Het belang van correcte eiwitconcentratie voor Kinetics en affiniteit Bepaling in structuur-functie analyse

Het algemene doel van dit videoartikel is om antwoorden te geven op de volgende twee vragen. Ten eerste, kunnen studies van eiwitinteracties betrouwbaarder worden gemaakt door het meten van het fractie van een eiwitmonster dat daadwerkelijk in staat is om zich te binden aan een ander eiwit? Ten tweede, hoe kan kinetische analyse ons een beter begrip geven van structuur-functierelaties?

Beide vragen worden behandeld in een experiment met Corp X 100, een instrument dat eiwitinteracties in realtime detecteert zonder het gebruik van labels. Dit experiment zal de interactie van bovien cystatine B met de cystine protease papaïne onderzoeken, de kristalstructuur van de twee eiwitten in complexe punten wijst op verschillende residuen die betrokken zijn bij de binding aan de protease om te bepalen hoe elk van de interacterende residuen de cystatine B papin interactie beïnvloedt. Verschillende cystatine B varianten worden geproduceerd via plaatsgerichte mutagenese.

Bij dergelijke experimenten is er altijd de mogelijkheid dat recombinante eiwitten zich niet correct vouwen, aggregatie of verslechtering vertonen, wat leidt tot onjuiste en onherhaalbare resultaten. VIACORE X 100 heeft de mogelijkheid om het fractie van het eiwit dat beschikbaar is voor binding te bepalen door middel van kalibratievrije concentratieanalyse, afgekort CFCA. Deze aanpak maakt het mogelijk om de concentratie van eiwit met behouden bindingsactiviteit te bepalen, zelfs wanneer kalibratiestandaarden niet beschikbaar zijn.

CFCA wordt hier gebruikt om de concentratie van de cystatine B varianten te bepalen. Deze gegevens worden vervolgens gebruikt als input bij de bepaling van de bindingskinetiek van de cystatine B varianten tot Pepin, die ook wordt beoordeeld met behulp van BOR X 100. Hoi, ik ben CLA gram van GE Healthcare in Zweden.

Vandaag zal mijn collega Eva Pool je laten zien hoe je structuurfunctierelatieanalyse kunt uitvoeren met behulp van BOR X 100. Recombinante eiwitten kunnen onjuist vouwen of verminderde bindingsactiviteit vertonen na verloop van tijd, en dit gedrag kan niet worden gedetecteerd door methoden die afhankelijk zijn van de totale concentratiemeting. Dit kan in feite leiden tot onjuiste kinetische gegevens na concentratiemetingen door kalibratievrije concentratieanalyse. B.A core X 100 wordt gebruikt om de kinetica en affiniteit van de interactie van cystatine B varianten met pepaan te analyseren.

Deze parameters zullen inzicht geven in het bindingsmechanisme. We beginnen met een korte uitleg van het experimentele ontwerp, dus laten we beginnen. De interactie tussen de cystine, protease, papin, en de inhibitor cystatine B wordt gedomineerd door hydrofobe contacten zoals onthuld door de kristalstructuur van de twee eiwitten in complex.

Vanaf de inhibitorzijde zijn de contactgebieden de N en C terminale Ns en twee haarspeldlussen. In dit onderzoek worden vier mutanten onderzocht, die elk cysteïne drie tot Syrië mutatie bevatten die is geïntroduceerd om dimerisatie van cystatine B te voorkomen. Op basis van de context die in de kristalstructuur is onthuld, werd leucine 73 gemuteerd naar glycine, histidine 75 naar glycine en tyrosine 97 werd veranderd in alanine. De twee glycine mutaties werden geïntroduceerd om de belangrijkheid van de histidine 75 en leucine 73 zijketens voor de binding aan Pepin te onderzoeken, de tyrosineresidu werd gemuteerd naar alanine om de interactie tussen het C-uiteinde van cystatine B en Pepin te onderzoeken.

De drie dubbele mutanten evenals INE drie tot Syrië enkele mutant worden getest op hun interactie met een katalytisch inactieve variant van Papain S methyl popin. Deze katalytisch inactieve vorm van de Proteus heeft een methylgroep verbonden aan CYS 25 in de actieve kloof. Voor de eenvoud zullen we deze variant propaan noemen gedurende het protocol.

CFCA is gebaseerd op de meting van de bindingssnelheid onder omstandigheden waarbij de snelheid beperkt wordt door diffusie van analietmoleculen naar het oppervlak. Dit wordt begunstigd door hoge immobilisatieniveaus van de ligand. Voordat u begint met de immobilisatieprocedure, plaatst u de HEPs buffer die in de experimenten wordt gebruikt op de linkerlade en plaatst u beide slangen.

Plaats ook een lege afvalfles op de rechterlade. Plaats vervolgens een nieuwe sensor gips vijf in het instrument, initialiseer via core X 100 software, en klik op het dock chip tool item op het startscherm. Klik op start doc in de software.

Gebruik vervolgens de immobilisatiewizard om de pape en immobilisatie in te stellen door middel van koppeling naar censuur CM vijf vanaf het startscherm, klik op de andere opties knop en selecteer vervolgens wizards. Dit toont een venster met de beschikbare wizards. Selecteer immobilisatie en klik vervolgens op de nieuwe knop. Rechtsonder verschijnt de eerste scherm van de immobilisatiewizard. Koppeling naar sensor gips vijf is de standaard.

Vink het vakje aan onder flow cell twee om te immobiliseren in flow cell twee. Flow cell een wordt ongewijzigd gelaten om het als referentieoppervlak te gebruiken van de drie beschikbare opties hieronder. Vink het vakje specificeer contacttijd aan op de rechterkant, het doelniveau verandert in contacttijd, specificeer een contacttijd van 900 seconden.

Voer vervolgens de immobilisatieparameters in onder vangen molecuul/ligandoplossing. Voer papaïne in. Klik vervolgens op volgende.

Het volgende scherm toont de lay-out van de steekproefrekken. Positie één zal et ethanolamine bevatten dat wordt gebruikt om de resterende activiteit te deactiveren na de koppeling van de ligand papaïne aan het chipoppervlak. Plaats de ethanolamine-oplossing op positie één in positie twee.

Plaats de ligand papaïne. Papaïne wordt opgeslagen in een overmaat methylsulfaat en gedistilleerd tot 50 microgram per milliliter in 10 millimolair natriumacetaatbuffer. pH 4,5. Reconstrueer de EDC en NHS koppelingsreagentia uit de amine koppelingskit met dubbel gedestilleerd water, pipet 85 microliter EDC in een flesje. Sluit het af en plaats het in positie drie.

Gebruik hetzelfde volume voor NHS in positie vier. Merk op dat de file vijf moet worden afgesloten en leeg zijn om het instrument ED te laten mengen, C en NHS in dit bestand. Vergeet ook niet om de wasfile in positie H2O te vullen met vers gedeïoniseerd water.

Wanneer het rek is gevuld volgens de schets op