Multicolor Flow Cytometry Analyses van de cellulaire immuunreactie in resusmakaken
22 april 2010
Tonen we het nut van multicolor flowcytometrie voor gedetailleerde fenotypische en functionele karakterisering van het totaal en als het geheugen subsets van CD4 + en CD8 + T-cellen in rhesus makaken, het ideale model voor HIV / AIDS-vaccin studies.
Deze video toont een procedure voor het stimuleren en kleuren van perifere mononucleaire cellen of PBMC. Voor meerkleurige flowcytometrieanalyse worden Alec Watts van PBMC geïsoleerd uit volbloed in weefselkweekplaten geplaatst. Cellen worden chemisch of biologisch gestimuleerd om een immuunrespons te produceren.
Na stimulatie wordt een cocktail van antilichamen toegevoegd om celtypen te identificeren op basis van tot expressie gebrachte oppervlaktemarkers. De cellen worden vervolgens gepermeeerd en een andere cocktail van antilichamen wordt toegevoegd om de expressie van intracellulaire cytokinen te detecteren, cellen worden vervolgens geanalyseerd door feiten om de cytokineprofielen voor specifieke subsets van PBMC te bepalen. Hallo, ik ben Amy Courtney van het lab van Dr. Jagan SAS in het Department of Immunology aan de Universiteit van Texas MB Anderson Cancer Center.
Hallo, ik ben Hong, ook van het lab. Vandaag laten we je een multicytometrie analyse van T-celreacties zien. We gebruiken deze procedure in ons lab om cellulaire immuunreacties in Reus Maca te bestuderen.
Dus laten we beginnen. Begin dit protocol door een hemo cytometer te gebruiken om de levensvatbare celtelling van PBMC van Reuss Maca te bepalen door de Trian Blue Dye exclusiemethode. Werken in een laminare flow hood reus.
Suspensie de cellen in compleet medium met een concentratie van 10 miljoen cellen per milliliter voor niet-specifieke stimulatie op 100 microliters van de celsuspensie in elk putje van een 96 wel tissue kweekplaat. Voeg vervolgens 100 microliters medium toe met PMA en CIN om het totale volume op 0,2 milliliter te brengen met een eindconcentratie van 50 nanogram per milliliter PMA en 500 nanogram per milliliter CIN voor negatieve controleputjes, voeg 100 microliters compleet medium toe aan elk. Wel incubeer de cellen bij 37 graden Celsius in de bevochtigde 5% koolstofdioxide atmosfeer na 1,5 uur.
Een veld A naar de cultuur bij een eindconcentratie van 10 microgram per milliliter en incubeer gedurende nog eens 4,5 uur. De veld A wordt toegevoegd om cytokinen in het goud G-apparaat te vangen om de zichtbaarheid te verhogen met immunokleuring, volgend op stimulatie centrifuge om medium te verwijderen en vervolgens wassen door 200 microliters koude flow wasbuffer toe te voegen en centrifugeren bij lage snelheid. Herhaal deze wassing, verzend vervolgens opnieuw in 50 microliters flow wasbuffer.
De cellen zijn nu klaar om te worden gekleurd voor expressie van oppervlaktemarkers naar elk putje van de resuspendeerde cellen. Voeg een microliter van de levend dode fixeerbare aqua fluorescerende reactieve kleurstof toe die is bereid volgens de instructies van de fabrikanten en S. Incubeer bij vier graden Celsius in het donker gedurende 30 minuten terwijl de cellen incuberen.
Bereid de kleuringsoplossingen voor die zullen worden gebruikt voor feiten in microbuisjes. Eerst, bereid een staande cocktail om het volgende op gepaste wijze te bevatten. Getitreerde fluorescentie gelabelde monoklonale antilichamen, anti CD drie PE SCI zeven, anti CD acht Alexa 700 anti CD 28 per CCP SCI 5,5, anti CD 95 A PC en anti CD vier Pacific Blue Inflow Wash Buffer.
Bereid vervolgens compensatiecontroles voor, die zullen worden gebruikt om de overloopcoëfficiënten van elke individuele kleuring in andere detectoren te bepalen door een buis van elk fluorescerend geconjugeerd antilichaam afzonderlijk te bereiden als een enkelkleurige kleuring. Bereid ten slotte fluorescentie minus een of FMO kleurstoffen voor door alle reagentia te combineren behalve degene van belang. Dit zal worden gebruikt om de grens tussen een positieve en negatieve populatie te bepalen door autofluorescentieniveaus en gegevens in volledig gekleurde monsters te dupliceren.
Nadat de cellen in de levend dode kleurstof zijn geïncubeerd, was ze eenmaal met koude flow wasbuffer om overtollige kleurstof te verwijderen, zuig de wasbuffer op. Voeg vervolgens de bereide kleuringsoplossingen toe. Incubeer de cellen bij vier graden Celsius in het donker gedurende 30 minuten.
Was de gekleurde cellen met koude flow wasbuffer om overtollig antilichaam te verwijderen. Voeg vervolgens 100 microliters BD fixatie permeatieoplossing toe gedurende minimaal 10 minuten. Bewaar de cellen bij vier graden Celsius in het donker tot 24 uur totdat ze worden gebruikt of ga door om de intracellulaire cytokinen te labelen om intracellulaire cytokinen te labelen.
Perme de cellen eerst in 100 microliters van één X perm. Wasbuffer incubeer gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius in het donker terwijl de cellen incuberen. Bereid de kleuringsantilichamen, compensatiecontroles en FMO controles voor in één x perm wasbuffer zoals eerder.
Nadat de cellen gedurende 10 minuten zijn geïncubeerd, draai naar beneden en verwijder de één x perm wasbuffer. Voeg de juiste kleuringsantilichamen toe. Incubeer vervolgens de cellen en antilichamen gedurende 60 minuten bij vier graden Celsius in het donker volgend op de incubatie.
Was de cellen twee keer met de permeatieoplossing. Na de laatste wassing, resuspendeer de cellen in 1% Paraform aldehyde in DPBS om de cellen te fixeren. Bewaar de cellen bij vier graden Celsius in het donker tot ze worden gebruikt voor maximaal 24 uur.
Zodra de cellen zijn gekleurd, gebruik een LSR twee flow cytometer of cyan a DP flow cytometer om feiten uit te voeren. Analyseer vervolgens de gegevens met behulp van FlowJo of vergelijkbare software. PBMC samenstelling in reus Maca werd bepaald met behulp van fax analyse.
Deze figuur toont het gatingschema dat wordt gebruikt voor de analyse van de verschillende T-celsubsets van een representatief dier. De lymfocyten werden eerst gesorteerd via voorwaartse scatter FSC versus zijwaartse scatter SSC en vervolgens werden levende lymfocyten geïdentificeerd op basis van SSC en AQUA negatieve populatie. De T-cellen werden vervolgens geïdentificeerd door CD drie expressie CD vier positief, CD acht negatief en CD vier negatief CD acht positieve populaties binnen de CD drie positieve T-celpopulatie werden ook bepaald.
De CD vier positieve en CD acht positieve T-cellen werden verder onderscheiden in verschillende subsets op basis van CD 28 en CD 95 expressie als naïeve centrale geheugen en effector geheugen cellen. Deze figuur toont interferon gamma en IL twee productie in niet-gestimule
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze video demonstreert een procedure voor het stimuleren en kleuren van mononucleaire cellen uit perifeer bloed (PBMC) voor multicolor flowcytometrie-analyse. De studie richt zich op de fenotypische en functionele karakterisering van CD4+ en CD8+ T-cel subsets in rhesusmacaqueapen, een model voor HIV/AIDS-vaccinonderzoek.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschappelijk gebied
- Immunologie
- Flowcytometrie
- HIV/AIDS-onderzoek
Achtergrond
- Rhesusmacaques worden gebruikt als model voor het bestuderen van hiv/aids.
- Inzicht in T-cel-subsets is cruciaal voor de ontwikkeling van vaccins.
- Multicolor flowcytometrie maakt gedetailleerde analyse van immuuncellen mogelijk.
- PBMC's zijn sleutelcomponenten bij het bestuderen van immuunresponsen.
Doel van de studie
- Om totale en geheugen-subsets van T-cellen te karakteriseren.
- Om multicolor flowcytometrie te gebruiken voor gedetailleerde immuunprofilering.
- Om het begrip van immuunresponsen in de context van hiv/aids te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Isolatie van PBMC uit volbloed.
- Chemische of biologische stimulatie van PBMC.
- Gebruik van antilichaamcocktails om celtypen en oppervlaktemarkers te identificeren.
- Analyse van cytokinestructuren met behulp van flowcytometrie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle stimulatie en kleuring van PBMC's voor analyse.
- Identificatie van specifieke T-cel-subsets op basis van oppervlaktemarkers.
- Karakterisering van intracellulaire cytokinenexpressie.
- Inzichten in immuunresponsen die relevant zijn voor HIV/AIDS.
Conclusies
- Multicolor flowcytometrie is effectief voor de analyse van T-cellen.
- Rhesusmakaakapen bieden waardevolle inzichten voor onderzoek naar HIV-vaccins.
- Het begrijpen van de dynamiek van T-cellen is essentieel voor de ontwikkeling van effectieve therapieën.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Multicolor flowcytometrie maakt nauwkeurige fenotypische en functionele profilering van T-celsubsetten in rhesusmacaques mogelijk, een cruciaal preklinisch model voor de ontwikkeling van hiv-vaccins. Deze benadering ondersteunt targetvalidatie door cytokine-producerende immuunresponsen te kwantificeren, wat bijdraagt aan go/no-go-beslissingen in de vroege ontdekkingsfase. De methode vergroot de voorspellende betrouwbaarheid door antigeenspecifieke stimulatie te koppelen aan meetbare intracellulaire cytokine-outputs in gedefinieerde geheugenpopulaties.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door de productie van IFN-γ en IL-2 in CD4+ en CD8+ T-celsubsets na stimulatie te meten.
- Operationele waarde: Biedt kwalitatieve en kwantitatieve maten van intracellulaire cytokineesexpressie om mechanistische ambiguïteit bij de validatie van immuuntargets te verminderen.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt biologische risicovermindering door gevoelige detectie van kleine antigeenspecifieke T-celfracties in PBMC-monsters van gevaccineerde dieren.
Screening en assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream workflows door gestandaardiseerde kleurings- en stimuleringsprotocollen vast te stellen voor reproduceerbare immuunprofilering.
- Operationele waarde: Pakt assay-standaardisatie en reproduceerbaarheid aan door het gebruik van compensatiecontroles en FMO-controles om nauwkeurige population gating te waarborgen.
- Wetenschappelijke waarde: Benadrukt de gereedheid voor screening door detectie van cytokineprofielen mogelijk te maken in naïeve, centrale geheugen- en effectorgeheugen T-cel subsets.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Bespreekt de relevantie voor de ziekte door intracellulaire cytokinemetingen in rhesusapen te koppelen aan HIV-pathogenese en door vaccins opgewekte immuunresponsen.
- Operationele waarde: Beschrijft de continuïteit van ontdekking naar preklinische validatie door resultaten van PBMC-stimulatie te koppelen aan functionele T-celkarakterisering.
- Wetenschappelijke waarde: Richt zich op de voorspellende waarde voor risicoreductie door cytokineproductie te gebruiken als functionele readout voor de beoordeling van de immunogeniciteit van vaccins.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode bevindt zich binnen het ontdekkingscontinuüm, van vroege immuunprofilering tot identificatie van lead-moleculen, en ondersteunt het testen van hypothesen en de verduidelijking van pathways in modellen voor infectieziekten.
- Discovery Biology: Legt uit hoe de methode hypothesetoetsing ondersteunt door de cytokineproductie in specifieke T-cel-subsets te kwantificeren na PMA/ionomycine- of antigeenspecifieke stimulatie.
- Screening: Beschrijft de gereedheid van de assay via gestandaardiseerde stimulatie, oppervlakte- en intracellulaire kleuring en flowcytometrische analyse van PBMC-monsters.
- Analytics: Benadrukt metingen zoals de productiefrequenties van IFN-γ en IL-2, die vergelijking van immuunresponsen tussen condities en subsets mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt de methode met preklinische continuïteit door vaccin-geïnduceerde T-celresponsen in rhesusmacaques te koppelen aan functionele immuunprofilering die relevant is voor de ontwikkeling van HIV-vaccins.
- Enterprise Reuse: Presenteert de methode als een herbruikbare capaciteit voor longitudinale immuunmonitoring van verschillende vaccinkandidaten en adjuvantformuleringen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen, targetvalidatie, vermindering van mechanistische ambiguïteit bij T-cel-gemedieerde immuunresponsen.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van multicolor flowcytometrie-assays voor immuunprofilering.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen, kapitaalefficiëntie en verminderd biologisch risico in een laat stadium binnen vaccinontwikkelingsprogramma's.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering en beslissingen over verdere ontwikkeling op basis van kwantitatieve cytokinenprofielen in preklinische modellen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereiste wetenschappelijke expertise in het ontwerp van flowcytometrie-panels, compensatie en gating-strategieën voor multicolor immunophenotypering.
- Behoeften op het gebied van instrumentatie en analytische infrastructuur, waaronder een flowcytometer (bijv. LSR II) en software (bijv. FlowJo) voor hoogdimensionale data-analyse.
- Eisen voor standaardisatie tussen teams voor stimulatiecondities, antilichaamtitratie en de opzet van controles (single-color en FMO) over verschillende laboratoria heen.
- Overwegingen voor adaptatie tussen modelsystemen, inclusaronder optimalisatie van stimulatieconcentraties en incubatietijden voor PBMC van niet-menselijke primaten.
- Praktische beperkingen ondersteund door het bronmateriaal: noodzaak van lichtbescherming voor fluorescerende antilichamen en zorgvuldige titratie om spillover in multicolor-panels te minimaliseren.
