Een microfluïdische apparaat voor het kwantificeren van Bacteriële Chemotaxis in stabiele concentratiegradiënten

E Coli RP 4 37 worden geïntroduceerd in een chemotaxis-apparaat waarbij ze worden blootgesteld aan gedefinieerde ruimtelijke concentratiegradiënten. Cellen die de kamer binnengaan, komen terecht in het middelpunt van de concentratiegradiënt. Afhankelijk van of het signaal als attractant of repellent wordt waargenomen, bewegen de bacteriën zich snel omhoog of omlaag langs de concentratiegradiënt.

Hoi, ik ben Derek Engler van het Laboratory of Molecular Systems Biotechnology en de Department of Chemical Engineering aan de Texas A&M University. Vandaag laten we u een procedure zien voor het onderzoeken van bacteriële chemotaxis in een microfluïdisch apparaat. We gebruiken deze procedure in onze laboratoria om te bestuderen hoe E. coli RP 4 37 migreert in concentratiegradiënten van nikkelsulfaat.

Laten we beginnen. De vloeistoflaag en de controllaag worden vervaardigd door replica-gieten van Polymethyl SUBOXANE of PDMS vanaf de SU eight-master. Meng voor deze procedure de PDMS-prepolymeer en de crosslinker in een gewichtsverhouding van 10 op 1.

Ontgas het mengsel in een vacuümexsikator gedurende één uur totdat alle luchtbellen zijn verwijderd. Wanneer het PDMS-mengsel gereed is, plaats dan de SU eight-master in een petrischaal en giet het mengsel voorzichtig over de SU eight-master tot de gewenste dikte. Verwarm de petrischaal met het PDMS en de SU eight-master-mal bij 80 °C gedurende twee uur om het PDMS te uitharden.

Verwijder na twee uur de uitgeharde PDMS-laag over de SU-8 master van de warmteplaat en pel de PDMS-mal van de SU-8 master af. De gewenste structuur is nu ingebed in de PDMS-mal. Gebruik een stompe naald van 20 gauge om vier gaatjes in de PDMS-mal te prikken voor de slangetjes naar de gradiëntgenerator, de celinlaat en de celuitlaat. We zijn nu klaar om het PDMS-apparaat te assembleren om het PDMS-apparaat te hechten.

Reinig eerst een glazen objectglas met isopropanol en test dit met een Airstream. Exponeer vervolgens de PDMS-mal en het objectglas gedurende ongeveer 30 seconden aan zuurstofplasma in een plasma-etcher. Breng de PDMS-mal in contact met het objectglas. Verwarm het objectglas en de PDMS-mal in contact met elkaar 15 minuten lang op 65 °C op een warmteplaat.

Om het PDMS-apparaat te assembleren, gebruikt u een scheermesje om de slang onder een hoek van 45 graden op de juiste lengte te snijden, afhankelijk van de microscoopopstelling. Steek vervolgens met een pincet één uiteinde van de slang in een van de vier gaten die in het apparaat zijn geponst.

Plaats een stompe naaldhub van 30 gauge in het andere uiteinde van de slang. Herhaal de plaatsing van de slang en naaldhub voor alle resterende gaten. Vul een spuit van drie milliliter met één milliliter chemo taxes, buffer of CB.

Zorg ervoor dat alle lucht uit de spuit wordt verwijderd. Voeg met een pipet CB toe aan de naaf van de uitlaatnaald en tik tegen de naaf om eventuele luchtbellen te verwijderen. Druk een kleine hoeveelheid CB uit de tip van de spuit van drie milliliter en verbind de spuit met de naaf van de naald zonder lucht in te sluiten.

Houd CB door het apparaat tot alle resterende naaldhubs gevuld zijn met cb. Dit moet het grootste deel van de luchtbellen verwijderen. Vul vervolgens twee spuiten van 500 µL met CB dat de juiste concentraties van de geteste chemo-effector bevat.

Voorkom de vorming van luchtbellen door een kleine druppel van de inhoud van de spuit uit te drukken, de vloeistofdruppels in de naaldhouder aan te raken en de spuit te bevestigen om zeer motiele bacteriën voor te bereiden. Kweek voor het chemotaxis-experiment een overnight-cultuur van e coli RP 4 37 met een GFP-expressieplasmid in triptonbouillon of TB bij 32 °C onder schudcondities voor de volgende dag. Gebruik de overnight-cultuur om een cultuur van 20 mL TB in een erlenmeyer van 250 mL te inoculeren tot een optische dichtheid bij 600 nm van ongeveer 0,05.

Kweek de cultuur bij 32 graden Celsius onder schudomstandigheden wanneer de cellen een OD 600 van ongeveer 0,35 tot 0,45 hebben bereikt. Oogst deze door middel van centrifugatie bij lage snelheid en resuspendeer de cellen tot een OD 600 van ongeveer 0,35 in CB met de chemo-effector in de concentratie die wordt verwacht in het midden van het kanaal. Voeg ten slotte RFP-gelabelde dode cellen met een OD 600 van ongeveer 0,35 toe aan de GFP-expresserende levende cellen.

Deze dode cellen zullen dienen als interne controle om te waarborgen dat eventuele migratie niet het gevolg is van stromeffecten. De celsuspensie is nu klaar om in het microfluïdische apparaat te worden geladen voor het chemotaxisexperiment. Om het chemotaxisexperiment te starten, verwijdert u een deel van de CB uit de naaf van de celinlaatnaald en vult u deze aan met de celsuspensie.

Vul voorzichtig een spuit van 50 µL met de resuspendeerde cellen. Doe dit langzaam, aangezien flagellen kunnen afscheuren, wat de beweeglijkheid vermindert. Bevestig de spuit van 50 µL aan de aansluitnaald zoals eerder getoond door een kleine druppel van de inhoud van de spuit naar buiten te duwen, deze druppel in contact te brengen met de vloeistof in de naaldaansluiting en de spuit te bevestigen; plaats het apparaat op de tafel van een fluorescentiemicroscoop die is uitgerust met een hogesnelheidscamera voor beeldacquisitie.

Plaats beide inlaatspuiten in de spuitpomp en start de vloeistofstroom zodat de gradiënt wordt gevormd en de cellen door de slang stromen. Zodra de cellen de chemotaxis-kamer binnenkomen, wacht u ongeveer 20 minuten tot het systeem is gestabiliseerd. Neem voor het beeldvormen fluorescente beelden van levende groene en dode rode cellen op verschillende locaties langs de lengte van de kamer.

Gewoonlijk verzamelen we 100 beelden op elke locatie met intervallen van drie seconden. De verkregen fluorescentiebeelden kunnen worden geanalyseerd met elk commercieel beschikbaar programma voor beeldanalyse, zoals Image J of metamorph, of met eenvoudige codes geschreven in matlab. In dit voorbeeld maken we gebruik van MATLAB-codes.

Begin met het verwijderen van de achtergrondpixels in de afbeelding door deze drempelwaarde voor pixelintensiteit in te stellen en alle pixels te verwijderen die een intensiteit hebben die lager is dan de drempelwaarde. Dit minimaliseert ruis. Gebruik bij de analyse de positie van de dode cellen om het midden van de afbeelding te bepalen.

Dit stelt de positie voor waar de cellen de chemotaxiskamer binnenkwamen en waar ze gedetecteerd zouden worden bij afwezigheid van migratie. Lokaliseer vervolgens de levende cellen in de afbeelding, verdeel de afbeelding in kanalen en bepaal het aantal levende cellen per kanaal. In ons eerdere werk werd de 10 50 micrometer brede chemotaxiskamer verdeeld in 64 kanalen van elk ongeveer 16 micrometer breed.

Nadat deze stappen voor alle afbeeldingen zijn herhaald, worden enkele van de totale celtellingen voor elk kanaal over alle afbeeldingen bepaald. Dit geeft het totale aantal gedetecteerde cellen voor elk kanaal gedurende de experimentele periode. Bereken de chemotaxis-partitiecoëfficiënt of CPC, die de migratierichting vertegenwoordigt.

Voer de volgende stappen uit om een vermenigvuldigingsfactor van plus één en minus één toe te kennen aan elke cel die zich respectievelijk aan de zijde met de hoge concentratie (rechts) en de zijde met de lage concentratie (links) van de dode cellen bevindt. Tel alle vermenigvuldigde waarden bij elkaar op en normaliseer deze naar het totale aantal gedetecteerde cellen. Bereken de chemotaxis-migratiecoëfficiënt, of CMC, die de migratie van cellen weegt op basis van de afgelegde afstand.

Een cel die naar de verste positie met de hoogste concentratie in kanaal 64 beweegt, krijgt een wegingsfactor van plus één, terwijl een cel die halverwege naar de zijde met de hogere concentratie beweegt, een wegingsfactor van plus 0,5 krijgt. Een cel die naar de verste positie met de laagste concentratie beweegt, wordt gewogen met minus één. De som van alle gewogen celaantallen wordt genormaliseerd naar het aantal cellen om de CMC te genereren.

Deze grafiek toont een lineaire concentratiegradiënt of een profiel dat in het microfluïdische apparaat is gevormd met behulp van fluoresceïne-isothiocyanaat. De vorming van een concentratiegradiënt wordt in deze figuur aangetoond met behulp van blauwe en gele kleurstoffen. De celinlaat was gesloten (CA), waardoor er geen stroming doorheen was, en er is te zien dat er een reeks kleuren tussen blauw en geel is gevormd.

Hier zijn pseudokleurbeelden van een representatief chemotaxisexperiment waarin e coli RP 4 37 in het apparaat werd blootgesteld aan een gradiënt van 0 tot 100 µM L-aspartaat of 0 tot 225 µM nikkelsulfaat. De migratie van levende groene bacteriën naar L-aspartaat of weg van nikkel werd elke 2,5 seconden gedurende 30 minuten vastgelegd. Dode bacteriën, weergegeven in het rood, dienden als controle voor stromeffecten in het apparaat.

De ruimtelijke distributie van RP 4 37 in het microfluïdische apparaat in afwezigheid van een gradiënt wordt in deze grafiek getoond in vergelijking met de respons op een aspartaatgradiënt en een nikkelsulfaatgradiënt. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe de chemotaxis van E. coli RP 4 37 in een gradiënt van nikkelsulfaat kan worden gemonitord. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om het vortexen van de cellen te minimaliseren, zodat een subpopulatie met een hoge motiliteit kan worden gebruikt.

Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.