Het belang van correcte eiwitconcentratie voor Kinetics en affiniteit Bepaling in structuur-functie analyse

Het algemene doel van dit video-artikel is om antwoorden te bieden op de volgende twee vragen. Ten eerste: kunnen studies naar eiwitinteracties betrouwbaarder worden gemaakt door het fractie-deel van een eiwitmonster te meten dat daadwerkelijk in staat is om aan een ander eiwit te binden? Ten tweede: hoe kan kinetische analyse ons een beter inzicht geven in de relaties tussen structuur en functie?

Beide vragen zullen worden behandeld in een experiment met de Corp X 100, een instrument dat eiwitinteracties in real-time detecteert zonder gebruik van labels. In dit experiment wordt de interactie van bovine cystatine B met de cystineprotease papaine onderzocht; de kristalstructuur van de twee eiwitten in complex wijst op verschillende residuen die betrokken zijn bij de binding aan de protease, om te bepalen hoe elk van de interagerende residuen de interactie tussen cystatine B en papaine beïnvloedt. Diverse cystatine B-varianten worden geproduceerd via site-directed mutagenese.

Bij dergelijke experimenten bestaat altijd de mogelijkheid dat recombinante eiwitten niet correct vouwen, aggregeren of degraderen, wat leidt tot onjuiste en niet reproduceerbare resultaten. VIACORE X 100 heeft de mogelijkheid om het fractie van het eiwit dat beschikbaar is voor binding te bepalen via kalibratievrije concentratieanalyse, afgekort als CFCA. Deze benadering maakt het mogelijk om de concentratie van het eiwit met behouden bindingsactiviteit te bepalen, zelfs wanneer kalibratiestandaarden niet beschikbaar zijn.

CFCA zal hier worden gebruikt om de concentratie van de cystatine B-varianten te bepalen. Deze gegevens zullen vervolgens als input dienen bij het bepalen van de bindingskinetiek van de cystatine B-varianten aan Pepine, wat ook wordt beoordeeld met behulp van BOR X 100. Hallo, ik ben CLA gram van GE Healthcare in Zweden.

Vandaag zal mijn collega Eva Pool laten zien hoe u een structureel-functionele relatieanalyse uitvoert met behulp van de BOR X 100. Recombinante eiwitten kunnen na verloop van tijd een onjuiste vouwing vertonen of een afname in activiteit ondergaan, en dit gedrag kan niet worden gedetecteerd met methoden die vertrouwen op de meting van de totale concentratie. Dit kan in feite leiden tot incorrecte kinetische gegevens na de concentratiemetingen via kalibratievrije concentratieanalyse. De B.A core X 100 wordt gebruikt om de kinetiek en affiniteit van de interactie tussen cystatine B-varianten en pepsine te analyseren.

Deze parameters zullen inzicht geven in het bindingsmechanisme. We beginnen met een korte uitleg van het experimentele ontwerp, dus laten we beginnen. De interactie tussen de cystine-protease papine en de inhibitor cystatine B wordt gedomineerd door hydrofobe contacten, zoals blijkt uit de kristalstructuur van de twee eiwitten in complex.

Vanuit de zijde van de inhibitor zijn de contactgebieden de N- en C-terminale uiteinden en twee hairpin-loops. In deze studie worden vier mutanten onderzocht, waarbij in elke mutant een cysteïne-naar-serine mutatie is geïntroduceerd om dimerisatie van cystatine B te voorkomen. Op basis van de context uit de kristalstructuur werd leucine 73 gemuteerd naar glycine, histidine 75 naar glycine en tyrosine 97 werd veranderd in alanine. De twee glycine-mutaties werden geïntroduceerd om het belang van de histidine 75- en leucine 73-zijketens voor de binding aan Pepsine te onderzoeken; het tyrosineresidu werd gemuteerd naar alanine om de interactie tussen de C-terminus van cystatine B en Pepsine te bestuderen.

De drie dubbelmutanten en de drie Syrian enkelmutanten worden getest op hun interactie met een katalytisch inactieve variant van Papain S methyl popin. Deze katalytisch inactieve vorm van het Proteus heeft een methylgroep gebonden aan CYS 25 in de actieve spleet. Omwille van de eenvoud zullen we deze variant gedurende het hele protocol propan noemen.

CFCA is gebaseerd op de meting van de bindingssnelheid onder omstandigheden waarbij de snelheid wordt beperkt door de diffusie van analytmoleculen naar het oppervlak. Dit wordt bevorderd door hoge immobilisatieniveaus van het ligand. Plaats vóór het starten van de immobilisatieprocedure de HEPs-buffer die in de experimenten wordt gebruikt op het linkerblad en steek beide slangetjes erin.

Plaats daarnaast een lege afvalfles op het rechterblad. Plaats vervolgens een nieuwe sensor gypsum five in het instrument, initialiseer dit via de core X 100-software en klik op het startscherm op het item dock chip tool. Klik in de software op start doc.

Gebruik vervolgens de immobilisatiewizard om de preparatie en immobilisatie in te stellen door amine-koppeling aan sensor CM5 te kiezen. Klik op het startscherm op de knop 'Other options' en selecteer vervolgens 'Wizards'. Er verschijnt een venster met de beschikbare wizards. Selecteer 'Immobilization' en klik rechtsonder op de knop 'New'. Het eerste scherm van de immobilisatiewizard verschijnt, waarbij amine-koppeling aan sensor CM5 de standaardinstelling is.

Vink het vakje onder flowcel twee aan om in flowcel twee te immobiliseren. Flowcel één blijft ongewijzigd om deze, uit de drie onderstaande beschikbare opties, als referentievlak te gebruiken. Vink het vakje 'specify contact time' aan, waardoor het rechterdoelniveau verandert in contacttijd, en specificeer een contacttijd van 900 seconden.

Voer vervolgens de immobilisatieparameters in onder 'capturing molecule / ligand solution'. Voer papaïne in. Klik daarna op 'volgende'.

Het volgende scherm toont de indeling van het monsterrek. Positie één wordt gebruikt voor et-ethanolamine om de resterende actieve groepen te aenactiveren na de koppeling van het ligand papaine aan het chipoppervlak. Plaats de ethanolamine-oplossing op positie één en positie twee.

Plaats het ligand papaïne; papaïne is bewaard in een overmaat methylsulfaat en verdund tot 50 µg/mL in 10 mM natriumacetaatbuffer bij pH 4,5. Reconstitueer de EDC- en NHS-koppelingreagentia uit de amine-koppelingkit met dubbel gedestilleerd water. Pipetteer 85 µL EDC in een vial. Sluit deze af en plaats deze op positie drie.

Gebruik hetzelfde volume voor NHS in positie vier. Let op dat bestand vijf afgedekt en leeg moet zijn, zodat het instrument ED, C en NHS in dit bestand kan mengen. Vergeet ook niet om het spoelbestand in positie H2O te vullen met vers gedeïoniseerd water.

Wanneer het rek is gevuld volgens het overzicht op het scherm, klikt u op 'load samples' en plaatst u het rek in het instrument. Zodra het rek is geplaatst, klikt u op 'next'. Voordat de run wordt gestart, verschijnt er een checklist.

Zorg ervoor dat alle controlepunten zijn afgevinkt wanneer dat van toepassing is. De run wordt gestart door op de startknop te drukken. De run wordt gestart tijdens de immobilisatieprocedure.

Gegevens worden in realtime verzameld. Eerst worden de koppelingsreagentia geïnjecteerd. Vervolgens wordt pape aan het chipoppervlak gekoppeld en wordt de procedure afgesloten met de desactivatie van de resterende actieve esters.

Na de run verschijnt een dialoogvenster waarin het resultaat van de run wordt samengevat. In dit venster wordt het immobilisatieniveau weergegeven. De volledige koppelingsprocedure zou moeten resulteren in ongeveer 3000 RU geïmmobiliseerde papaïne.

Zodra papaine op de sensorkchip is geïmmobiliseerd, begint de CFCA-analyse door de cystatine B-mutantmonsters te verdunnen tot een totale concentratie van ongeveer 10 nanomolair in ten minste 300 microliter. Noteer de verdunningsfactor, aangezien we deze later in de assay-opstelling zullen gebruiken. Begin met het openen van het wizard-dialoogvenster, zoals beschreven in de vorige sectie in het concentratiedeel van de assay-map.

Selecteer 'calibration free' en kies vervolgens 'new'. Het eerste scherm van de wizard toont de injectiesequentie. De instellingen kunnen ongewijzigd blijven, aangezien hier sensorchip CM5 en een directe immobilisatie-assaybenadering worden gebruikt.

Klik op het volgende scherm op 'volgende'. Laat de selectievakjes 'prime before run' en 'run startup cycles' aangevinkt. Laat daarnaast het standaard aantal opstartcycli ongewijzigd op drie staan.

Voer heaps buffer in in het veld voor de naam van de oplossing. Klik vervolgens op volgende. Voer in het volgende scherm de naam van de regeneratielosung in, wat 20 millimolar natriumhydroxide is.

Laat de overige parameters ongewijzigd. Klik op 'volgende' om de voorbeeldtabel te bekijken. Stel de monsters in volgens de voorbeeldtabel.

Elke rij in de monstertabel resulteert in twee cycli. Eén met een stroomsnelheid van 10 µL per minuut en één met 100 µL per minuut. Start de run met een blanco.

Voer vervolgens de naam, de verdunningsfactor, de diffusiecoëfficiënt bij 20 °C en het molecuulgewicht in. Voor elke mutant kan de diffusiecoëfficiënt worden berekend met de webtool op de productwebsite. Een link naar deze tool is beschikbaar in de supportnavigator van de software.

Aangezien het wordt aanbevolen om elk monster en duplicaat te analyseren, kopieert u de gehele tabel van de blanco-rij tot aan het laatste monster en plakt u deze onderaan de tabel. Klik op volgende om door te gaan. Het volgende scherm toont het monsterrek.

Plaats de monsters en reagentia in het rek volgens de lay-out die door de software wordt aangegeven. Laad het rek in het instrument door op de knop voor het laden van monsters te drukken. Klik vervolgens op volgende.

Nadat de monsters zijn geladen, verschijnt er een herinneringsscherm met een checklist. Controleer of alles is afgevinkt en druk vervolgens op start. De gegevens worden tijdens de run in realtime verzameld.

Sluit het venster met de verzamelde gegevens zodra de run is voltooid. Merk op dat er een nieuw resultaatitem in het hoofdvenster is verschenen. Selecteer het nieuwe resultaatitem en klik op de knop om de concentraties uit de gegevens te berekenen.

Evalueer via core X 100. De evaluatiesoftware wordt gestart waarbij alle verzamelde gegevens worden weergegeven; selecteer vanuit de werkbalk concentratieanalyse en vervolgens kalibratievrij uit het menu. Kies in het eerste venster de gegevens die in de analyse moeten worden opgenomen.

Scroll door de lijst en ga door de weergavelijst om de gegevens van alle monsters te bekijken. Als u bepaalde gegevens wilt uitsluiten, verwijdert u dan het vinkje in de lijst. Klik op volgende om de berekening te starten.

Het CFCA-interactiemodel wordt automatisch gefit op de experimentele gegevens wanneer het fitten is voltooid; de resultaten voor elk monster worden weergegeven in het resultatenvenster. Loop door de fits voor elk monster door de overeenkomstige rij in de tabel te selecteren. De kolom met de naam gemeten concentratie toont de concentratie in het geanalyseerde monster.

De concentratie in het oorspronkelijke monster wordt berekend aan de hand van de eerder ingevoerde verdunningsfactor en wordt weergegeven in de kolom berekende concentratie; klik bij voltooiing op 'finish' om het resultaat op te slaan. Nu we de concentraties van de eiwitten uit de CFCA-analyse kennen, hebben we een uitstekende basis voor onze daaropvolgende kinetische metingen. Kinetische analyse zal ons nu helpen de betekenis van cruciale aminozuurresiduen voor het bindingsmechanisme te begrijpen.

Laten we beginnen met de opstelling voor de kinetische analyse. De kinetische analyse begint met het plaatsen van een nieuwe CM5-sensorchip in het instrument via het startscherm. Kies voor het maken van een assay-workflow voor kinetische affiniteit.

In de linkerbovenhoek verschijnt een dialoogvenster waarin informatie over het ligand wordt ingevoerd. Voer de naam papain in het vak voor de ligandnaam in en kies een ander eiwit uit de lijst met soorten. Selecteer vervolgens immobilize ligand covalently using sensor chip CM five uit de twee alternatieve methoden voor ligandkoppeling; de aanbevolen workflow voor de assay wordt nu aan de rechterkant van het venster weergegeven.

Het begint met een immobilisatiestap, gevolgd door een assaystap. Druk op 'doorgaan' om verder te gaan. Sla de assay-workflow op zoals gevraagd door een naam in te voeren en op 'opslaan' te drukken.

De software geeft nu de workflow van de assay weer met knoppen die bij elke stap horen. De eerste stap onder de voorbereiding van het sensoroppervlak is het bepalen van een mobilisatie-pH. Aangezien deze pH bekend is, klikt u op 'bekende waarde invoeren' (enter known value) in het dialoogvenster dat verschijnt.

Voer de buffernaam acetaat en pH 4,5 in en kies opslaan. De workflow van de assay is nu bijgewerkt met een groen vinkje om aan te geven dat deze stap is voltooid. Het is nu tijd om te immobiliseren; druk op de run-knop bij de immobilisatiestap.

Dit opent dezelfde wizard als die werd gebruikt voor propaan en immobilisatie voor de CFCA-analyse; de immobilisatie van papine voor kinetische analyse wordt hier op dezelfde manier ingesteld, behalve dat er een meer verdunde oplossing gedurende een kortere tijd wordt geïnjecteerd. Dit is om minder papine te immobiliseren, zodat situaties worden vermeden waarin de bindingsnelheden van de cystatine B-mutanten worden beperkt door diffusie, waardoor kinetische gegevens onafhankelijk gemeten kunnen worden. Aangezien de naam van het ligand en de pH voor immobilisatie in vorige stappen van de assay-workflow zijn ingevoerd, zijn deze hier beide vooraf ingesteld.

De enige vereiste update is 50 seconden voor de contacttijd. De immobilisatie gaat vervolgens verder zoals eerder beschreven. De verwachte binding na het immobilisatieniveau is 50 R ru.

Een groen vinkje naast de startknop geeft aan dat de immobilisatie is voltooid. Voer vervolgens de regeneratieoplossing in de workflowstap in. Vind de regeneratiecondities door op 'bekende waarden invoeren' te klikken in het dialoogvenster dat verschijnt.

Voer de regeneratie-oplossing en de contacttijd in. Klik vervolgens op opslaan. Nu het ligand is geïmmobiliseerd en de regeneratiecondities zijn ingevoerd, is alles gereed om kinetische gegevens te genereren. Druk in het vak voor de kinetische Affiniteitsassay op de startknop voor de eerste stap in de kinetiek.

De Affinity wizard beschrijft de injectierevolutie van elke cyclus voor single cycle kinetics, wat hier wordt gebruikt; er is geen reden om iets te wijzigen. Klik op volgende om door te gaan. Houd in de volgende stap de standaardinstellingen aan die aangeven dat het systeem voor de run moet worden geprimed.

Kies ervoor om één opstartcyclus uit te voeren om het chipoppervlak te equilibreren. Definieer vervolgens de injectieparameters voor het monster. Aangezien de regeneratieoplossing eerder is gespecificeerd en de instelling is vooraf gedefinieerd, is het niet nodig om enige van de parameters op het scherm te wijzigen.

Klik op volgende. Specificeer ten slotte de monsters. Voer voor elke mutante variant twee rijen in: één blanco en één met monster.

Een blanco cyclus wordt aangegeven door de parameter voor de hoogste concentratie op nul in te stellen. Er kunnen twee Cystatine B-varianten in elke run worden geplaatst. Voer voor elke mutant het molecuulgewicht, de hoogste concentratie en de verdunningsfactor in, en druk op volgende.

Op het volgende scherm is het monsterrek aangegeven. Bereid een verdunningsreeks van de eiwitmonsters voor en plaats de flacons met doppen in het rek. Zoals op het scherm wordt aangegeven, wordt een flacon met buffer in positie 13 geplaatst en een flacon met de regeneratie-oplossing in positie 14. Zorg ervoor dat de waterpositie met vers water wordt gevuld.

Plaats het rek in het apparaat en laad de monsters door op de knop 'monsters laden' te drukken en klik vervolgens op 'volgende'. Voer, zoals eerder beschreven, een laatste controle uit voordat u begint met het experiment door op 'start' te drukken; de interactiegegevens verschijnen in realtime. Wanneer de run is voltooid, gaat u onmiddellijk over tot het analyseren van de overige cystatine B-varianten zoals zojuist gedemonstreerd.

Als de overige cystatine B-varianten opeenvolgend worden geanalyseerd, kan de prime-stap en de startcyclus worden weggelaten door de overeenkomstige selectievakjes in de stap uit te vinken. Wanneer elke run is voltooid, kan de data via de link worden geraadpleegd. Alle resultaten bevinden zich in de workflow van de assay.

Er verschijnt een dialoogvenster met alle resultaten die binnen deze workflow zijn gegenereerd. Om de kinetische snelheidsconstanten te berekenen, selecteert u het te evalueren resultaat en drukt u op evaluate; de core X 100 evaluatiesoftware wordt opnieuw gestart en toont alle verzamelde gegevens. Selecteer kinetics affinity in het menu van de werkbalk.

In het eerste scherm wordt de cysteïne drie naar serine mutant geselecteerd voor evaluatie. De gegevens van deze mutant worden samen met de blanco run die voor deze mutant is uitgevoerd, weergegeven; klik op Volgende om door te gaan. Het volgende scherm toont de gegevens waarbij de blanco run van de run met monster is afgetrokken.

Kies ervoor om de kinetiek te evalueren door op de knop kinetiek te klikken. Kies nu om de gegevens te fitten aan een one-to-one interactiemodel. Door op de knop fit te klikken, wordt de fit op het scherm weergegeven terwijl deze wordt berekend.

Zodra deze gereed is, worden de kwaliteitscontroles automatisch toegepast en onderaan gemarkeerd. Loop de kwaliteitscontrole-items na en bekijk vervolgens de sensorgramdata om er zeker van te zijn dat de sensorgrammen voldoende kromming vertonen. Bekijk daarnaast de residuplot die de verschillen tussen de verzamelde gegevens en het gefitte model weergeeft.

Let op systematische en niet-willekeurige afwijkingen. Deze fit is acceptabel. Bekijk nu de kinetische gegevens in het rapporttabblad.

De associatiesnelheidsconstante, de dissociatiesnelheidsconstante en de equilibriumdissociatieconstante. Druk na voltooiing op finish en herhaal dezelfde procedure voor alle andere mutanten. Hier zijn representatieve resultaten van de CFCA-analyse voor de verschillende onderzochte cystatine B-varianten.

De gegevens van de specifieke bindingsconcentratie zijn geëxtraheerd uit de sensorgrammen verkregen bij stroomsnelheden van 10 en 100 microliters per minuut. Wanneer de concentratie bepaald door een twee 80 meting wordt vergeleken met die bepaald door CFCA, is duidelijk dat hoewel het eiwit in de meeste gevallen volledig actief is voor de leucine 73 glycine variant, de fractie actief eiwit zeer laag is. De kinetiek van de binding van cystatine B-varianten aan pepsine wordt bepaald met behulp van single cycle kinetiek.

De sensorgrammen tonen blanco- en referentie-gesubtraheerde gegevens, waarbij de kinetiek voor een één-op-één interactiemodel in het zwart is overgelegd. De specifieke bindingsconcentratie gemeten door CFCA voor de leucine 73 variant is slechts ongeveer 10% van de totale proteïneconcentratie zoals bepaald door een twee 80 meting. Wanneer de juiste concentratie wordt gebruikt bij het berekenen van de kinetische parameters, wordt duidelijk dat de associatiesnelheid voor leucine 73 vergelijkbaar is met die van de andere varianten.

Hoewel de associatiesnelheden van de mutanten vergelijkbaar zijn met die van het wildtype-eiwit, kan de dissociatiesnelheidsconstante van de mutanten bijna twee grootteordes hoger zijn, met een overeenkomstige toename van de equilibriumdissociatieconstante. De verminderde affiniteiten zijn hoofdzakelijk afhankelijk van verhoogde dissociatiesnelheden, wat aangeeft dat zowel de tweede bindingslus als het C-terminale uiteinde van cystatine B bijdragen aan de bindingsaffiniteit door de inhibitor gebonden te houden aan het enzym zodra het complex is gevormd. Het gebruik van kalibratievrije concentratieanalyse was essentieel voor deze conclusie, omdat bleek dat een van de mutanten een zeer lage bindingsactiviteit had. Mijn collega Pol heeft u nu laten zien hoe u de Biacore X 100 kunt gebruiken in een gestructureerde functionele studie. Bij het uitvoeren van deze experimenten is het belangrijk om te onthouden dat, hoewel zowel de concentratie- als de kinetische analyse zijn gebaseerd op dezelfde bindingsprocedure, de experimentele omstandigheden zeer verschillend zijn.