistofreservoir, zoals een plastic spuit, of de stromingsmodule aan op de bovenstroomse inlaat. Zorg dat de vloeistofhoogte in het reservoir hoger blijft dan de hoogte van de benedenstroomse uitgang.

Het hoogteverschil tussen het bovenstroomse reservoir en elke benedenstroomse uitlaatput bepaalt de drijvende kracht voor drukgestuurde stroming om de stroomsnelheden door de apparaten te kwantificeren. Een stomp naald van 25 gauge wordt gebruikt om op regelmatige intervallen monsters uit de benedenstroomse putten te verzamelen. We nemen bijvoorbeeld elke 15 tot 20 minuten monsters, waarbij we de daadwerkelijk verstreken tijd tussen de monsters zorgvuldig noteren.

Het gewicht van de spuit wordt voor en na de bemonstering vastgelegd op een analytische balans. Het geaggregeerde volume tegenover de geaggregeerde tijd wordt in een grafiek uitgezet, waarbij de helling gelijk is aan de gemiddelde massastroom. De grote dwarsdoorsnede van het inlaatreservoir ten opzichte van de uitlaatputten helpt te voorkomen dat de stroomsnelheden significant veranderen terwijl de vloeistof door de apparaten beweegt; zet het bemonsterde volume uit op de Y-as tegenover de bemonsteringstijd op de X-as.

In een eenvoudig grafiekprogramma zoals Excel wordt de helling van de lijn bepaald; deze helling wordt gebruikt voor de gemiddelde volumetrische debiet. Een verdunde oplossing van drie micromolaire fluorescente latexbolletjes met carboxy-, YG- en gewone YG-oppervlakken wordt gebruikt om de stroming te visualiseren en oppervlakte-interacties te bestuderen. Eerst wordt een oplossing van bolletjes bereid in gedeïoniseerd water bij een concentratie van 0,01% vaste bestanddelen.

De oplossing wordt toegevoegd aan de stroomopwaartse putjes en de stroommodule wordt opnieuw bevestigd. De stroming van de kralen wordt gedurende één uur gevisualiseerd en ongeveer elke 10 minuten vastgelegd met een Zeiss AIOt 25 fluorescentiemicroscoop, uitgerust met een MITx BCEB 0 1 3 U monochroomcamera. Individuele frames worden in snelle opeenvolging vastgelegd en samengevoegd tot video's met behulp van een softwareprogramma zoals Image J, waarbij gebruik wordt gemaakt van fluorescentieverlichting en transmissielichtverlichting.

Zowel de kralen als de structuren zijn zichtbaar. Wanneer doorgelaten licht wordt geblokkeerd, zijn alleen de heldere fluorescerende kralen zichtbaar. Stationaire kralen die op het bodemoppervlak zijn afgezet of aan de collectoren zijn bevestigd, zijn overal in het apparaat duidelijk zichtbaar.

Voor experimenten met levende bacteriën, zoals een cultuur van Vibrio-soorten, wordt een niet-pathogene bacterie voorbereid die het groen fluorescerend eiwit tot expressie brengt. Eerst wordt een stockcultuur uit de diepvriesopslag gehaald. Een kolf met steriel LB-groeimedium wordt geïnoculeerd met de stockcultuur.

Met behulp van een wegwerpinoculatielus wordt de kolf een nacht lang onder schudding geïncubeerd, resulterend in een cultuur in de stationaire fase met een concentratie van ongeveer 10⁹ cellen per milliliter. Afhankelijk van de toepassing kan de initiële bacteriële concentratie nauwkeuriger worden gekwantificeerd. Een microfluïdisch apparaat gevuld met steriele buffer wordt voorbereid.

Vervolgens wordt de steriele vloeistof in de upstream-wells geleegd en vervangen door 20 microliters van de bacteriecultuur. Met behulp van een pipet worden de bacteriën in het apparaat gezaaid door voorzichtig te zuigen met een spuit bij de output-wells. Na incubatie kan de hoeveelheid bacteriën in de wells worden bepaald door de fluorescentie-intensiteit van elke well na kolonisatie te kwantificeren. De upstream-inlaatwell wordt opnieuw geleegd en vervangen door buffer gespoeld met 25 delen per duizend zouten.

Er wordt een zachte druk van kunstmatig zeewater uitgeoefend op de stroomopwaartse putten met een spuit, waarbij individuele stroomcellen worden gespoeld met 20 tot 40 µL van de buffersoplossing. Dit is ongeveer 100 tot 200 maal het porievolume van het microfluïdische bodemgedeelte van de stroomcel na de initiële spoeling. Langdurige perfusie van bacteriën door de poreuze media wordt bereikt door gebruik van de stroommodule precies zoals eerder beschreven.

Fluorescente en witlichtbeelden van de bacteriële groei en het transport kunnen in de loop van de tijd worden gemeten. In dit experiment worden er gedurende een periode van zeven dagen elke 15 tot 20 uur beelden gemaakt met een gekoelde CCD-kleurencamera van Q imaging ink. Onze apparaten kunnen ook worden gebruikt om de effecten van de fysieke habitatstructuur op het bieden van een toevluchtsoord voor bacteriën tegen predatie door protozoa te onderzoeken.

Hier zijn bacteriën in een microporeuze flowcel, met de veel grotere gecilieerde protozoa eulo zichtbaar in het apparaat terwijl ze bacteriën grazen. Bij de analyse van de vloeistofstroom in het microfluïdische apparaat stellen we vast dat de gemiddelde stroomsnelheid 0,71 µL per minuut bedraagt bij een drukhoofd van 40 mm. Door het drukhoofd te verhogen naar 60 mm, nam de stroomsnelheid proportioneel toe tot 1,04 µL per minuut.

Bij het gebruik van beads met verschillende oppervlaktechemieën in het apparaat, observeren we een grotere accumulatie van niet-gecarboxyleerde beads aan de oppervlakken van het apparaat. Beads met een diameter van zes tot 10 millimeter bleken veel vaker vast te raken in de kleinere porieopeningen. Snellere stroomsnelheden, veroorzaakt door een hogere hydrostatische druk, resulteerden in een verminderde retentie en insluiting van beads, zoals verwacht zou worden bij het analyseren van bacteriële groei in het eco chipp microfluidisch apparaat.

We merken kwalitatieve verschillen in beeldintensiteit op in verschillende sectoren van het apparaat. De fluorescentie-intensiteit kan worden gekwantificeerd als een proxy voor de microbiële biomassa in het kanaal. In lopende experimenten observeren we dat de continue afschuifkrachten bij lage stroomomstandigheden bacteriële aggregatie en vlokvorming lijken te veroorzaken, zoals duidelijk blijkt uit deze beelden. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u eenvoudige microfluïdische apparaten kunt maken en gebruiken om de partikelgrootte te meten, transport door poreuze media te bestuderen of microbiële interacties in microgestructureerde habitats te onderzoeken.

Bij het uitvoeren van studies met flowcellen is het belangrijk om rekening te houden met het drijfvermogen van de beads en de oppervlaktechemie van de colloïden en collectoren. Bij het schalen naar het microfluïdische regime kunnen oppervlakte-effecten de waargenomen fenomenen domineren. Vrijwel elke fysieke structuur kan worden geïntegreerd in het ontwerp van een microfluïdische flowcel.

Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.