Een microfluïdische apparaat voor het kwantificeren van Bacteriële Chemotaxis in stabiele concentratiegradiënten
April 19th, 2010
Dit protocol beschrijft de ontwikkeling van een microfluïdische apparaat voor het onderzoeken van bacteriële chemotaxis in stabiele concentratiegradiënten van chemoeffectors.
E Coli RP 4 37 worden geïntroduceerd in een chemotaxis-apparaat waar ze worden blootgesteld aan gedefinieerde ruimtelijke concentratie. Gradientcellen die de kamer binnenkomen, treffen het middenpunt van de concentratiegradiënt aan. Afhankelijk van of het signaal wordt waargenomen als een aantrekkings- of afstotend middel, bewegen bacteriën snel omhoog of omlaag in de concentratiegradiënt.
Hallo, ik ben Derek Engler van het Laboratorium voor Moleculaire Systeembiotechnologie en de Afdeling Chemische Technologie aan de Texas a en m Universiteit. Vandaag zullen we u een procedure laten zien die bacteriële chemotaxis in een microfluïdisch apparaat onderzoekt. We gebruiken deze procedure in onze laboratoria om te bestuderen hoe e coli RP 4 37 migreert in een concentratiegradiënt van nikkelsulfaat.
Dus laten we beginnen. De vloeistoflaag en de controlelaag worden gemaakt door replicavorming van Polymethyl SUBOXANE of PDMS van de SU acht master. Om deze procedure te beginnen, meng de PDMS voorpolymeer en crosslinker in een gewichtsverhouding van 10 tot 1.
Degas het mengsel in een droge kast gedurende één uur totdat luchtbellen zijn verwijderd. Wanneer het PDMS-mengsel klaar is, plaats de SU acht master in een petrischaal en giet het mengsel voorzichtig op de SU acht master tot de gewenste dikte. Verwarm de petrischaal met het PDMS en de SU acht master mal gedurende twee uur op 80 graden Celsius om het PDMS uit te harden.
Na twee uur verwijdert u de uitgeharde PDMS-bedekte SU acht master van de hotplate en verwijdert u het PDMS-mal van de SU acht master. De gewenste structuur wordt ingebed in het PDMS-mal met behulp van een 20 gauge stompe eindnaald. Boor vier gaten in het PDMS-mal voor betubing naar de gradiëntgenerator, celaanvoer en celafvoer. Nu zijn we klaar om het PDMS-apparaat te monteren om het PDMS-apparaat te verbinden.
Reinig eerst een glazen microscoopglas met isopropanol en probeer het met een luchtstroom. Breng vervolgens het PDMS-mal en het glazen plaatje bloot aan zuurstofplasma in een plasma-etcher gedurende ongeveer 30 seconden. Breng het PDMS-mal in contact met het glazen plaatje. Verwarm het gecontacteerde plaatje en PDMS-mal tot 65 graden Celsius op een hotplate gedurende 15 minuten.
Om het PDMS-apparaat te monteren, gebruikt u een scheermes om de betubing in een hoek van 45 graden te snijden tot de juiste lengte die vereist is, afhankelijk van de microscoopopstelling. Gebruik vervolgens pincetten. Steek het ene uiteinde van de betubing in een van de vier gaten die in het apparaat zijn geboord.
Stek een stompe 30 gauge naaldhub in het andere uiteinde van de betubing. Herhaal het inbrengen van betubing en naaldhub voor alle resterende gaten. Laad één milliliter chemotaxis, buffer of CB in een drie milliliter spuit.
Zorg ervoor dat u lucht uit de spuit verwijdert. Voeg CB toe aan de uitlaatnaaldhub met behulp van een pipette en tik op de naaldhub om eventuele luchtbellen te verwijderen. Duw een beetje CB uit de punt van de drie milliliter spuit en verbind de spuit met de naaldhub zonder lucht te vangen.
Duwt CB door het apparaat totdat alle resterende naaldhubbs gevuld zijn met cb. Dit zou de meerderheid van de luchtbellen moeten verwijderen. Vul vervolgens twee 500 microliter spuiten met CB met de juiste concentraties van de te testen chemo-effector.
Vermijd luchtbellen door een kleine druppel van de inhoud van de spuit uit te duwen en de druppels van de vloeistof in de naaldhub aan te raken en de spuit te bevestigen om zeer mobiele bacteriën te bereiden. Voor het chemotaxisexperiment kweekt u een nachtcultuur van e coli RP 4 37 met een GFP-expressie, plasmide in tripton-bouillon of TB bij 32 graden Celsius met schudden de volgende dag. Gebruik de nachtcultuur om een 20 milliliter cultuur van TB in een 250 milliliter erlenmeyer-kolf te inoculeren tot een optische dichtheid bij 600 nanometer van ongeveer 0,05.
Laat de cultuur groeien bij 32 graden Celsius met schudden wanneer de cellen een OD 600 hebben van ongeveer 0,35 tot 0,45. Oogst ze door centrifugatie met lage snelheid en resuspendeer cellen tot een OD 600 van ongeveer 0,35 in CB met de chemo-effector in de concentratie die in het midden van het kanaal wordt verwacht. Voeg ten slotte RFP-gelabelde dode cellen toe bij no D 600 van ongeveer 0,35 tot de GFP-uitdrukkende levende cellen.
Deze dode cellen zullen een interne controle zijn om ervoor te zorgen dat eventuele migratie niet te wijten is aan stromingseffecten. De celsuspensie is nu klaar om in het microfluïdische apparaat te worden geladen voor het chemotaxisexperiment. Om het chemotaxisexperiment te beginnen, verwijdert u wat CB uit de celaanvoer naaldhub en vult u deze weer op met de celsuspensie.
Vul voorzichtig een 50 microliter spuit met de gesuspendeerde cellen. Doe dit langzaam, omdat flagella kunnen worden afgescheurd, wat de beweeglijkheid zal verminderen. Bevestig de 50 microliter spuit aan de inlaatnaaldhub zoals eerder getoond door een kleine druppel van de inhoud van de spuit uit te duwen en de druppel aan de vloeistof in de naaldhub te laten raken en de spuit te bevestigen. Plaats het apparaat op het podium van een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een hogesnelheidscamera voor beeldacquisitie.
Plaats beide inlaatspuitjes in de spuitpomp en start de stroom zodat de gradiënt wordt gevormd en cellen door de betubing stromen. Zodra cellen de chemotaxiskamer binnenkomen, wacht u ongeveer 20 minuten tot het systeem is gestabiliseerd. Voor het beeldvormen verzamelt u levendige groene en dode rode fluorescentiebeelden op verschillende locaties langs de lengte van de kamer.
Normaal gesproken verzamelen we 100 beelden op elke locatie met intervallen van drie seconden. De verkregen fluorescentiebeelden kunnen worden geanalyseerd met behulp van elk commercieel beschikbaar beeldanalyseprogramma, zoals Image J of metamorph, of met be
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol beschrijft de ontwikkeling van een microfluïdisch apparaat voor het onderzoeken van bacteriële chemotaxis in stabiele concentratiegradiënten van chemo-effectoren. E. coli RP 4 37 worden in het apparaat geïntroduceerd om hun beweging te bestuderen in reactie op gedefinieerde ruimtelijke concentratiegradiënten.
Belangrijke onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Microfluidics
- Bacteriële Chemotaxis
- Biotechnologie
Achtergrond
- Bacteriële chemotaxis is de beweging van bacteriën naar of weg van chemische stimuli.
- Microfluïdische apparaten zorgen voor nauwkeurige controle van chemische gradiënten.
- Het begrijpen van chemotaxis kan inzicht geven in bacterieel gedrag en toepassingen in de biotechnologie.
- Dit onderzoek richt zich op E. coli RP 4 37 en zijn reactie op nikkelsulfaat.
Doel van het onderzoek
- Om een microfluïdisch apparaat te ontwikkelen voor het bestuderen van bacteriële beweging.
- Om te onderzoeken hoe E. coli reageert op verschillende concentratiegradiënten.
- Om het begrip van bacteriële chemotaxis mechanismen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Ontwerp en fabricage van microfluïdisch apparaat.
- Introductie van E. coli in het apparaat.
- Observatie van bacteriële beweging in reactie op chemo-effectoren.
- Analyse van migratiepatronen in concentratiegradiënten.
Belangrijkste resultaten
- Bacteriën vertonen gerichte beweging naar attractanten en weg van repellerende stoffen.
- Gedefinieerde concentratiegradiënten hebben een significante invloed op bacterieel gedrag.
- Het microfluïdische apparaat biedt een gecontroleerde omgeving voor het bestuderen van chemotaxis.
- Resultaten dragen bij aan het begrip van de mechanismen van bacteriële navigatie.
Conclusies
- Het ontwikkelde microfluïdische apparaat is effectief voor het bestuderen van bacteriële chemotaxis.
- Bevindingen vergroten de kennis van E. coli gedrag in reactie op chemische signalen.
- Dit onderzoek heeft implicaties voor biotechnologie toepassingen die bacteriën betrekken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Quantifying bacterial chemotaxis in stable gradients enables mechanistic de-risking of antimicrobial target validation by linking chemoeffector sensing to phenotypic behavior. This microfluidic approach supports predictive confidence in lead identification by providing quantitative, reproducible migration data under controlled chemical conditions. The platform enhances translational continuity from target screening to preclinical evaluation by standardizing chemotaxis readouts for cross-functional teams.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring bacterial migration toward or away from specific chemoeffectors.
- Operational Value: Enables functional target validation through quantitative assessment of attractant and repellent responses.
- Scientific Value: Supports predictive confidence by correlating chemotactic behavior with gene expression or pathway activity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated bacterial systems for downstream screening by establishing baseline chemotactic responsiveness.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via stable, diffusive gradient generation.
- Scientific Value: Delivers quantitative outputs such as chemotactic partition and migration coefficients for compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by modeling bacterial navigation in host-like chemical environments.
- Operational Value: Provides continuity from discovery through preclinical validation using consistent microfluidic formatting.
- Scientific Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by quantifying chemotactic de-risking of targets.
Pipeline & Workflow Integration
The device integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis testing of chemoeffector-receptor interactions prior to lead optimization.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by linking migration patterns to specific chemoeffector detection mechanisms.
- Screening: Delivers assay readiness through stable gradient formation and high-speed imaging compatibility.
- Analytics: Generates normalized chemotactic coefficients that allow cross-condition comparison of bacterial responses.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by standardizing bacterial behavior readouts across model systems.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for screening diverse chemoeffectors and bacterial strains.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in bacterial behavioral responses.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized microfluidic fabrication and gradient control.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing quantitative chemotaxis data for target prioritization.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement by identifying targets with minimal chemotactic escape mechanisms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device assembly, fluorescence microscopy, and image analysis.
- Depends on PDMS molding, plasma bonding, and syringe pump infrastructure for gradient generation.
- Necessitates cross-team standardization of chemoeffector concentrations and channel segmentation protocols.
- Involves adaptation considerations for different bacterial strains, fluorescent labels, and chemoeffector solubilities.
- Limited by the need to minimize shear stress during cell loading to preserve flagellar integrity and motility.
