Name: Microfluïdische Co-cultuur van epitheliale cellen en bacteriën voor het onderzoeken van Oplosbaar Signal-gemedieerde interacties (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-20T17:03:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: Leer een microfluïdische co-cultuurmethode voor het bestuderen van gastheer-pathogeen interacties met HeLa-cellen en E. coli. Dit model bootst het gastro-intestinale systeem na en visualiseert kolonisatie door EHEC.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd mede ondersteund door de National Science Foundation (cbet 0.846.453) en de National Institutes of Health (1R01GM089999).

1. Fabricage van silicium meesters met behulp van standaard SU-8 fotolithografie een (niet getoond in deze video). <ol><li> Gebruik standaard SU-8 fotolithografie methoden om een ​​SU-8 "masters" (SU-8 2050, Microchem, Newton, MA) voor het fabriceren van de verschillende componenten (PDMS membranen van verschillende dikte, co-cultuur kamer) in een cleanroom. Creëren Deze master-mallen kunnen worden vervaardigd op een microfabricage faciliteit (bijv. Stanford Microfluidics Foundry; <a href="http://thebigone.stanford.edu/foundry/">http://thebigone.stanford.edu/foundry/</a> ). </li><li> Voorafgaand aan PDMS replicatie, bloot de SU-8 masters te fluorosilane damp in een exsiccator verbonden aan een vacuüm bron om gemakkelijk los van het PDMS te vergemakkelijken van de meester. Voeg een druppel fluorosilane op een papieren handdoek en vacuüm voor een min van toepassing zijn. Verwijder het vacuüm en laat 30 min voor de depositie van fluorosilane. Houd de SU-8 meester in een gesloten container voor toekomstig gebruik. </li></ol> 2. Replica gieten van PDMS van de SU-8 meester 2 <ol><li> De vloeibare laag en de controle laag zijn gemaakt door replica gieten van PDMS van de SU-8 master. </li><li> Meng de PDMS pre-polymeer en cross-linker op een 10:01 gew. verhouding en ontgassen in een exsiccator voor een uur (of tot de luchtbellen zijn verwijderd uit het PDMS mengsel). </li><li> Plaats de SU-8 meester in een petrischaal en zorgvuldig de PDMS mengsel giet op de top van de SU-8 master. Ontgas de PDMS opnieuw. </li><li> Spin de mal bij 1200 rpm gedurende een minuut om een ​​uniform PDMS dikte van ongeveer 100 urn krijgen op de mal. </li><li> Verhit de petrischaal met de PDMS en de SU-8 meester schimmel bij 80 ° C gedurende een uur aan het PDMS genezen. </li><li> Verwijder de uitgeharde PDMS bedekte SU-8 meester van de kookplaat. </li><li> Schil de PDMS mal van de SU-8 master. </li><li> Boor vier gaten in het PDMS mal met behulp van een 20 gauge stompe naald-end voor twee bacteriën inhammen, een stopcontact en een pneumatische poort. </li></ol> 3. Verlijmen van Multilayer PDMS-apparaten: Dit apparaat is gemonteerd met drie lagen: een toplaag die het belangrijkste kanaal, een middelste pneumatische laag, en een onderste bacteriële laag die de kanalen voor bacteriën bevat. De drie lagen worden gemonteerd, zoals hieronder beschreven. <ol><li> Wet van de PDMS membranen met methanol en zorgvuldig verwijderen hen van hun SU-8 meester mal met een schone pincet. Plaats membraan op een teflon vel. </li><li> Plaats de pneumatische membraan en de vloeibare laag op een zuurstof plasma kamer. Zet plasma gedurende 40 sec (zuurstofdruk 10 sccm, RF power 100W). </li><li> Na blootstelling aan plasma, uit te lijnen (binnen 10 minuten) het membraan aan de onderkant PDMS kanaal met behulp van een tang. Het toevoegen van methanol op het membraan en het PDMS lagen helpt het vrije verkeer van de lagen, en maakt afstemming gemakkelijker. In dit geval wordt het apparaat op een stukje gaas om de methanol dampen te ontsnappen. </li><li> Cure de uitgelijnde PDMS lagen op een kookplaat bij 80 ° C gedurende 8 uur </li><li> Na het verlijmen van de pneumatische membraan op de onderste laag, herhaalt u de stappen 3,2 tot 3,4 voor het verlijmen van de top-kanaal op de verzamelde samengestelde PDMS-apparaat. </li></ol> 4. Montage van de PDMS-apparaat 3,4 <ol><li> Boor gaten in de inlaat en uitlaat poorten die worden gebruikt voor het zaaien eukaryote cellen en bacteriën. </li><li> Sluit Tygon slang (0,01 inch OD) naar de havens en bedienen van de pneumatische laag door te trekken met een 20 ml spuit. </li><li> Plaats de PDMS-model en een pre-gereinigde glazen glijden in een zuurstof plasma kamer. Zet plasma voor 20 seconden (zuurstofdruk 20 sccm, RF power 300W) zonder toepassing van het vacuüm. </li><li> Om contact tussen het eiland muur (PDMS) binding aan het glas schuiven te voorkomen, direct verbinding een injectiespuit met het apparaat en toe te passen vacuüm door te trekken van de spuit en hield het op zijn plaats. </li><li> Druk de PDMS-model op het glas (binnen 2 minuten). </li><li> Cure de PDMS-apparaat bij 80 ° C gedurende 10 minuten. </li></ol> 5. Het behandelen van het glasoppervlak met fibronectine <ol><li> Steriliseer het apparaat onder UV gedurende 15 minuten na het aansluiten van Tygon slang aan elke poort. </li><li> Vullen en de stroom van de gesteriliseerde PBS in het kanaal om eventueel vuil te verwijderen in het kanaal. Solliciteer stroom gedurende 10 minuten om luchtbellen te verwijderen. De luchtbellen kan gemakkelijk ontsnappen aan de PDMS omwille van zijn gas doorlaatbaarheid. </li><li> Vul een kleurstof oplossing in de luchtleiding om de vorming van luchtbellen in het kanaal te voorkomen. </li><li> Ter bevordering van eukaryote cel zaaien op het glas, invoering van een 1 ug / ml-oplossing van fibronectine in het apparaat en incubeer gedurende 40 minuten bij 37 ° C. </li><li> Was het teveel aan fibronectine met 1 ml van de groei media. </li></ol> 6. Vorming en meting van commensale E. coli biofilm ineilanden <ol><li> Verdun de commensale bacteriën (bijvoorbeeld E. coli BW25113/pCM18) in M9 minimale media OD 600 ~ 1 voor het vormen van een commensale biofilm in de gesloten kamers / eilanden. </li><li> Sluit het eiland muur door het toepassen van positieve vloeistofdruk. Een zelfgemaakte air-to-liquid druk converter wordt gebruikt om de vorming van luchtbellen in het kanaal te voorkomen. </li><li> Introduceer de commensale E. coli in de eilanden met de klep dicht, en laat bacteriën gedurende 1 uur hechten bij 32 ° C. </li><li> Was de losse bacteriën en perfuseren een verdunde bacteriële suspensie (OD 600 ~ 0.05) op 0.25mL/hr gedurende 12 uur. </li><li> Spoel de biofilm met vers DMEM groei media losjes verbonden bacteriën te verwijderen en voor de eukaryote cel bevestiging voor te bereiden. </li><li> Het imago van de biofilm met een Leica TCS SP5 confocale laser scanning microscoop (Bannockburn, IL), en visualiseer de biofilm architectuur van het gebruik van de IMARIS software 5. </li></ol> 7. Zaaien eukaryote cellen rond bacteriële eilanden 6-8 <ol><li> Trypsinize HeLa cellen van weefselkweek kolf en resuspendeer in DMEM media voor een zaaien dichtheid van 5 x 10 5 cellen / ml. </li><li> Introduceer HeLa cellen in het apparaat op een debiet van 2 ml / min met behulp van een Picoplus injectiepomp (Harvard Apparattus, MA). Zorg ervoor dat het eiland muur is verlaagd zodat de bacteriële biofilm staat los van de HeLa cel regio. Deze stap moet worden uitgevoerd op het podium van een lichtmicroscoop, zodat de uniformiteit van zaaien kan worden bepaald. </li><li> Klem de cel stopcontact om de beweging van de celsuspensie te verminderen in het kanaal en incubeer gedurende 6 uur bij 37 ° C in een 5% CO 2 incubator. </li><li> Perfuseren het apparaat met groeimedium bij 0,5 ml / uur tot losse cellen te verwijderen. </li><li> Vernieuw de DMEM media voor HeLa en commensale E. coli elke 6 uur. </li></ol> 8. Introductie van pathogene bacteriën in het eiland en de blootstelling aan eukaryote cellen <ol><li> Bereid E. coli O157: H7 (EHEC) om HeLa cellen te infecteren bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 100:1 200:1 (aantal EHEC per HeLa cel). </li><li> Afspoelen en wassen losjes verbonden commensale bacteriën. </li><li> Introduceer een verdunde EHEC suspensie (OD 600 ~ 0.1) in de eilanden. </li><li> Incubeer het apparaat bij 37 ° C in een 5% CO 2 incubator gedurende 6 uur zonder stroom te laten EHEC te worden blootgesteld aan signalen aanwezig zijn in de commensale biofilm. </li><li> Til de PDMS muur om EHEC bloot in de commensale eilanden HeLa cellen voor 6 uur. </li><li> Spoel het kanaal met PBS en vlekken voor de levende en dode cellen met behulp van de Live / Dead kit (L3224, Invitrogen, CA). </li><li> Afbeelding meerdere locaties op een Zeiss Axiovert 200M fluorescentie microscoop en een schatting van het aantal levende en dode cellen. </li></ol> 9. Vertegenwoordiger Resultaten 9 De volgorde van de gebeurtenissen in het maagdarmkanaal infecties werd nagebootst door het ontwikkelen van een monolaag van HeLa cellen en een commensale E. coli biofilm en het blootstellen van EHEC op de commensale biofilm voorafgaand aan de infectie van HeLa-cellen. De stappen die betrokken zijn bij de fabricage van de microfluïdische co-cultuur model zijn weergegeven in figuur 1. Figuur 2A toont een 3-dimensionale weergave van de co-cultuur-apparaat. De twee regio's in de co-cultuur het apparaat van de eukaryote cel cultuur kamer en de bacteriële eiland zijn weergegeven in figuur 2B met verschillende kleuren kleurstoffen (paars voor de eukaryotische regio's en groen voor de bacteriële eiland). De haalbaarheid van het isoleren van de bacteriecultuur regio's uit de omliggende eukaryotische regio is weergegeven in figuur 2C gebruik van kleurstoffen. Figuur 3 laat representatieve resultaten van co-cultuur van epitheliale cellen en bacteriën. Figuur 3A toont kolonisatie van de commensale biofilm (groen) eiland EHEC (rood). Figuur 3B toont het naast elkaar plaatsen van epitheliale cellen en commensale E. coli met EHEC in de bacteriële eiland. De RFP uitdrukken EHEC en GFP uitdrukken commensale bacteriën zijn gelokaliseerd op het eiland toen het PDMS wand wordt verlaagd, ter illustratie van de haalbaarheid van het isoleren van de bacteriële eiland van epitheelcellen. <img src="/files/ftp_upload/1749/1749fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1: Mobiele zaaien regeling in de co-cultuur model. (1) De PDMS muur is verlaagd naar een eiland vormen, zijn commensale bacteriën geïntroduceerd in het eiland, en fibronectine is gestroomd rond het eiland. (2) HeLa cellen gezaaid in de regio's rond het eiland. (3) Na HeLa cellen samenvloeiing te bereiken en de commensale biofilm heeft ontwikkeld, wordt EHEC geïntroduceerd in het eiland. (4) De PDMS wand wordt opgeheventot HeLa cellen rond het eiland te EHEC bloot te leggen. Inzet toont details van de klep bediening. <img src="/files/ftp_upload/1749/1749fig2a.jpg" alt="Figuur 2a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2a"> <img src="/files/ftp_upload/1749/1749fig2bc.jpg" alt="Figuur 2bc" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2bc"> Figuur 2: Microfluïdische model voor co-cultuur van epitheliale cellen en bacteriën. (A) Drie-dimensionale weergave van de co-cultuur apparaat met pneumatisch aangedreven trapping regio's voor het vormen van bacteriële eilanden onder de epitheelcellen. Elke bacteriële eiland (1200 pm diameter en 1000 um uit elkaar) heeft een aparte inlaat en uitlaat voor het verstrekken van groei media en het verwijderen van afval van het eiland. (B) microfoto van de co-cultuur apparaat met kleurstoffen met de verschillende regio's (epitheelcellen zone, bacteriële eilanden). (C) De trouw van de pneumatische opvangsysteem wordt aangetoond door het verlagen van de PDMS muur (linker paneel) met behulp van een pneumatisch-geactiveerde kanaal (blauw), de invoering van paars kleurstof in de gesloten eiland eilanden, en vloeiende gele kleurstof om het voor 48 uur Wanneer de PDMS muur is (rechter paneel) verhoogd, is het eiland regio blootgesteld aan de omliggende gele kleurstof. Schaalbalk staat voor 500 pm. <img src="/files/ftp_upload/1749/1749fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3: Co-cultuur van HeLa cellen en bacteriën. (A) Fluorescentie beeld van RFP-expressie EHEC en GFP expressie E. coli in BW25113 eiland. (B) Overlay van de verzonden, groene en rode fluorescentie beelden in het apparaat. Schaalbalk staat voor 200 pm.

<ol><li>McDonald, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prototyping+of+microfluidic+devices+in+poly%28dimethylsiloxane%29+using+solid-object+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Prototyping of microfluidic devices in poly(dimethylsiloxane) using solid-object printing.</a> Anal Chem. 74, 1537-1545 (2002).</li>
<li>Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+fabrication+of+integrated+passive+valves+and+pumps+for+flexible+polymer+3-dimensional+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Design and fabrication of integrated passive valves and pumps for flexible polymer 3-dimensional microfluidic systems.</a> Biomed Microdevices. 4, 117-121 (2002).</li>
<li>Baek, J. Y., Park, J. Y., Ju, J. I., Lee, T. S., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pneumatically+controllable+flexible+and+polymeric+microfluidic+valve+fabricated+via+in+situ+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Micromech+Microeng%22%5BJournal%5D)">A pneumatically controllable flexible and polymeric microfluidic valve fabricated via in situ development.</a> J Micromech Microeng. 15, 1015-1020 (2005).</li>
<li>Grover, W. H., Ivester, R. H., Jensen, E. C., Mathies, R. A., A, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+multiplexed+control+of+latching+pneumatic+valves+using+microfluidic+logical+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Development and multiplexed control of latching pneumatic valves using microfluidic logical structures.</a> Lab Chip. 6, 623-631 (2006).</li>
<li>Lee, J., Jayaraman, A., Wood, T. K., K, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indole+is+an+inter-species+biofilm+signal+mediated+by+SdiA%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Indole is an inter-species biofilm signal mediated by SdiA.</a> BMC Microbiol. 7, 42-42 (2007).</li>
<li>Hsu, C. H., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+with+tunable+topographies%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Phys+Lett%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices with tunable topographies.</a> Appl Phys Lett. 86, 023508-023508 (2005).</li>
<li>Hui, E. E., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromechanical+control+of+cell-cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Micromechanical control of cell-cell interactions.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5722-5726 (2007).</li>
<li>Lee, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+sensing+hydrogel+microstructures+into+micropatterned+hepatocellular+cocultures%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Integrating sensing hydrogel microstructures into micropatterned hepatocellular cocultures.</a> Langmuir. 25, 3880-3886 (2009).</li>
<li>Kim, J., Hegde, M., Jayaraman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-culture+of+epithelial+cells+and+bacteria+for+investigating+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Lab-on-Chip%22%5BJournal%5D)">Co-culture of epithelial cells and bacteria for investigating host-pathogen interactions.</a> Lab-on-Chip. , (2009).</li>
</ol>

Conventionele testen voor pathogeen bevestiging en kolonisatie gebruik maken van een monolaag van eukaryote cellen in weefselculturen platen waarin ziekteverwekkers worden toegevoegd. Deze modellen zijn fysiologisch niet relevant zijn als ze niet een commensale bacteriële biofilm ontwikkeld op eukaryote cellen te nemen. Eenvoudige toevoeging van een pre-volwassen bacteriecultuur aan eukaryote cellen is onwaarschijnlijk dat leiden tot deze bevestiging als biofilms zijn zeer georganiseerde structuren die zich ontwikkelen ...

<table><tbody><tr><td>SU-8 2050</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hoogresolutie (16.256 dpi) fotolithografiemasker</td><td>Fineline-Imaging Inc, CO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trichloro(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-tridecafluorooctyl)silaan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77279</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>184 SIL ELAST KIT 0,5KG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30002.02</td><td></td></tr><tr><td> Programmeerbare spincoater</td><td>Laurell Tech Corp</td><td>WS0650S</td><td></td></tr><tr><td>Mask aligner</td><td>Neurotronix</td><td>Q4000</td><td></td></tr><tr><td>Zuurstofplasma-etser</td><td>March Plasma System, CA</td><td>CS-1701</td><td></td></tr><tr><td>Spuitpomp</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit</td><td>Invitrogen</td><td>L-3224</td><td></td></tr></tbody></table>

microfluïdische co-cultuur van epitheliale cellen en bacteriën voor het onderzoeken van oplosbaar signal-gemedieerde interacties

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

De menselijke gastro-intestinale (GI) stelsel is een unieke omgeving waarin darmepitheelcellen en niet-pathogene (commensale) bacteriën naast elkaar bestaan. Men heeft voorgesteld dat de micro-omgeving die de pathogeen ontmoetingen in de commensale laag is van belang bij het bepalen van de mate van kolonisatie. Huidige cultuur methoden voor onderzoek pathogeen kolonisatie zijn niet goed geschikt voor het onderzoeken van deze hypothese omdat zij co-cultuur van bacteriën en epitheelcellen niet in staat stellen op een wijze die het maag-darmkanaal micro-omgeving nabootst. Hier beschrijven we een microfluïdisch co-cultuur model dat onafhankelijke cultuur van eukaryote cellen en bacteriën mogelijk maakt, en het testen van het effect van de commensale micro-omgeving op de ziekteverwekker kolonisatie. De co-cultuur model wordt aangetoond door het ontwikkelen van een commensale<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Biofilm onder HeLa cellen, gevolgd door de introductie van enterohemorragische<em&gt; E. coli</em&gt; (EHEC) in de commensale eiland, in een volgorde die de volgorde van gebeurtenissen in het maagdarmkanaal infectie nabootst.

Dit protocol beschrijft een microfluïdisch co-cultuur model voor gelijktijdige en gelokaliseerde cultuur van epitheliale cellen en bacteriën. Dit model kan gebruikt worden voor het onderzoeken van de rol van verschillende oplosbare moleculaire signalen op pathogenese en het scherm van de effectiviteit van de vermeende probiotische bacteriestammen.

Microfluïdische Co-cultuur van epitheliale cellen en bacteriën voor het onderzoeken van Oplosbaar Signal-gemedieerde interacties

Het menselijke gastro-intestinale (GI) tract is een unieke omgeving waarin intestinale epitheelcellen en niet-pathogene (commensale) bacteriën samenleven. Het heeft ...

Dit protocol toont het gebruik van een nieuw microfluidisch co-kweekmodel dat de onafhankelijke kweek van eukaryote cellen en bacteriën mogelijk maakt om het effect van de commensale micro-omgeving op de kolonisatie door pathogenen te testen. Het co-kweekmodel wordt gedemonstreerd door de ontwikkeling van een commensale e coli-biofilm tussen hela-cellen, gevolgd door de introductie van enterohemorragische e coli of EHEC in het commensale eiland, in een volgorde die de reeks gebeurtenissen bij een infectie van het maag-darmstelsel nabootst.De resulterende mate van kolonisatie van epitheelcellen door EHEC wordt gevisualiseerd met fluorescentiemicroscopie. Hallo, ik kom van het laboratorium voor moleculaire systeembiotechnologie van de afdeling Chemical Engineering aan de Texas A&amp;M University. Vandaag tonen we u een procedure voor het samen kweken van bacteriën en eCard-cellen in een micro-apparaat op een manier die de organisatie in het menselijke maag-darmstelsel nabootst.We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om te bestuderen hoe de kolonisatie van epitheelcellen door pathogene bacteriën wordt beïnvloed door signalen die zij in het maag-darmkanaal tegenkomen vóór de kolonisatie. Laten we beginnen. Bereid voorafgaand aan de experimenten een siliconen master voor, ontworpen en vervaardigd volgens het beoogde experimentele gebruik.Bijvoorbeeld zal de Stanford Microfluidics Foundry de ontworpen masters fabriceren waaruit vervolgens experimentele replicatievormen kunnen worden gemaakt. Voor het in dit protocol beschreven drielaags apparaat zijn vormen nodig voor twee membranen voor de eukaryote celcultuurglaag en de pneumatische laag, en één bacteriële kanaal; de kanaalhoogten voor de bacteriële, pneumatische en eukaryote celcultuurlagen zijn respectievelijk 5, 200 en 100 micrometers. Belicht de SU eight master voordat u een replicatievorm bereidt met fluorocycline-damp in een exsiccator die is aangesloten op een vacuümbron. Om het gemakkelijk losmaken van de PDMS-vorm van de master te vergemakkelijken, voegt u een druppel fluorolane toe aan een papieren handdoek in de vacuümkamer en past u gedurende één minuut vacuüm toe.Verwijder het vacuüm en laat het 30 minuten rusten voor de depositie van fluoro. Bewaar de SU eight master in een Petri-schaal voor toekomstig gebruik om replica-mallen te maken. Bereid PDMS-prepolymeer en crosslinker voor in een gewichtsverhouding van 10 op één en meng deze grondig; ontgas het mengsel gedurende één uur in een vacuümkamer.Om luchtbellen te verwijderen, plaatst u de SU eight master in een petrischaal en giet u voorzichtig PDMS op de master, waarbij vijf gram PDMS wordt gebruikt voor de en 30 gram PDMS voor de bacteriële laag. Ontgas het PDMS opnieuw gedurende 10 minuten om luchtbellen te verwijderen. Centrifugeer vervolgens de mal gedurende één minuut om het PDMS tot een gelijkmatig membraan te verspreiden.In dit protocol wordt het eukaryote celkweekmembraan gecentrifugeerd bij 1200 RPM voor een dikte van 150 micrometer, en het pneumatische membraan bij 800 RPM voor een dikte van 250 micrometer. Bewaar na het centrifugeren de Petrischaal met het gecentrifugeerde PDMS en de SU-8 mastermold gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur voordat deze een uur lang op een warmteplaat bij 80 °C wordt verhit. Om het PDMS te uitharden, bevochtig het PDMS na het uitharden met methanol en pel het voorzichtig van de SU-8 mastermolds met behulp van schone pincetten.Plaats de bacteriële laag onder een stereomicroscoop en boor met een stomp-ended naald van 20 gauge drie gaten: twee inlaatopeningen voor bacteriën en één uitlaatopening. Het drielaags apparaat wordt in de volgende volgorde geassembleerd: eerst wordt de pneumatische laag gebonden aan de bacteriële laag, waarna de eukaryote celcultuurlaag wordt gebonden aan de gecombineerde bacteriële en pneumatische laag.Plaats het pneumatische membraan en de bacteriële laag op een objectglas en stel deze in een zuurstofplasmakamer gedurende 40 seconden bloot aan plasma bij een zuurstofdruk van 10 standard cubic centimeters per minute, of SCCM en een radiofrequente of RF-vermogen van 100 watts. Het toevoegen van methanol aan de membranen vergemakkelijkt de vrije beweging van de lagen en maakt de uitlijning eenvoudiger. Plaats de bacteriële laag binnen 10 minuten na blootstelling aan zuurstofplasma met een pincet en een stereoscoop in een Petrischaal.Lijn het middelste pneumatische membraan uit op de bacteriële laag aan de hand van de inlaat- en uitlaatgaten voor de bacteriën. Plaats na uitlijning de Petrischaal met de uitgelijnde PDMS-structuur gedurende acht uur op een warmteplaat bij 80 °C om deze te hechten. Boor, wanneer dit voltooid is, een gat in de pneumatische laag om het pneumatische kanaal te kunnen regelen.Herhaal vervolgens de stappen van assemblage tot uitlijning om het kanaal voor de eukaryote celkweek te binden aan het geassembleerde samengestelde PDMS-apparaat. Boor gaten in de inlaat- en uitlaatpoorten die worden gebruikt voor het zaaien van eukaryote cellen. Sluit Tigon-slangen aan op de poorten en bedien de pneumatische laag door te trekken met de spuit van 20 milliliter.Plaats de composiet PDMS-structuur en een vooraf gereinigde glazen plaat in een zuurstofplasmakamer. Zet het plasma 20 seconden aan zonder vacuüm aan te brengen. Verwijder de composiet PDMS-structuur uit de zuurstofplasmakamer en sluit er een spuit van 20 milliliter op aan.Trek direct terug om een vacuüm te creëren en zo contact tussen de kleppen en het glas te voorkomen. Schuif binnen één minuut. Druk na plasma-blootstelling de samengestelde PDMS-structuur voorzichtig op het glas.Hard het PDMS-apparaat uit op een warmteplaat bij 80 °C gedurende 10 minuten. Sluit daarna tigon-slangen aan op elke poort en steriliseer het apparaat onder UV-licht gedurende 15 minuten. Vul vervolgens 500 µL steriele PBS in een spuit van 1 mL en breng dit in het kanaal aan om eventuele resten te verwijderen.Als er een luchtbel wordt waargenomen, klem dan de uitlaatslang af met een EC-microcentrifugebuisje en oefen een lichte druk uit om de bel door de gasdoorlaatbare PDMS-lagen te persen. Vul steriel water in het pneumatische kanaal om de vorming van luchtbellen in het kanaal te voorkomen.Een zelfgemaakte lucht-naar-vloeistof drukconverter wordt gebruikt om de vorming van luchtbellen in het pneumatische kanaal te voorkomen. Om de glazen ondergrond voor te bereiden op het zaaien van eukaryote cellen, brengt u 500 µL fibronectine aan in het celkulturgebied via de inlaat voor de eukaryote celcultuur. Gebruik hiervoor een spuit, houd de klep gesloten en incubeer gedurende 40 minuten bij 37 °C.Was tenslotte het overtollige fibronectine uit met één milliliter groeimedium met behulp van de spuitpomp. Het apparaat is nu klaar voor gebruik voor het experiment om een commensale biofilm te vormen; verdun de bacteriën in M9-minimaalmedium tot een OD 600 van ongeveer 1. In dit voorbeeld gebruiken we een laboratoriumstam van E. coli, maar elke niet-pathogene bacteriële stam kan worden gebruikt.Sluit de klep die de bacteriële en eukaryote celkweekregio's scheidt door een positieve vloeistofdruk toe te passen. Breng 0,2 milliliters e coli met een OD 600 van ongeveer 1,0 in de eilanden in met behulp van een spuitpomp en laat de bacteriën gedurende één uur hechten bij 32 graden Celsius. Na incubatie.Perfuse een verdunde bacteriële suspensie met een OD 600 van ongeveer 0,05 en vers M9 minimaal medium bij 0,25 ml per uur gedurende 12 uur. Spoel de biofilm met een spuitenpomp met 0,5 ml vers serumvrij en antibioticavrij DMEM-medium bij 0,5 ml per uur om losgehechte bacteriën te verwijderen en voor te bereiden op de aanhechting van eukaryote cellen; beeld de biofilm af. Gebruik hiervoor een Leica TCS SP5 confocale laserscanmicroscoop en visualiseer de architectuur van de biofilm met behulp van de MS-software.Trypsiniseer HeLa-cellen uit een weefkweekkolf en resuspendeer deze in DMEM-medium tot een totaal volume van 0,1 milliliters bij een zaaidichtheid van 5 × 10⁵ cellen per milliliter. Breng de HeLa-cellen met een stroomsnelheid van 2 milliliters per minuut via een Pico Plus spuitpomp in het eukaryote gebied van het apparaat.Controleer vervolgens met behulp van een lichtmicroscoop of de klep die het gebied met commensale bacteriën scheidt van het gebied met eukaryote cellen volledig is gesloten, zodat de bacteriële biofilm gescheiden is van het celgebied. Klem de celuitlaat met een Eppendorf-microcentrifugebuisje om de beweging van de celsuspensie in het kanaal te beperken en incubeer gedurende zes uur bij 37 °C in een incubator met 5% CO2. Perfundeer het apparaat na incubatie met een spuitpomp met 50 µL DMEM-groeimedium bij 0,5 mL per uur.Vernieuw elke zes uur het DMEM-medium voor de HeLa- en commensale E. coli-regio's om ongebonden cellen te verwijderen. Bereid E. coli O157:H7, of EHEC, in M9-medium voor om de HeLa-cellen te infecteren met een multipliciteit van infectie (MOI) van 100 tot 200 EHEC-cellen per HeLa-cel. Was de losjes gebonden commensale bacteriën uit zoals beschreven in de vorige sectie. Introduceer via een spuitpomp een 100 µL verdunde EHEC-suspensie met een OD600 van ongeveer 0,1 in de eilanden bij een stroomsnelheid van 0,25 mL per uur.Incubeer het apparaat vervolgens gedurende zes uur bij 37 °C in een incubator met 5% koolstofdioxide zonder doorstroming, zodat EHEC wordt blootgesteld aan signalen die aanwezig zijn in de commensale biofilm. Open na de incubatie de klep die de regio's met commensale bacteriën en eukaryote cellen scheidt door middel van een vacuümpomp om een vacuüm te creëren, en houd de klep zes uur open. Hierdoor worden de HEC in de commensale bacteriële biofilm blootgesteld aan HeLa-cellen; incubeer vervolgens opnieuw gedurende zes uur bij 37 °C in een incubator met 5% koolstofdioxide.Voeg de live-dead kleuring toe aan het apparaat dat is voorbereid volgens de instructies van de fabrikant. Om de levensvatbaarheid van de helo-cellen te kleuren, injecteert u 0,1 milliliters van de standaardoplossing in het eukaryote gebied van het apparaat met een spuit van één milliliter als controle voor het schatten van de helo-celdood. In afwezigheid van EHEC herhaalt u de vorige drie stappen en voegt u steriel serumvrij en antibioticumvrij DMEM-medium toe aan het apparaat.In plaats van EHEC worden meerdere locaties afgebeeld op een Zeiss AIOt 200 M fluorescentiemicroscoop, waarbij het aantal levende epitheelcellen in het groen tussen de dode epitheelcellen in het rood wordt geschat door het aantal groene cellen te tellen in afbeeldingen verkregen van minimaal zeven locaties. Nu tonen we enkele representatieve afbeeldingen van het microfluidische apparaat met trial-laag. In deze afbeelding gebruiken we inerte voedselkleurstof om de verschillende cultuurregio's weer te geven.De paarse kleurstof representeert het gebied met de eukaryote celcultuur, terwijl de groene kleurstof de commensale bacteriële biofilm representeert. In deze afbeelding tonen we aan dat het haalbaar is om de eukaryote en bacteriële regio's van elkaar gescheiden te houden, aangezien de paarse kleurstof in het bacteriële gebied duidelijk onderscheidbaar is van de omringende gele kleurstof. Hier wordt de kolonisatie van de groene eiwit-expresserende commensale bacteriële biofilm door pathogene rode eiwit-expresserende bacteriën getoond.Zoals in deze afbeelding te zien is, zijn de EHEC en commensale bacteriën duidelijk te onderscheiden van de HeLa-cellen die de bacteriële biofilm omringen. We hebben zojuist aangetoond hoe u een micro-apparaat met een droge laag assembleert voor de cocultuur van bacteriën en epitheelcellen om gewoonlijk het effect van signalen op de kolonisatie door pathogenen te onderzoeken. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden eventuele luchtbellen in het apparaat te verwijderen en dit pathogeen bij een passende multipliciteit van infectie te gebruiken.Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experiment.

microfluidic-co-culture-epithelial-cells-bacteria-for-investigating

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Source: Montefusco-Pereira, C. V. et al. P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives. J. Vis. Exp.(2020)This video demonstrates a co-culture model of bronchial epithelial cells and macrophage-like cells at the air-liquid interface to study host-pathogen interactions. Pathogenic bacterial infection compromises epithelial membrane integrity, triggering macrophage-like cell activation and...

Establishing a Co-Culture Model to Study Host-Pathogen Interactions at the Air-Liquid Interface

Bacteriën produceren uitgescheiden verbindingen die het potentieel heeft om de fysiologie van hun microbiële buren beïnvloeden. Hier beschrijven we een coculture scherm dat de opsporing van dergelijke chemisch gemedieerde interspecies interacties door het mengen bodemmicroben met fluorescerende transcriptionele reporter stammen van Bacillus subtilis op vaste media toelaat.

Met behulp Coculture te sporen Chemisch Mediated Interspecies Interacties

We beschrijven een in vitro protocol co-cultuur darm microbioom en darmvlokken voor een langere periode met een menselijke darm-on-a-chip microphysiological systeem.

Co-cultuur van de levens- Microbiome met Microengineered Human darmvlokken in een Gut-on-a-Chip microfluïdische apparaat

We presenteren een protocol om te onderzoeken de Overspraak tussen Caco-2 X-Vleug-bestraalde en perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC). Het protocol start met Caco-2 bestraling en opzet van de co cultuur met PBMC; trans-epitheliale elektrische weerstand is vervolgens regelmatig gedurende 48 h en westelijke vlek uitgevoerd in zowel Caco-2 en PBMC gemeten.

Een co cultuur methode te onderzoeken de Overspraak tussen X-ray bestraald Caco-2 cellen en PBMC

Dit rapport beschrijft een microfluïdische chip-gebaseerde methode voor het opzetten van een eencelkweek experiment waarbij hoogrenderende koppeling en microscopische analyse van meerdere afzonderlijke cellen kunnen worden bereikt.

Het opzetten van eencellige co-culturen op een deterministische manier met een Microfluïdische chip

Deze studie beschrijft de microscopische monitoring van pneumococcus hechting aan Von Willebrand factor snaren geproduceerd op het oppervlak van gedifferentieerde menselijke primaire endotheliale cellen onder shear stress in gedefinieerde stromingsomstandigheden. Dit protocol kan worden uitgebreid naar gedetailleerde visualisatie van specifieke celstructuren en kwantificering van bacteriën door differentiële immunokleurings procedures toe te passen.

Pneumococcus-infectie van primaire humane endotheliale cellen in constante stroming

In het tijdperk van immunotherapie en eencellige genomische profilering vereist kankerbiologie nieuwe in vitro en computationele hulpmiddelen voor het onderzoeken van de tumor-immuuninterface in een juiste spatiotemporale context. We beschrijven protocollen om tumor-immuun microfluïdische co-culturen te exploiteren in 2D- en 3D-instellingen, compatibel met dynamische, multiparametrische monitoring van cellulaire functies.

Microfluïdische co-cultuurmodellen voor het ontleden van de immuunrespons in in vitro tumormicro-omgevingen

Het gepresenteerde protocol beschrijft de ontwikkeling en het gebruik van een op falloidine gebaseerde filamenteuze actinekleuringstechniek met confocale laserscanmicroscopie (CLSM) om de aanhangende cellaagstructuur in microfluïdische dynamische cultuurkanalen en traditionele statische-cultuurkamers met vaste put te visualiseren. Deze benadering helpt bij het evalueren van cellaagconfluentie, monolaagvorming en uniformiteit van laagdikte.

Voorbereiding en structurele evaluatie van epitheelcelmonolagen in een fysiologisch groot microfluïdisch kweekapparaat

Dit artikel biedt een gedetailleerd protocol met de belangrijkste stappen om de 3D Flipwell-engineering en -gebruik te begeleiden. We beschrijven en laten zien hoe de co-cultuur insert stacks kunnen worden samengesteld en gebruikt voor het co-kweken van gelaagde lagen darmbacteriën, darmepitheel, en macrofagen om de darmslijmvliesomgeving te modelleren.

3D Flipwell-engineering voor het ontwikkelen van asynchrone systemen voor toxicologische en immunomodulerende therapieën in bacteriële, darm- en immuuncellen

De studie presenteert een methode voor in vitro onderzoek van bacteriële infecties met behulp van intestinale organoïden afkomstig van weefselstamcellen. Het protocol beschrijft hoe organoïden in twee dimensies kunnen worden gekweekt en onderscheiden, geïnfecteerd met adherent-invasieve Escherichia coli, en belangrijke metingen worden beoordeeld, waaronder het doorbreken van de epitheliale barrière, infectiebeeldvorming en de repitheliale RNA-respons.

Een tweedimensionale organoïde cultuur op invasine of basement membraanextract om gastheer-bacteriën interacties te bestuderen

Leer een microfluïdische co-cultuurmethode voor het bestuderen van gastheer-pathogeen interacties met HeLa-cellen en E. coli. Dit model bootst het gastro-intestinale systeem na en visualiseert kolonisatie door EHEC.

Microfluïdische Co-cultuur van epitheliale cellen en bacteriën voor het onderzoeken van Oplosbaar Signal-gemedieerde interacties (Video) | JoVE Journal

Microfluïdische Co-cultuur van epitheliale cellen en bacteriën voor het onderzoeken van Oplosbaar Signal-gemedieerde interacties

Meer video's verkennen