Studeren Synaptic Blaasjes zwembaden met behulp van Photoconversion van styrylkleurstoffen

Deze video demonstreert de procedure voor fotoconversie van Styro Dye FM 1 43. Om synaptische blaasjespools in drosophila melanogaster te bestuderen, worden eerst drosophila-larven gedissekeerd om de ventrale spieren bloot te leggen die de neuromusculaire junctie of NMJ-preparatie vormen. De preparaten worden geïncubeerd in buffer met FM D, hier in grijs weergegeven, ter labeling van het cellulaire membraan.

Vervolgens worden ze elektrisch of chemisch gestimuleerd om fysieke fusie te induceren, waarbij vesicle-membranen daarna worden geïnternaliseerd. De gestimuleerde exocytose wordt gekleurd met FM D. De extracellulaire FM-kleurstof wordt vervolgens weggewassen, waardoor deze van het plasmamembraan wordt verwijderd, en het weefsel wordt gefixeerd onder continue hoogintensieve verlichting. De kleurstof wordt volledig gebleekt en de zwarte kleur verschijnt door de precipitatie van diaminobenzidine.

Dit neerslag kan vervolgens worden gevisualiseerd met transmissie-elektronenmicroscopie. Hallo, ik ben Philippe o Paso van het laboratorium van Sylvia Olli aan het European Neuroscience Institute in Gaon, Duitsland. Vandaag laten we u een procedure zien voor FM-fotoconversie in de neuromusculaire overgang.

Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de recycling van synaptische blaasjes te bestuderen. Laten we beginnen. Werk onder een dissectiemicroscoop. Begin met het vastpinnen van een drosophila-larve met de dorsale zijde naar boven in een schaal gecoat met agarose.

Bedek het met drosophila-zoutoplossing met behulp van een spuitnaald en maak een longitudinale incisie langs de dorsale zijde met dissectiescharen. Verwijder vervolgens de interne organen. Rek daarna het preparaat uit en zet het opnieuw vast op de petri-schaal met spelden.

Vervolgens kunnen verschillende ventrale spieren worden gebruikt om de FM-kleurstoffen die in deze procedure worden gebruikt te beschermen tegen bleken. Deze procedure moet onder omstandigheden met weinig licht worden uitgevoerd. Bedek de geklemde drosophila-preparaat met drosophila-zoutoplossing die 90 millimolar kaliumchloride en 10 micromolar FM.1 43 kleurstof bevat om de zenuwen chemisch te stimuleren.

Incubeer gedurende één minuut bij kamertemperatuur na stimulatie. Verwijder de stimuleringsoplossing en dompel de schaal met de vastgepinde drosophila twee keer onder in een bekerglas gevuld met 100 milliliters drosophila-zoutoplossing om de extracellulaire FM 1 43-kleurstof te verwijderen, terwijl u onder een chemische veiligheidskap werkt.

Fixeer de neuromusculaire junctie-preparaat in 2,5% glutaraldehyde in fosfaatgebufferde zoutoplossing of PBS gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur. Was het preparaat eenmaal met PBS, verwijder het vervolgens uit de petrischaal en dompel het 15 minuten onder in 100 millimol ammoniumchloride om de vrije aldehydegroepen van het resterende glutaraldehydefixatiemiddel te neutraliseren.

Was de ammoniumchloride-oplossing met normale PBS, plaats de neuromusculaire junctie-preparatie in een nieuwe cigar dish en dompel deze onder in gefilterde 1,5 mg/mL diaminebenzidine of DAB in PBS en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 °C. Positioneer het monster onder een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een kwiklamp als lichtbron met een lamphouder die een achterspiegel bevat, gebruikmakend van een droge objectief met een relatief lage vergroting.

Zoek het monster. Breng vervolgens het fluorescentiesignaal in focus met behulp van een standaard blauwe excitatie-groene fluorescentie-filterkubus. De neuromusculaire juncties verschijnen als heldere vlekken op de spieren.

Verlicht vervolgens het monster met dezelfde fluorescentiefilterset bij maximale intensiteit totdat de FM D volledig is gebleekt. Met een 20 x objectief zouden 30 tot 45 minuten voldoende moeten zijn. De tijd voor fotoconversie varieert echter afhankelijk van de lichtintensiteit, de penetratiekracht van DAB in het preparaat en het gebruikte objectief.

Onderzoek na belichting de monster onder transmissielicht. Als er fotoconversie heeft plaatsgevonden, moet een donkerbruin neerslag zichtbaar zijn. Keer terug naar de dissectiescoop en gebruik vervolgens een schaar om de gefotoconverteerde plek uit de larve te knippen.

Keer terug naar de dissectiemicroscoop. Gebruik vervolgens een schaar om de gefotografeerde plek uit de larven te knippen. Plaats de monstername nu in een microcentrifugebuis met PBS, terwijl u werkt onder een chemische veiligheidskap en de passende veiligheidsuitrusting draagt, inclusief handschoenen en oogbescherming.

Bereid per monster 300 µL 1% osmiumtetroxide voor. Plaats het monster nu in een glazen fles met plastic dop en voeg de bereide osmiumtetroxide-oplossing toe voor de postfixering van het preparaat. Terwijl het monster incubeert, worden aparte oplossingen bereid met 30, 50, 70, 90, 95 en 100% ethanol.

Was het monster vier tot vijf keer met PBS gedurende vijf minuten per wasbeurt. Gebruik na elke wasbeurt een plastic PE-tip op uw pipet om het monster over te brengen naar een nieuwe kolf. Breng het monster na de laatste wasbeurt over naar een schone glazen kolf.

Dehydrateer vervolgens het monster door het in de reeks ethanoloplossingen te plaatsen. Begin met incuberen in één milliliter 30%ethanol. Verwijder na vijf minuten de ethanol met een pasteurpipet en vervang deze door één milliliter 50%ethanol.

Ga verder met de dehydratie door het preparaat van de neuromusculaire overgang te incuberen in de 70, 90 en vervolgens 95% oplossingen. Het monster wordt vervolgens drie keer geïncubeerd in een 95% ethanoloplossing, gevolgd door drie incubaties in 100% ethanol na de dehydratie. Voeg twee milliliter van een één-op-één EIN-hars in ethanol toe en plaats het monster in een roterende incubator.

Twee tot vier uur bij kamertemperatuur na rotatie bij 100%ein en plaats het monster in een open fles om het resterende ethanol gedurende vier tot zes uur te laten verdampen. Giet verse EIN in een mal. Voeg de preparaten toe en incubeer bij 60 °C gedurende 36 uur.

Wanneer de in EIN ingebedde preparaten klaar zijn, gebruik dan een ultramicrotoom om met een diamantmes coupes van 50 tot 80 nanometer dik voor te bereiden. De monsters worden in dunne coupes gesneden. De coupes drijven op het waterbad van het mes en kunnen vervolgens worden opgepikt op normale EM-grids.

De preparaten zijn nu klaar voor beeldvorming met behulp van conventionele EM-procedures. Geïsoleerde neuromusculaire juncties van Drosophila Melan gaster werden gestimuleerd met een hoge kaliumconcentratie en geïnternaliseerde membranen werden gekleurd met FM 1 43, zoals hier wordt getoond.

De fluorescentie van een zenuwuiteinde kan worden waargenomen met een conventionele epifluorescentiemicroscoop. Onder continue belichting wordt de kleurstof volledig uitgebleekt en wanneer de belichting aanhoudt, verschijnt er een zwarte kleur door neerslag van dinobenzeen. Deze zenuwuiteinde bevat synaptische blaasjes, maar geen van deze is gefotogonverteerd.

Dit kan worden veroorzaakt door onvoldoende belichting of een slechte penetratie van DIA amino benzine in het weefsel. Omgekeerd leidt te veel belichting tot een algemeen donkere terminus waarbij geen blaasjes of organellen te onderscheiden zijn; met de juiste hoeveelheid belichting is fotoconversie zichtbaar. Deze micrografie toont een synaptische knop waarin een verzameling donkere blaasjes te zien is, wat duidt op FM-fotoconversie.

We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u synaptische blaasjes die zijn gelabeld met fem-kleurstof fotochemisch kunt converteren. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de belichtingstijden voor de conversiestap altijd zorgvuldig moeten worden gekalibreerd. Dat is alles.

Bedankt voor het kijken. Veel succes met uw experimenten.