Name: Een microfluïdische apparaat voor het kwantificeren van Bacteriële Chemotaxis in stabiele concentratiegradiënten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-19T17:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Leer hoe je een microfluïdische methode gebruikt om bacteriële chemotaxis te bestuderen met E. coli RP 4 37 in stabiele concentratiegradiënten. Dit protocol helpt onderzoekers gedrag van bacteriën te analyseren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd mede ondersteund door de National Science Foundation (cbet 0.846.453).

1. Fabricage van silicium meesters met behulp van standaard SU-8 fotolithografie een (niet getoond in deze video). <ol><li> Gebruik standaard SU-8 fotolithografie methoden om een ​​SU-8 "master" (SU-8 2025, Microchem, Newton, MA) te creëren voor het vervaardigen van de PDMS schimmel die de microfluïdische netwerk en chemotaxis kamer bevat. Deze master-mallen kunnen worden vervaardigd op een microfabricage faciliteit (bijv. Stanford Microfluidics Foundry; <a href="http://thebigone.stanford.edu/foundry/">http://thebigone.stanford.edu/foundry/</a> ). </li><li> Voorafgaand aan PDMS replicatie, bloot de SU-8 meester om fluorosilane damp in een exsiccator verbonden aan een vacuüm bron om gemakkelijk los van het PDMS te vergemakkelijken van de meester. Voeg een druppel fluorosilane op een papieren handdoek en vacuüm voor een min van toepassing zijn. Verwijder het vacuüm en laat 30 min voor de depositie van fluorosilane. Houd de SU-8 meester in een gesloten container voor toekomstig gebruik. </li></ol> 2. Replica gieten van PDMS van de SU-8 meester: De vloeibare laag en de controle laag zijn gemaakt door replica gieten van PDMS van de SU-8 master. <ol><li> Meng de PDMS pre-polymeer en cross-linker op een 10:01 gew. verhouding en ontgassen in een exsiccator gedurende 1 uur (of tot de luchtbellen zijn verwijderd uit het PDMS mengsel). </li><li> Plaats de SU-8 meester in een petrischaal en zorgvuldig de PDMS mengsel giet op de top van de SU-8 master naar de gewenste dikte. </li><li> Verhit de petrischaal met de PDMS en de SU-8 meester schimmel bij 80 ° C gedurende twee uur aan het PDMS genezen. </li><li> Verwijder de uitgeharde PDMS bedekte SU-8 meester uit de kookplaat en schil de PDMS mal van de SU-8 master. De gewenste structuur zal worden ingebed in de PDMS mal. </li><li> Punch gaten in de PDMS mal voor slang aan op de gradiënt-generator en de cel inlaat met behulp van een 20 gauge stompe einde van de naald. </li></ol> 3. Verlijmen van PDMS-apparaten: <ol><li> Schoon een glazen microscoopglaasje met isopropanol en droog met stikstof of een luchtstroom. </li><li> Expose de PDMS en glazen schuif naar zuurstof plasma in een plasma Aser. </li><li> Breng de PDMS mal in contact met het glaasje. Verhit de gecontacteerde schuif en PDMS schimmel tot 65 ° C gedurende 15 minuten. </li></ol> 4. Montage van de PDMS-apparaat <ol><li> Met behulp van een scheermesje, snij slangen in een hoek van 45 ° op de juiste lengte die nodig is voor het apparaat. </li><li> Steek het ene uiteinde van de slang in de gaatjes in het apparaat (bv uitlaat) met behulp van een tang. </li><li> Met behulp van een tang, plaatst u een stompe 30-gauge naald in het andere uiteinde van de slang. </li><li> Herhaal stap 4.2 voor alle resterende gaten. </li><li> Verzamel 1 ml van de chemotaxis buffer (CB) in een 3 ml spuit en zorg ervoor dat de luchtbellen uit de spuit. </li><li> Fix een naald hub aan het ene uiteinde van de uitlaat slang. </li><li> Voeg CB om de naald hub, en tik de naald hub om eventuele luchtbellen te verwijderen. </li><li> Duw een beetje CB uit de punt van de spuit en sluit de 3 ml spuit aan de naald hub zonder lucht. </li><li> Duw CB via het apparaat totdat alle overgebleven naald hubs zijn gevuld met met CB. Dit moet de meerderheid van de luchtbellen. </li><li> Vul twee 500μL spuiten met CB met de juiste concentraties van de chemoeffector wordt getest. Elimineer luchtbellen ontstaan ​​door het indrukken van een klein druppeltje van de spuit inhoud en het aanraken van de dalen tot de vloeistof in de naald hub en bevestigen. </li><li> Ook sluit een spuit met CB om de bacteriën te inlaat. Dit zal worden verwijderd wanneer bacteriën worden ingevoerd in het apparaat. </li></ol> 5. Groei van sterk beweeglijke E. coli <ol><li> Grow 's nachts culturen van E. coli RP437 met een GFP expressieplasmide in 20 ml trypton bouillon (TB) bij 32 ° C met schudden. Voeg het juiste concentraties van antibiotica om het plasmide te behouden. In ons protocol maken we gebruik van een low-copy plasmide pCM182 voor het detecteren van bacteriën op basis van fluorescentie in het apparaat. Voor E. coli, groeiende culturen bij 32 ° C wordt aanbevolen voor hoge beweeglijkheid, zoals motiliteit lager is bij hogere temperaturen. </li><li> Gebruik het 's nachts cultuur om een ​​20 ml cultuur van TB inoculeren in een 250 mL erlenmeyer met een optische dichtheid bij 600 nm van ~ 0,05. Groei van de cultuur met schudden bij 32 ° C. </li><li> Oogst de cellen op een OD 600 van ~ 0,35 0,45 door de lage snelheid centrifugatie bij 400 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Resuspendeer cellen aan een OD 600 van ~ 0,35 in CB met de chemoeffector op de concentratie naar verwachting in het midden van het kanaal. </li><li> Voeg RFP-gemerkte dode cellen op een OD 600 van ~ 0,35 aan de GFP-expressie levende cellen. De dode (rode) cellen worden gebruikt als een interne controle om te verzekeren dat migratie niet te wijten is aan stroom effecten. </li></ol> 6. Monitoring chemotaxis <ol><li> Verwijder een deel van de CB van de cel inlaat naaldhub. Vul bij met de celsuspensie. </li><li> Voorzichtig Vul de 50μL spuit met de geresuspendeerde cellen. Deze stap moet langzaam worden gedaan als flagella kunnen worden geschoren en zal de beweeglijkheid. </li><li> Bevestig de spuit 50μL naar de inlaat-naald hub, zoals beschreven in stappen stap 4.10. </li><li> Plaats het apparaat op het podium van een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een high-speed camera voor het imago van acquisitie. Plaats de inlaat spuiten (zowel de 500 pL gradiënt spuiten en de 50 uL cel spuit) in de injectiepomp en initiëren stroom zodanig dat de gradiënt wordt gevormd en cellen die door de slang. </li><li> Zodra de cellen van de chemotaxis kamer betreden, wacht ~ 20 min voor het systeem te stabiliseren alvorens beeldvorming. </li><li> Verzamel groen (live) en rood (dode) fluorescentie beelden op verschillende locaties langs de lengte van de kamer (overeenkomend met verschillende belichtingstijden). Typisch, verzamelen we 100 foto's op elke locatie op 3 sec intervallen. </li></ol> 7. Data-analyse: De volgende stappen kunnen worden uitgevoerd met behulp van een commercieel beschikbare beeldanalyse-programma (bijv. ImageJ, Metamorph) of met behulp van eenvoudige codes geschreven in Matlab. <ol><li> Verwijder de achtergrond pixels in het beeld (dat wil zeggen, set drempel pixel intensiteit en verwijder alle pixels die de intensiteit minder dan de drempel). Dit minimaliseert ruis in de analyse. </li><li> Gebruik maken van de positie van de dode cellen (rode fluorescentie) naar het centrum van het beeld bepalen. Omdat de dode cellen tonen geen chemotaxis, dit is de positie waar de cellen ging de chemotaxis kamer en zou worden waargenomen in de afwezigheid van migratie. </li><li> Zoek levende cellen (groene fluorescentie) in het beeld. </li><li> Verdeel het beeld in kanalen en bepalen van het aantal levende cellen in elk kanaal. In ons eerdere werk 3, was de 1050 um brede chemotaxis kamer is opgedeeld in 64 kanalen die elk ~ 16 micrometer breed. </li><li> Herhaal de stappen 7,1 7,3 voor alle afbeeldingen en de som van de totale cel telt voor elk kanaal in alle beelden. Dit geeft het totale aantal cellen gedetecteerd op elk kanaal over de duur van het experiment. </li><li> Bereken de chemotaxis verdelingscoëfficiënt (CPC), die de richting van de migratie vertegenwoordigt, als volgt: elke cel bevindt zich in het hoge concentratie (rechts) en een lage concentratie (links) kanten van de dode cellen krijgt een multiplier van +1 en -1 , respectievelijk. Dat wil zeggen, een cel die migreert van een helling wordt vermenigvuldigd met +1 terwijl cellen naar beneden de helling worden vermenigvuldigd met -1. Alle vermenigvuldigd waarden worden opgeteld en genormaliseerd naar het totale aantal gedetecteerde cellen. Bijvoorbeeld, een CPC-waarde van 0,40 geeft aan dat 40% meer van de totale bacteriën verplaatst naar de hoge concentratie dan aan de lage concentratie kant (dat wil zeggen de chemoeffector is een lokstof als meer bacteriën werden ontdekt steeds hoger op de gradiënt). </li><li> Bereken de chemotaxis migratie coëfficiënt (CMC), dat weegt de migratie van cellen door de afgelegde afstand, als volgt: Gewicht van de cellen in elk kanaal met een factor die evenredig is aan de afstand die cellen migreren. Een cel die wordt verplaatst naar de verste hoge concentratie positie (kanaal 64) krijgt een wegingsfactor van +1, terwijl een die halverwege beweegt in de hogere concentratie kant krijgt een wegingsfactor van +0.5, en een cel verhuizen naar de verste lage concentratie positie wordt gewogen met -1. Kortom alle gewogen celtellingen en normaliseren van het aantal cellen om de CMC te genereren. </li></ol> Representatieve resultaten 3,4: Wij hebben gebruik gemaakt van de microfluïdische apparaat (Figuur 1A) beschreven hier om chemotaxis van E. te onderzoeken coli in verlopen van lokstoffen (asparaginezuur, autoinducer-2) en insectenwerende middelen (NiSO 4, indool) 3,4. De prototypische chemotaxis stam 5 E. coli RP437 uiten van GFP werd gebruikt, samen met kanamycine gedode E. coli-TG1 cellen die rood fluorescerend eiwit te stromen effecten te controleren. De concentratie gradiënt gevormd in de μFlow apparaat wordt weergegeven in figuur 1B. De cel inlaat werd afgedekt, zodat er geen stroom doorheen en een stabiele gradiënt van 0 100 ng / mL van fluoresscein werd opgericht in het apparaat. De pixel intensiteit over het apparaat werd gebruikt om de concentratie profiel van fluoresceïne te bepalen. De gegevens tonen aan dat bacteriën een lineair verloop ondervinden wanneer ze in de chemotaxis kamer. Figuur 2A en B toont fluorescentie beelden van E. coli RP437 migreren als reactie op hellingen van asparaginezuur (0 100 uM) en NiSO 4 (0 225 uM). De waargenomen reacties op deze canonieke lokstof en afstotend zijn als voorspeld. Figuur 3A toont de gekwantificeerde verspreiding van E. coli RP437 bij het ontbreken van een concentratie gradiënt (dat wil zeggen, null helling van asparaginezuur), terwijlFiguren 3B en C tonen de verdeling in gradiënten van asparaginezuur en NiSO 4. De specificiteit van deze reacties (dat wil zeggen, de vertekening in de migratie) is duidelijk als een E. coli RP437 Δ teer stam (dat wil zeggen, stam ontbreekt het Tar chemoreceptor die wordt gebruikt in E. coli tot asparaginezuur en nikkel zin) niet aan te tonen van de bias in de migratie in de aanwezigheid van een concentratiegradiënt van asparaginezuur of NiSO 4. De trends zichtbaar in de ruimtelijke verdeling profielen zijn ook consistent met de berekende CPC en CMC waarden. De CPC-waarden voor de migratie van E. coli RP437 in verlopen van asparaginezuur of NiSO 4 zijn +0.33 en -0.33, respectievelijk. De bijbehorende waarden zijn CMC +0.13 en -0.14, respectievelijk. In tegenstelling, de CPC en CMC waarden met de E. coli RP437 Δ teer stam in verlopen van asparaginezuur of NiSO 4 zijn te verwaarlozen. Daarnaast is de CPC-en CMC in een nul-helling van asparaginezuur zijn +0.03 en +0.02, respectievelijk, en wijzen op het ontbreken van een bias in de migratie in de afwezigheid van een gradiënt. <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig1a.jpg" alt="Figuur 1a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1a"> <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig1b.jpg" alt="Figuur 1b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1b"> Figuur 1. Schematische apparaat en concentratie gradiënt. (A) Schematische weergave van de microfluïdische chemotaxis apparaat. Het apparaat bestaat uit een gradiënt-mixing-module (20 x 100 x 18.750 urn) en een chemotaxis observatie-module (20 x 1050 x 11500 pm). De breedte van de twee gradiënt kanalen invoeren van het toestel zijn 500 urn en de breedte van de bacteriën inlaat is 50 micrometer. De inzet toont een helling van signaalmolecuul (grijs) en bacteriën migreren als reactie op het. Levende bacteriën worden afgeschilderd als solide ovalen, terwijl de dode bacteriën worden weergegeven als open ovalen. (B) Een concentratie gradiënt tussen 0 en 100 ng / mL fluoresceïne werd gegenereerd in het apparaat en beeld gebracht met behulp van fluorescentie microscopie. Fluorescentie beelden werden verkregen na 30 min en gekwantificeerd door beeldanalyse. <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Chemotaxis van E. coli RP437 in de microfluïdische apparaat. E. coli RP437 werd blootgesteld aan een gradiënt van (A) 0-100 uM L-aspartaat of (B) 0-225 uM NiSO 4 in het apparaat en de migratie van levende bacteriën (groen) naar L-aspartaat of uit de buurt van nikkel afgebeeld elke 2,5 seconden gedurende 30 minuten. Dode bacteriën (rood) diende als de controle voor flow-effecten in het apparaat. Beelden werden gekwantificeerd met behulp van een in-house ontwikkelde analyse program3. De getoonde gegevens zijn representatief pseudo-gekleurde beelden van drie onafhankelijke experimenten. <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig3a.jpg" alt="Figuur 3a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3a"> <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig3b.jpg" alt="Figuur 3b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3b"> <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig3c.jpg" alt="Figuur 3c" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3c"> Figuur 3: Kwantificering van migratie profielen om een canonieke lokstof en afstotend. Ruimtelijke verdeling van RP437 in de microfluïdische apparaat als reactie op (A) uniform 100 uM L-aspartaat (dwz geen gradiënt), (B) een 0 100 uM helling van aspartaat, en (C) een 0 225 uM helling van NiSO 4 . De verdeling van dode cellen wordt getoond als een ononderbroken lijn, is de verdeling van RP437 cellen weergegeven als een stippellijn, en de verdeling van de RP437 eda + Δ teer cellen is weergegeven als een stippellijn. De getoonde gegevens zijn gemiddeld voor drie onafhankelijke experimenten.

<ol><li>McDonald, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prototyping+of+microfluidic+devices+in+poly%28dimethylsiloxane%29+using+solid-object+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Prototyping of microfluidic devices in poly(dimethylsiloxane) using solid-object printing.</a> Anal Chem. 74, 1537-1545 (2002).</li>
<li>Hansen, M. C., Palmer, R. J. J., Udsen, C., White, D. C., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+GFP+fluorescence+in+cells+of+Streptococcus+gordonii+under+conditions+of+low+pH+and+low+oxygen+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of GFP fluorescence in cells of Streptococcus gordonii under conditions of low pH and low oxygen concentration.</a> Microbiol. 147, 1383-1391 (2001).</li>
<li>Englert, D. L., Manson, M. D., Jayaraman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Flow-Based+Microfluidic+Device+for+Quantifying+Bacterial+Chemotaxis+in+Stable%2C+Competing+Gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A Flow-Based Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable, Competing Gradients.</a> Appl Environ Microbiol. 75, 4557-4564 (2009).</li>
<li>Englert, D. L., Jayaraman, A., Manson, M. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEnglert%2C+DL+%22Microfluidic+techniques+for+the+analysis+of+bacterial+chemotaxis%22">Microfluidic techniques for the analysis of bacterial chemotaxis</a>. , Humana press. (2009).</li>
<li>Mao, H., Cremer, P. S., &amp, M. anson <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive%2C+versatile+microfluidic+assay+for+bacterial+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">A sensitive, versatile microfluidic assay for bacterial chemotaxis.</a> PNAS. 100 (9), 5449-5454 (2003).</li>
</ol>

De chemotaxis verdelingscoëfficiënt (CPC) en de chemotaxis migratie coëfficiënt (CMC) kan worden berekend zoals beschreven in Mao et al. 5. Als een cel wordt gedetecteerd op de hoge concentratie kant, krijgt een waarde van +1, terwijl een cel aangetroffen op de lage concentratie kant krijgt een waarde van -1. De waarden worden opgeteld en gedeeld door het totale aantal cellen om de CPC te genereren. Het teken van de CPC (positief of negatief) geeft de richting van de migratie (in de richting of weg ...

een microfluïdische apparaat voor het kwantificeren van bacteriële chemotaxis in stabiele concentratiegradiënten

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Chemotaxis kunnen bacteriën bronnen van lokstof chemicaliën aanpak of de bronnen van afstotende stoffen te voorkomen. Bacteriën voortdurend de concentratie van specifieke chemoeffectors door het vergelijken van de huidige concentratie van de gemeten concentratie een paar seconden eerder. Deze vergelijking bepaalt de netto-richting van de beweging. Hoewel meerdere, concurrerende gradiënten vaak samen in de natuur, conventionele benaderingen voor het onderzoeken van bacteriële chemotaxis zijn suboptimaal voor het kwantificeren van de migratie in reactie op de concentratie gradiënten van lokstoffen en insectenwerende middelen. Hier beschrijven we de ontwikkeling van een microfluïdische chemotaxis model voor het presenteren van een nauwkeurige en stabiele concentratie gradiënten van chemoeffectors om bacteriën en kwantitatief onderzoek naar hun reactie op de toegepaste gradiënt. Het apparaat is veelzijdig in die concentratie gradiënten van elke gewenste absolute concentratie en gradiënt sterkte kan eenvoudig worden gegenereerd door diffusie mengen. Het apparaat is aangetoond met behulp van de reactie van<em&gt; Escherichia coli</em&gt; RP437 tot gradiënten van aminozuren en nikkel ionen.

Dit protocol beschrijft de ontwikkeling van een microfluïdische apparaat voor het onderzoeken van bacteriële chemotaxis in stabiele concentratiegradiënten van chemoeffectors.

Een microfluïdische apparaat voor het kwantificeren van Bacteriële Chemotaxis in stabiele concentratiegradiënten

Chemotaxis stelt bacteriën in staat om bronnen van aantrekkende chemicaliën te benaderen of bronnen van afstotende chemicaliën te vermijden. Bacteriën bewaken voortdurend de ...

E Coli RP 4 37 worden geïntroduceerd in een chemotaxis-apparaat waar ze worden blootgesteld aan gedefinieerde ruimtelijke concentratiegradiënten. Cellen die de kamer binnengaan, komen terecht in het middelpunt van de concentratiegradiënt. Afhankelijk van of het signaal wordt waargenomen als een attractant of repellent, bewegen de bacteriën zich snel omhoog of omlaag in de concentratiegradiënt.Hallo, ik ben Derek Engler van het Laboratory of Molecular Systems Biotechnology en de Department of Chemical Engineering aan de Texas A&amp;M University. Vandaag laten we u een procedure zien om bacteriële chemotaxis te onderzoeken in een microfluïdisch apparaat. Wij gebruiken deze procedure in onze laboratoria om te bestuderen hoe E. coli RP 437 migreert in een concentratiegradiënt van nikkelsulfaat.Laten we beginnen. De fluïdische laag en de controllaag worden vervaardigd door replica-gieten van Polymethyl SUBOXANE of PDMS vanaf de SU-8 master. Meng om met deze procedure de PDMS-prepolymeer en de crosslinker in een gewichtsverhouding van 10 op 1.Ontgas het mengsel in een vacuümdroger gedurende één uur totdat de luchtbellen zijn verdwenen. Wanneer het PDMS-mengsel klaar is, plaats dan de SU-8 master in een Petrischaal en giet het mengsel voorzichtig over de SU-8 master tot de gewenste dikte. Verhit de Petrischaal met het PDMS en de SU-8 master-mal bij 80 °C gedurende twee uur om het PDMS te uitharden.Verwijder na twee uur de uitgeharde PDMS-laag van de SU-8 master van de warmteplaat en pel de PDMS-mal van de SU-8 master af. De gewenste structuur bevindt zich nu in de PDMS-mal; pons met een stompgeëind naaldje (20 gauge) vier gaten in de PDMS-mal voor de slangverbindingen naar de gradiëntgenerator, de celingang en de celuitgang. Het PDMS-apparaat is nu klaar voor assemblage en bonding.Reinig eerst een glazen microscoopglaasje met isopropanol en droog het met een Airstream. Stel vervolgens de PDMS-mal en het glazen glaasje ongeveer 30 seconden lang bloot aan zuurstofplasma in een plasma-etser. Breng de PDMS-mal in contact met het glazen glaasje. Verhit het contactglaasje en de PDMS-mal 15 minuten lang op 65 °C op een warmteplaat.Om het PDMS-apparaat te assembleren, gebruikt u een scheermesje om de slang onder een hoek van 45 graden op de juiste lengte te snijden, afhankelijk van de configuratie van de microscoop. Steek vervolgens met een pincet één uiteinde van de slang in een van de vier in het apparaat geponste gaten.Plaats een stompe naaldhub van 30 gauge in het andere uiteinde van de slang. Herhaal de plaatsing van de slang en de naaldhub voor alle overige gaten. Vul een spuit van 3 mL met één milliliter chemo taxes, buffer of CB.Zorg ervoor dat alle lucht uit de spuit wordt verwijderd. Voeg CB toe aan de naaf van de uitlaatnaald met een pipet en tik tegen de naaf van de naald om eventuele luchtbellen te verwijderen. Druk een kleine hoeveelheid CB uit de punt van de spuit van 3 mL en verbind de spuit met de naaf van de naald zonder dat er lucht wordt ingesloten.Duw CB door het apparaat totdat alle resterende naaldhubs gevuld zijn met CB. Dit zou het grootste deel van de luchtbellen moeten verwijderen. Vul vervolgens twee spuiten van 500 µL met CB dat de juiste concentraties bevat van de geteste chemo-effector.Voorkom de vorming van luchtbellen door een klein druppeltje van de inhoud van de spuit uit te drukken, de druppels vloeistof in de naaldhouder aan te raken en de spuit te bevestigen om zeer beweeglijke bacteriën voor te bereiden. Kweek voor het chemotaxisexperiment een overnight-cultuur van e coli RP 4 37 met een GFP-expressieplasmid in triptonbouillon of TB bij 32 °C onder schudcondities tot de volgende dag. Gebruik de overnight-cultuur om een cultuur van 20 mL TB in een erlenmeyer van 250 mL te inoculeren tot een optische dichtheid bij 600 nm van ongeveer 0,05.Kweek de cultuur bij 32 °C onder schudomstandigheden wanneer de cellen een OD 600 van ongeveer 0,35 tot 0,45 hebben bereikt. Oogst deze door middel van centrifugatie bij lage snelheid en resuspendeer de cellen tot een OD 600 van ongeveer 0,35 in CB dat de chemo-effector bevat in de concentratie die verwacht wordt in het midden van het kanaal. Voeg ten slotte RFP-gelabelde dode cellen met een OD 600 van ongeveer 0,35 toe aan de GFP-expresserende levende cellen.Deze dode cellen dienen als interne controle om er zeker van te zijn dat eventuele migratie niet wordt veroorzaakt door stromeffecten. De celsuspensie is nu klaar om in het microfluïdische apparaat te worden geladen voor het chemotaxis-experiment. Om te beginnen met het chemotaxis-experiment, verwijdert u een deel van de CB uit de naaf van de celinlaatnaald en vult u deze bij met de celsuspensie.Vul voorzichtig een spuit van 50 µL met de geresuspendeerde cellen. Doe dit langzaam, aangezien flagellen kunnen afscheuren, wat de motiliteit vermindert. Bevestig de spuit van 50 µL aan de aansluiting van de inlaatnaald, zoals eerder getoond, door een kleine druppel van de inhoud van de spuit naar buiten te duwen, deze druppel in contact te brengen met de vloeistof in de naaldaansluiting en de spuit vervolgens te bevestigen. Plaats het apparaat op de tafel van een fluorescentiemicroscoop die is uitgerust met een hogesnelheidscamera voor beeldacquisitie.Plaats beide inlaatspuiten in de spuitenpomp en start de doorstroming zodat de gradiënt wordt gevormd en de cellen door de slang stromen. Zodra de cellen de chemotaxiskamer binnengaan, wacht u ongeveer 20 minuten tot het systeem is gestabiliseerd. Verzamel vóór de beeldvorming fluorescentiebeelden van levende groene en dode rode cellen op verschillende locaties langs de lengte van de kamer.Normaal gesproken verzamelen we 100 beelden per locatie met intervallen van drie seconden. De verkregen fluorescentiebeelden kunnen worden geanalyseerd met elk commercieel beschikbaar programma voor beeldanalyse, zoals Image J of metamorph, of met eenvoudige codes geschreven in matlab. In dit voorbeeld maken we gebruik van MATLAB-codes.Begin met het verwijderen van de achtergrondpixels in de afbeelding door deze drempelwaarde voor pixelintensiteit in te stellen en verwijder alle pixels met een intensiteit die lager is dan de drempelwaarde. Dit minimaliseert ruis. Gebruik bij de analyse de positie van de dode cellen om het middelpunt van de afbeelding te bepalen.Dit stelt de positie voor waar de cellen de chemotaxiskamer binnengingen en waar ze gedetecteerd zouden worden in de afwezigheid van migratie. Lokaliseer vervolgens de levende cellen in de afbeelding, verdeel de afbeelding in kanalen en bepaal het aantal levende cellen in elk kanaal. In ons eerdere werk werd de 10 50 µm brede chemotaxiskamer verdeeld in 64 kanalen die elk ongeveer 16 µm breed waren.Nadat deze stappen voor alle afbeeldingen zijn herhaald, worden sommige van de totale celcounts voor elk kanaal over alle afbeeldingen verzameld. Dit geeft het totale aantal gedetecteerde cellen per kanaal over de duur van het experiment. Bereken de chemotaxis-partitiecoëfficiënt of CPC, die de migratierichting vertegenwoordigt.Ken door de volgende stappen uit te voeren een vermenigvuldiger van plus één en minus één toe aan elke cel die zich respectievelijk aan de zijde met de hoge concentratie (rechts) of de zijde met de lage concentratie (links) van de dode cellen bevindt. Tel alle vermenigvuldigde waarden op en normaliseer deze naar het totale aantal gedetecteerde cellen. Bereken de chemotaxis-migratiecoëfficiënt, of CMC, die de migratie van cellen weegt op basis van de afgelegde afstand.Een cel die zich verplaatst naar de positie met de hoogste concentratie in kanaal 64 krijgt een wegingsfactor van plus één, terwijl een cel die zich tot halverwege de zijde met de hogere concentratie verplaatst een wegingsfactor van plus 0,5 krijgt. Een cel die zich verplaatst naar de positie met de laagste concentratie wordt gewogen met minus één. De som van alle gewogen celaantallen wordt genormaliseerd naar het aantal cellen om de CMC te genereren.Deze grafiek toont een lineaire concentratiegradiënt of een profiel dat in het microfluïdische apparaat is gevormd met behulp van fluoresceïne-isothiocyanaat. De vorming van een concentratiegradiënt wordt in deze figuur aangetoond met behulp van blauwe en gele kleurstoffen. De celinlaat was gesloten zodat er geen stroming doorheen was, en er is te zien dat er een reeks kleuren tussen blauw en geel wordt gevormd.Hier zijn pseudokleurafbeeldingen van een representatief chemotaxisexperiment waarin E. coli RP 4 37 in het apparaat werd blootgesteld aan een gradiënt van 0 tot 100 micromol L-aspartaat of 0 tot 225 micromol nikkelsulfaat. De migratie van levende groene bacteriën naar L-aspartaat of weg van nikkel werd elke 2,5 seconden gedurende 30 minuten in beeld gebracht. Dode bacteriën, weergegeven in rood, dienden als controle voor stromeffecten in het apparaat.De ruimtelijke verdeling van RP 4 37 in het microfluïdische apparaat in afwezigheid van een gradiënt wordt in deze grafiek getoond in vergelijking met de respons op een aspartaatgradiënt en een nikkelsulfaatgradiënt. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe de chemotaxis van e coli RP 4 37 in een gradiënt van nikkelsulfaat kan worden gemonitord. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat vortexen van de cellen tot een minimum moet worden beperkt, zodat een subpopulatie met een hoge mobiliteit kan worden gebruikt.Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

a-microfluidic-device-for-quantifying-bacterial-chemotaxis-stable

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De fabricage van microfluïdische kanalen en de uitvoering daarvan in experimenten voor het bestuderen van de chemotactische foerageergedrag van mariene microben in een fragmentarische voedingsstof zeegezicht en het zwemgedrag van de bacteriën in shear stroming worden beschreven.

Chemotactische respons van mariene micro-organismen aan Micro-Scale voedingsstoffen Lagen

Studies van Bacteriële Chemotaxis gebruik Microfluidics - Interview

Beschrijven we een protocol voor de microfabricage van de gradiënt-genererende microfluïdische apparaat dat kan genereren ruimtelijke en temporele gradiënten in goed gedefinieerde micro-omgeving. In deze benadering kan de gradiënt-genererende microfluïdische apparaat worden gebruikt om gerichte celmigratie, embryogenese, wondgenezing, en kanker metastase te bestuderen.

Een Gradient-genererende Microfluïdische Device for Cell Biology

Source: Scheidweiler, D., et al. Combining Fluidic Devices with Microscopy and Flow Cytometry to Study Microbial Transport in Porous Media Across Spatial Scales. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates the use of a microfluidic device to quantify bacterial motility through a porous matrix composed of randomly arranged pillars. Fluorescently labeled bacteria are introduced into the device, imaged via microscopy as they move through the porous matrix into the observation channel, and analyzed...

Assessing Bacterial Motility Using a Microfluidic Device

This video demonstrates neutrophil chemotaxis assay using an all-on-chip method. The method allows direct isolation of neutrophils from the whole blood by immunomagnetic negative selection followed by chemotaxis assay on a microfluidic chip.

A Microfluidic Chip-Based Method for Rapid Neutrophil Chemotaxis Analysis Using Whole Blood

Dit protocol Gegevens een test ontwikkeld om menselijk neutrofielchemotaxis meet van een druppel bloed met robuuste reproduceerbaarheid. Deze benadering omzeilt de noodzaak van neutrofielen scheiding en vereist slechts een paar minuten assay voorbereidingstijd. De microfluïdische chip maakt het mogelijk de herhaalde meting van neutrofielchemotaxis loop van de tijd bij zuigelingen of kleine zoogdieren, waar monster volume beperkt is.

Microfluidic Platform voor het meten neutrofielchemotaxis van onverwerkte volbloed

Dit artikel geeft de gedetailleerde methode om een ​​snelle neutrofiele chemotaxis-analyse te verrichten door de integratie van de on-chip neutrofiele isolatie uit volledig bloed en de chemotaxis-test op een enkele microfluïdische chip.

Een all-on-chip methode voor snelle neutrofiele chemotaxis analyse direct van een druppel bloed

Collectieve Celmigratie in ontwikkeling, wondgenezing en kanker metastasen wordt vaak geleid door de gradiënten van groeifactoren of signalering van moleculen. Hier beschreven is een experimenteel systeem dat tractie microscopie combineert met een microfluïdisch systeem en een demonstratie van het kwantificeren van de mechanica van collectieve migratie onder biochemische gradiënt.

Tractie microscopie geïntegreerd met microfluïdica voor Chemotactische collectieve migratie

Een protocol voor de generatie van dynamische chemische landschappen door fotolyse binnen microfluïde en millifluïde opstellingen wordt gepresenteerd. Deze methodologie is geschikt om diverse biologische processen te bestuderen, waaronder het motile gedrag, de opname van voedingsstoffen of aanpassing aan chemische stoffen van micro-organismen, zowel op eencellig als populatieniveau.

Het genereren van gecontroleerde, dynamische chemische landschappen om microbieel gedrag te bestuderen

Hier gepresenteerd is het protocol voor een in situ chemotaxis test, een recent ontwikkeld microfluïdisch apparaat dat studies van microbiële gedrag direct in de omgeving mogelijk maakt.

In Situ Chemotaxis Assay to Examine Microbial Behavior in Aquatic Ecosystems

Hier beschrijven we het gebruik van inducergradiëntplaten om bacteriële zwermmotiliteit te evalueren en tegelijkertijd meerdere concentratieresponsen te verkrijgen.

Kwantificering van de zwermmotiliteit van het bacteriële oppervlak op gradiëntplaten van inductoren

Leer hoe je een microfluïdische methode gebruikt om bacteriële chemotaxis te bestuderen met E. coli RP 4 37 in stabiele concentratiegradiënten. Dit protocol helpt onderzoekers gedrag van bacteriën te analyseren.

Een microfluïdische apparaat voor het kwantificeren van Bacteriële Chemotaxis in stabiele concentratiegradiënten

Meer video's verkennen