Name: Studeren Synaptic Blaasjes zwembaden met behulp van Photoconversion van styrylkleurstoffen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Leer fotoconversie van FM-kleurstoffen om synaptische blaasjes in Drosophila melanogaster te bestuderen. Deze methode maakt visualisatie van vesikelpopulaties mogelijk voor neurowetenschappelijk onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1) Bereiding van Drosophila melanogaster neuronale gespierd splitsing (NMJ) <ol><li> Bereid standaard Drosophila zoutoplossing (130 mM NaCl, 36 mM sucrose, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 2 mM MgCl 2, 5 mM Hepes, pH 7,3 4. </li><li> Ontleden de bereiding in een zoutoplossing (1.1). De Drosophila larven is dorsale zijde-up kwijnde in een Sylgard schotel; de dorsale zijde is ingedeeld lengte, en de inwendige organen worden verwijderd. Het preparaat wordt dan uitgerekt en kwijnde. Meerdere ventrale spieren kan dan worden gebruikt. </li></ol> 2) Stimuleren en FM-vlekken <ol><li> Het is raadzaam om de volgende stappen in omstandigheden met weinig licht te doen, om de FM-kleurstoffen te beschermen tegen bleken. </li><li> Voor de chemische stimulatie van de zenuwen, is hoog kalium buffer gebruikt. Bereid Drosophila zoutoplossing (zie 1.1) die 90 mM KCl en 10 uM van FM1-43 dye. Bewaar de oplossing beschermd tegen licht. </li><li> Bad van de voorbereiding met de vooraf bereide buffer gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur. </li><li> Wassen met standaard Drosophila zoutoplossing (1.1) met de extracellulaire FM1-43 kleurstof te verwijderen. Ga snel naar fixatie. </li></ol> 3) Vaststelling <ol><li> Bad van de voorbereiding met 2,5% glutaaraldehyde in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur. Voor een goede conservering van morfologische kenmerken, is glutaraldehyde voorkeur paraformaldehyde. </li><li> Was een keer met PBS en laat de voorbereiding onder water gedurende 15 minuten in 100 mM van NH 4 Cl. Deze stap is gedaan om de vrije aldehyde groepen van de resterende glutaraldehyde fixeermiddel lessen. </li><li> Was de NH 4 Cl-oplossing uit met normale PBS. </li></ol> 4) Photoconversion <ol><li> Incubeer de NMJ voorbereiding gedurende 30 minuten bij 4 ° C in PBS met 1,5 mg ml-1 van diaminobenzidine (DAB). </li><li> Plaats het monster onder de fluorescentie microscoop. Zoek en focus van de tl-signaal met behulp van een relatief lage vergroting water immersie objectief (20x 0.5 NA). </li><li> Verlicht het monster met de maximale intensiteit van lamp tot de FM-kleurstof is volledig gebleekt (figuur 1C). Om te controleren of photoconversion heeft plaatsgevonden, is het raadzaam om in de steekproef onder transmissie licht voor en na de FM-kleurstof bleken stap. Als photoconversion plaatsvindt, is een donkerbruin neerslag verwacht (figuur 1C). De verlichting is variabel, afhankelijk van de verlichting sterkte en ook op de DAB-penetratie in de voorbereiding. Voor de meeste voorbereidingen, vonden we verlichting tijden van ~ 30-45 minuten optimaal te zijn bij het gebruik van een 20x doelstelling. Kortere periodes verlichting worden gebruikt voor een hogere vergroting doelstellingen (60x). </li><li> Voor verlichting we de voorkeur aan een kwik lamp te gebruiken, met een lamp behuizing met daarin een back spiegel, waarin de back-verstrooide lichtstralen verzamelt, en daarom verhoogt de totale intensiteit. </li></ol> 5) Het verwerken van de steekproef voor EM <ol><li> Osmication <ol class="lalpha"><li> Bereid een oplossing met een volume van osmium tetroxide in de boom hoeveelheden water (ca. 300 ul per monster). Werken met osmium tetroxide moet worden gedaan onder de motorkap, met behulp van handschoenen en aye beschermingsmiddelen. </li><li> Incubeer de bereiding in de osmium tetroxide oplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (Onder de motorkap). </li><li> Was uitgebreid met PBS (4-5 keer 5 minuten) en breng elke monsters naar een schone glazen kolf. </li></ol></li><li> Uitdroging <ol class="lalpha"><li> Maak afzonderlijke oplossingen die 30, 50, 70 90, 95 en 100% van ethanol. </li><li> Voeg 1 ml 30% ethanol aan elk monster gedurende 5 minuten. </li><li> Voeg 1 ml 50% ethanol aan elk monster gedurende 5 minuten. </li><li> Voeg 1 ml 70% ethanol aan elk monster gedurende 5 minuten. </li><li> Voeg 1 ml 90% ethanol aan elk monster gedurende 5 minuten. </li><li> Voeg 1 ml 95% ethanol aan elk monster gedurende 5 minuten (herhaal 3x). </li><li> Voeg 1 ml 100% ethanol aan elk monster gedurende 5 minuten (herhaal 3x). </li></ol></li><li> Inbedding en de verdere verwerking <ol class="lalpha"><li> Meng 1 deel van EPON hars met een volume van ethanol. Voeg het toe aan de voorbereiding onder continue rotatie (2-4 uur). </li><li> Plaats de bereiding in 100% EPON in open kolven, om de resterende ethanol verdampen (4-6 uur). </li><li> Plaats de bereiding in schimmels bij 60 ° C voor 36 uur. </li><li> Elektronenmicroscopie verwerking. Verwerk de voorbereiding in 50 tot 80 nm dunne secties, met behulp van standaard ultramicrotomy procedures. </li></ol></li><li> Elektronenmicroscopie beeldvorming <ol class="lalpha"><li> Het preparaat is beeld gebracht met behulp van conventionele EM procedures. </li></ol></li></ol> 6) representatieve resultaten De verwachte resultaten worden beschreven in de figuren 1C en 2. De verlichting procedure resulteert in de vorming van brown DAB neerslag, die zal worden zichtbaar in zowel fluorescentie en transmissie beeldvorming. Het eerste optreden tijdens de belichting is het verdwijnen van de fluorescentie in verband met de FM-kleurstof vlekken. De achtergrond fluorescentie veroorzaakt door de aldehyde fixatief, daarentegen, wordt zichtbaar in het experiment. Het bleken gebeurt meestal in ~ 10-20 minuten na het begin van verlichting. Meestal niet photoconversion product kan worden waargenomen op dit moment punt. Verlichting moet worden voortgezet, en na ~ 10 minuten de voorbereidingen zal wenden tot een bruine tint als gevolg van DAB-accumulatie (afb. 1C iv) Het is niet duidelijk waarom de DAB-en FM-neerslag kleurstof bleken niet gelijktijdig plaatsvinden, is het mogelijk dat een relatief groot hoeveelheid geoxideerd DAB moet verzamelen voor aggregatie en neerslag, en dat daarom deze reactie is langzamer dan het bleekproces. In dit stadium, maar de voorbereiding is nog niet klaar voor elektronenmicroscopie verwerking, zoals de DAB neerslag is waarschijnlijk onvolledig. Wij geven de voorkeur aan 5-10 minuten langer te wachten, waarin de voorbereiding (presynaptische zenuwuiteinde) een donker-bruin (of zwart) kleur, indicatief voor volledige omzetting op zich neemt. Een lichte verbouwing van de algemene oppervlak van het preparaat (bijvoorbeeld van de spiervezels in een neuromusculaire verbinding) kan worden waargenomen in dit stadium. Het is zeer waarschijnlijk te maken met een conversie van DAB veroorzaakt door autofluorescentie (en / of fixatief fluorescentie), en het is niet schadelijk voor de procedure. Het preparaat wordt vervolgens verwerkt voor elektronenmicroscopie, en moet worden gecontroleerd op de aanwezigheid van donkere (label) blaasjes. Zoals we hebben aangetoond voordat 5,6, deze blaasjes zijn veel compacter dan niet-gelabeld degenen, en zijn daarom makkelijk te onderscheiden (Figuur 2B). Om de kans te onderscheiden en de verschillende types van blaasjes te verhogen, mag geen contrast-verbeterende na kleuring van de secties worden uitgevoerd (geen uranylacetaat of lood citraat vlekken), de osmium kleuring is voldoende om de meeste cellulaire elementen te observeren, en is niet zo donker als DAB neerslag. <img src="/files/ftp_upload/1790/1790fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1: FM kleurstoffen en te gebruiken voor photoconversion. (A) geeft de stappen van een klassiek experiment voor het laden en distaining blaasjes met behulp van FM-dye onder stimulatie. (I) Incubeer het monster in de FM-dye met buffer. (Ii) stimuleren (elektrisch of chemisch) om blaasjes fusie te induceren in de aanwezigheid van FM-kleurstof. (Iii) De subsequence endocytose na stimulatie laadt een aantal blaasjes met FM kleurstof nog steeds aanwezig in het extracellulaire buffer. (Iv) Vervang de extracellulaire FM kleurstof door te wassen met buffer. (V) Een nieuwe stimulatie zal leiden geladen blaasjes op hun FM-kleurstofvrijmaking op exocytose. (B) Schematische met de kop, brug en staart van de FM1-43 dye. (C) Voorbeeld van een photoconversion experiment in Drosophila NMJ. (I) Na het laden van de NMJ met FM1-43, het wassen van externe kleurstofmoleculen en tot vaststelling, kan de fluorescentie van een zenuw klem worden waargenomen met een conventionele epifluorescentiemicroscoop (63x). (Ii-iii) Onder continue verlichting van de kleurstof is volledig gebleekt. (Iv) Bij de verlichting blijft, een zwarte kleur lijkt te wijten aan diaminobenzidine neerslag. Schaalbalk staat voor 10 micrometer. <img src="/files/ftp_upload/1790/1790fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2: EM voorbeelden van photoconverted monsters (A) De afbeelding toont een zenuwuiteinde met synaptische blaasjes, maar niet van hen zijn photoconverted, dit kan worden veroorzaakt door het niet genoeg verlichting of slechte diaminobenzidine penetratie in het weefsel.. (B) Synaptic bouton met verschillende donkere (gevuld) blaasjes die ging via de FM-photoconversion. (C) overschotten van verlichting resulteert in een totale donker terminal waar geen blaasjes of organellen zijn te onderscheiden. Schaal balken geven 200 nm.

<ol><li>Betz, W. J., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+analysis+of+synaptic+vesicle+recycling+at+the+frog+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction.</a> Science. 255, 200-203 (1992).</li>
<li>Henkel, A. W., Lübke, J., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FM1-43+dye+ultrastructural+localization+in+and+release+from+frog+motor+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">FM1-43 dye ultrastructural localization in and release from frog motor nerve terminals.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 93, 1918-1923 (1996).</li>
<li>Sandell, J. H., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoconversion+of+some+fluorescent+markers+to+a+diaminobenzidine+product%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Photoconversion of some fluorescent markers to a diaminobenzidine product.</a> J Histochem Cytochem. 36, 555-559 (1988).</li>
<li>Kuromi, H., Kidokoro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+optically+determined+size+of+exo%2Fendo+cycling+vesicle+pool+correlates+with+the+quantal+content+at+the+neuromuscular+junction+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The optically determined size of exo/endo cycling vesicle pool correlates with the quantal content at the neuromuscular junction of Drosophila larvae.</a> J Neurosci. 19, 1557-1565 (1999).</li>
<li>Denker, A., Kröhnert, K., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+synaptic+vesicle+pool+localization+in+the+Drosophila+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Revisiting synaptic vesicle pool localization in the Drosophila neuromuscular junction.</a> J Physiol (Lond). 587, 2919-2926 (2009).</li>
<li>Rizzoli, S. O., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+organization+of+the+readily+releasable+pool+of+synaptic+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The structural organization of the readily releasable pool of synaptic vesicles.</a> Science. 303, 2037-2039 (2004).</li>
<li>Darcy, K. J., Staras, K., Collinson, L. M., Goda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+sharing+of+recycling+synaptic+vesicles+between+presynaptic+boutons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Constitutive sharing of recycling synaptic vesicles between presynaptic boutons.</a> Nat Neurosci. 9, 315-321 (2006).</li>
<li>Harata, N., Ryan, T. A., Smith, S. J., Buchanan, J., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+recycling+synaptic+vesicles+in+hippocampal+neurons+by+FM1-43+photoconversion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Visualizing recycling synaptic vesicles in hippocampal neurons by FM1-43 photoconversion.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98, 12748-12753 (2001).</li>
<li>Lange, R. P. J. de, de Roos, A. D. G., Borst, J. G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+modes+of+vesicle+recycling+in+the+rat+calyx+of+Held%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Two modes of vesicle recycling in the rat calyx of Held.</a> J Neurosci. 23, 10164-10173 (2003).</li>
<li>Richards, D. A., Guatimosim, C., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicle+pools+at+the+frog+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicle pools at the frog neuromuscular junction.</a> Neuron. 39, 529-541 (2003).</li>
</ol>

Een paar kritische stappen moet rekening worden gehouden met: <ul><li> De DAB incubatie mag alleen worden uitgevoerd na een grondig wassen en afschrikken van de voorbereidingen. Anders wordt de niet-gereageerde glutaaraldehyde zal interageren met DAB en de oorzaak zijn neerslag (meestal in de vorm van platte kristallen, die niet elektron dicht). De voorbereidingen waar dit gebeurt neerslag overvloedig zijn zelden bruikbaar zijn voor elektronenmicroscopie. </li><li> Verlichting tijden moet worden geoptimaliseerd, doo...

<table><tbody><tr><td>FM 1-43</td><td>Invitrogen</td><td>F10317</td><td></td></tr><tr><td>Epon-hars</td><td>Plano GmbH</td><td>R1030</td><td></td></tr><tr><td>di-aminobenzidine hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5905</td><td></td></tr><tr><td>50% Glutaraldehyde</td><td>AppliChem</td><td>A3166</td><td>EM-kwaliteit</td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Dow Corning</td><td>104186298</td><td></td></tr><tr><td>Axioskop 2 FS plus</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objectief 20x 0,5 NA</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>Droog objectief</td></tr><tr><td>100W Hg-lamp</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lamphouder met achterspiegel</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>1007-980</td><td></td></tr><tr><td>MRm-camera</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>0445-554</td><td>Beeldacquisitie</td></tr><tr><td>Ex.-filter (HQ 470/40)</td><td>AHF</td><td>F49-671</td><td></td></tr><tr><td>Dichroïsche spiegel (495 DCLP)</td><td>AHF</td><td>F33-100</td><td></td></tr><tr><td>Em.-filter (HQ 500 LP)</td><td>AHF</td><td>F42-018</td><td></td></tr><tr><td>EM</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proscan CCD HSS</td><td>Proscan Electronic Sys.</td><td></td><td>1024 x 1024</td></tr></tbody></table>

studeren synaptic blaasjes zwembaden met behulp van photoconversion van styrylkleurstoffen

Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

De fusie van synaptische blaasjes met de plasmamembraan (exocytose) is een vereiste stap in de neurotransmitters en neuronale communicatie. De blaasjes worden vervolgens opgehaald uit de plasmamembraan (endocytose) en samengevoegd met de algemene pool van blaasjes in het zenuwuiteinde, totdat ze ondergaan een nieuwe exo-en endocytose cyclus (blaasjes recycling). Deze processen zijn bestudeerd met behulp van een verscheidenheid aan technieken zoals elektronen microscopie, elektrofysiologie opnames, amperometrie en capaciteit metingen. Belangrijk is dat gedurende de laatste twee decennia een aantal van de fluorescent gelabelde markers ontstaan, waardoor optische technieken om blaasjes track in hun recycling dynamiek. Een van de meest gebruikte markers is de styrylkleurstoffen of de FM-kleurstof 1, structureel, alle FM-kleurstoffen bevatten een hydrofiele kop en een staart van lipofiele aangesloten via een aromatische ring en een of meer dubbele bindingen (Fig. 1B). Een klassieke FM kleurstof experiment om een pool van blaasjes label bestaat uit het wassen van de voorbereiding (Fig. 1Ai) met de kleurstof tijdens de stimulatie van de zenuw (elektrisch of met een hoge K +). Dit leidt tot blaasje recycling en de daaropvolgende laden van de kleurstof in recent endocytosed blaasjes (afb. 1A i-iii). Na het laden van de blaasjes met kleurstof, een tweede ronde van de stimulatie in een dye-vrij bad zou leiden tot de FM-versie door middel van exocytose (afb. 1A IV-V), proces dat kan worden gevolgd door het toezicht op de fluorescentie-intensiteit afnemen (ontkleuren). Hoewel de FM kleurstoffen hebben sterk bijgedragen aan het gebied van recycling blaasje, is het niet mogelijk om de exacte lokalisatie of de morfologie van de individuele blaasjes te bepalen door gebruik te maken van conventionele fluorescentie microscopie. Om die reden leggen we uit hier hoe FM kleurstoffen kunnen ook worden gebruikt als endocytische markers met behulp van elektronenmicroscopie, door middel van photoconversion. De photoconversion techniek maakt gebruik van het eigendom van fluorescente kleurstoffen aan reactive oxygen species te genereren onder intense verlichting. Fluorescent gelabelde bereidingen worden ondergedompeld in een oplossing die diaminobenzidine (DAB) en verlicht. Reactieve stoffen die door de kleurstof moleculen oxideren van de DAB, die een stabiele, onoplosbaar precipitaat dat een donkere verschijning heeft en kan gemakkelijk worden onderscheiden in elektronenmicroscopie 2,3 vormen. Omdat DAB is alleen geoxideerd in de directe omgeving van fluorescerende moleculen (zoals de reactieve zuurstof species zijn van korte duur), de techniek zorgt ervoor dat alleen fluorescent gelabelde structuren gaan de elektron-dense neerslag bevatten. De techniek laat dus de studie van de exacte locatie en de morfologie van actief recycling organellen.

FM kleurstoffen zijn van onschatbare hulp bij het begrijpen van synaptische dynamiek. FMS worden normaal gevolgd onder de fluorescentie microscoop tijdens de verschillende stimulatie omstandigheden. Echter, photoconversion van de FM-kleurstoffen in combinatie met elektronenmicroscopie kan de visualisatie van verschillende synaptische vesicles zwembaden, onder andere ultrastructuur componenten, in de synaptische boutons.

Studeren Synaptic Blaasjes zwembaden met behulp van Photoconversion van styrylkleurstoffen

De fusie van synaptische blaasjes met het plasmamembraan (exocytose) is een noodzakelijke stap in de afgifte van neurotransmitters en neuronale communicatie. De ...

Deze video demonstreert de procedure voor fotoconversie van Styro Dye FM 1 43. Om synaptische blaasjespools in drosophila melanogaster te bestuderen, worden eerst drosophila-larven gedisseceerd om de ventrale spieren bloot te leggen, welke de neuromusculaire junctie of NMJ-preparatie vormen. De preparaten worden geïncubeerd in een buffer die FM D bevat, hier in het grijs weergegeven, ter markering van het cellulaire membraan.Vervolgens worden ze elektrisch of chemisch gestimuleerd om fysieke fusie te induceren, waarna vesikelmembranen worden geïnternaliseerd. Gestimuleerde exocytose zal worden gekleurd met FM D. De extracellulaire FM-kleurstof wordt vervolgens weggewassen om deze van het plasmamembraan te verwijderen, waarna het weefsel wordt gefixeerd onder continue hoogintensieve verlichting. De kleurstof wordt volledig gebleekt en de zwarte kleur verschijnt door neerslag van diaminobenzidine.Dit neerslag kan vervolgens worden gevisualiseerd met transmissie-elektronenmicroscopie. Hallo, ik ben Philippe o Paso van het laboratorium van Sylvia Olli aan het European Neuroscience Institute in Gaon, Duitsland. Vandaag laten we u een procedure zien voor FM-fotoconversie in de neuromusculaire overgang.We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de recycling van synaptische blaasjes te bestuderen. Laten we beginnen. Werk onder een dissectiemicroscoop. Begin met het vastpinnen van een Drosophila-larve met de dorsale zijde naar boven in een schaal gecoat met agarose.Bedek het met drosophila-zoutoplossing met behulp van een injectienaald en maak met een dissectieschaar een longitudinale incisie langs de dorsale zijde. Verwijder vervolgens de inwendige organen. Rek daarna het preparaat uit en zet het opnieuw vast op de petri-schaal met spelden.Verschillende ventrale spieren kunnen vervolgens worden gebruikt om de in deze procedure gebruikte FM-kleurstoffen te beschermen tegen bleken. Deze procedure moet onder omstandigheden met weinig licht worden uitgevoerd. Bedek het geklemde drosophila-preparaat met drosophila-zoutoplossing die 90 millimolar kaliumchloride en 10 micromolar FM.1 43 bevat om de zenuwen chemisch te stimuleren.Incubeer gedurende één minuut bij kamertemperatuur na de stimulatie. Verwijder de stimulerende oplossing en dompel het schaaltje met de gepinde drosophila-preparaat twee keer onder in een bekerglas gevuld met 100 milliliters drosophila-saline om de extracellulaire FM 1 43-kleurstof te verwijderen, terwijl u werkt onder een chemische afzuigkap.Fixeer het neuromusculaire junctiepreparaat in 2,5% glutaaraldehyde in fosfaatgebufferde zoutoplossing of PBS gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur. Was het preparaat één keer met PBS, haal het vervolgens uit de schaal en dompel het 15 minuten onder in 100 millimol ammoniumchloride om de vrije aldehydegroepen van het resterende glutaaraldehydefixatief te neutraliseren.Was de ammoniumchloride-oplossing met normale PBS, plaats de neuromusculaire junctie-preparatie in een nieuwe cigar dish en dompel deze onder in gefilterde 1,5 mg/mL diaminebenzidine of DAB in PBS en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 °C. Positioneer het monster onder een fluorescentiemicroscoop die is uitgerust met een kwiklamp als lichtbron, met een lamphuis dat een achterspiegel bevat, gebruikmakend van een droog objectief met een relatief lage vergroting.Zoek het monster. Breng vervolgens het fluorescentiesignaal in focus met behulp van een standaard blauwe excitatie/groene fluorescentie-filterkubus. De neuromusculaire overgangen verschijnen als heldere vlekken op de spieren.Belicht vervolgens het monster met dezelfde fluorescentiefilterset op maximale intensiteit totdat de FM D volledig is gebleekt. Met een 20 x objectief zouden 30 tot 45 minuten voldoende moeten zijn. De tijd voor fotoconversie varieert echter afhankelijk van de belichtingsintensiteit, de penetratiekracht van DAB in het preparaat en het gebruikte objectief.Onderzoek het monster na belichting onder transmissielicht. Indien er fotoconversie heeft plaatsgevonden, zou een donkerbruin precipitaat zichtbaar moeten zijn. Keer terug naar de dissectiescoop en gebruik vervolgens een schaar om de gefotoconverteerde plek uit de larve te knippen.Keer terug naar de dissectiescoop. Gebruik vervolgens een schaar om de gefotografeerde plek uit de larven te knippen. Plaats de monstername nu in een microcentrifugebuis met PBS, terwijl u werkt onder een chemische zuigkast en de juiste veiligheidsuitrusting draagt, inclusief handschoenen en oogbescherming.Bereid per monster 300 µL 1% osmiumtetroxide voor. Plaats het monster vervolgens in een glazen fles met plastic dop en voeg de bereide osmiumtetroxide-oplossing toe om de preparatie te postfixeren. Terwijl het monster incubeert, worden aparte oplossingen bereid met 30, 50, 70, 90, 95 en 100% ethanol.Was het monster vier tot vijf keer met PBS gedurende vijf minuten per keer. Gebruik na elke wasbeurt een plastic PE-tip op uw pipet om het monster over te brengen naar een nieuwe kolf. Breng het monster na de laatste wasbeurt over naar een schone glazen kolf.Dehydrateer vervolgens het monster door het in de reeks ethanoloplossingen te plaatsen. Begin met incuberen in 1 mL 30% ethanol. Verwijder na vijf minuten de ethanol met een pasteurpipet en vervang deze door 1 mL 50% ethanol.Ga verder met de dehydratie door het preparaat van de neuromusculaire overgang te incuberen in 70%, 90% en vervolgens 95% oplossingen. Het monster wordt daarna twee keer geïncubeerd in een 95% ethanoloplossing, gevolgd door drie incubaties in 100% ethanol na de dehydratie. Voeg twee milliliters van een een-op-een EIN-hars in ethanol toe en plaats het monster op een rotatie-incubator.Twee tot vier uur bij kamertemperatuur na rotatie bij 100%ein en plaats het monster in een open fles om de resterende ethanol gedurende vier tot zes uur te laten verdampen. Giet verse EIN in een mal. Voeg de preparaten toe en incubeer bij 60 °C gedurende 36 uur.Wanneer de in EIN ingebedde preparaten gereed zijn, gebruik dan een ultramicrotoom om met een diamantmes coupes van 50 tot 80 nanometer dik voor te bereiden. De monsters worden in dunne coupes gesneden. De coupes drijven op het waterbad van het mes en kunnen vervolgens worden opgepikt op normale EM-grids.De preparaten zijn nu klaar om te worden afgebeeld met behulp van conventionele EM-procedures. Geïsoleerde neuromusculaire juncties van Drosophila Melan gaster werden gestimuleerd met een hoge concentratie kalium, en geïnternaliseerde membranen werden gekleurd met FM 1 43 zoals hier wordt getoond.De fluorescentie van een zenuwuiteinde kan worden waargenomen met een conventionele epifluorescentiemicroscoop. Bij continue belichting wordt de kleurstof volledig gebleekt en wanneer de belichting aanhoudt, verschijnt er een zwarte kleur door precipitatie van dinobenzine. Dit zenuwuiteinde bevat synaptische blaasjes, maar geen van deze zijn gefotoconverteerd.Dit kan worden veroorzaakt door onvoldoende belichting of een slechte penetratie van DIA-aminobenzeen in het weefsel. Daarentegen leidt te veel belichting tot een algehele donkere terminal waarbij geen blaasjes of organellen meer te onderscheiden zijn; met de juiste hoeveelheid belichting is fotoconversie zichtbaar. Deze micrografie toont een synaptische knop waarin een verzameling donkere blaasjes te zien is, wat duidt op FM-fotoconversie.We hebben zojuist gedemonstreerd hoe synaptische blaasjes die gelabeld zijn met fem-kleurstof fotochemisch kunnen worden omgezet. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de belichtingstijden voor de conversiestap altijd zorgvuldig moeten worden gekalibreerd. Dat is alles.Bedankt voor het kijken. Veel succes met uw experimenten.

studying-synaptic-vesicle-pools-using-photoconversion-of-styryl-dyes

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Dit rapport toont een techniek voor mechanische isolatie van individuele levensvatbare neuronen te behouden bevestigd presynaptische boutons. Vibrodissociated neuronen hebben de voordelen van een snelle productie, een uitstekende farmacologische controle en een betere ruimte-clamp zonder invloed van naburige cellen. Deze methode kan gebruikt worden voor beeldvorming van synaptische elementen en patch-clamp opname.

Vibrodissociation van de neuronen van knaagdieren Brain Slices synaptische transmissie en Image presynaptische Terminals Study

Een live fluorescentie imaging techniek om de aanvulling en de mobilisatie van specifieke synaptische vesicles (SV) zwembaden in het centrum van zenuwuiteinden te kwantificeren wordt beschreven. Twee rondes van SV recycling worden bewaakt in dezelfde zenuwuiteinden die een interne controle.

Kwantitatieve analyse van synaptische Blaasjes Pool Replenishment in gekweekte Cerebellaire Korrel Neuronen met behulp van FM-kleurstoffen

This video demonstrates a protocol to study synaptic vesicle recycling at neuromuscular junctions in channelrhodopsin-expressing Drosophila larvae using a fluorescent dye. Blue light activates the channelrhodopsins, causing calcium influx and synaptic vesicle exocytosis. The dye integrates into the neuronal membranes and is internalized during endocytosis, resulting in enhanced fluorescence. Further blue light stimulation induces exocytosis and dye release, which is shown by reduced...

Analyzing Synaptic Vesicle Recycling and Fluorescent Dye Uptake in Drosophila Larvae

This video demonstrates the procedure for preparing cultured neurons for optical analysis of recycled synaptic vesicles. The process involves fluorescence tagging of synaptic vesicle proteins and immunostaining to label and visualize the recycled vesicles within the neurons.

Preparing Cultured Neurons for Optical Analysis of Recycled Synaptic Vesicles

We beschrijven het gebruik van styrylkleurstoffen FM kleurstoffen aan het synaptische blaasje recycling in functionele zenuwuiteinden. Dit protocol kan niet alleen opgeroepen, maar ook spontane en miniatuur synaptische activiteiten worden toegepast. Het protocol breidt het aantal synaptische gebeurtenissen die effectief kan worden geëvalueerd.

Onderzoek van de synaptische vesikel Recycling FM Kleurstoffen Tijdens Evoked, Spontaan, en Miniature Synaptic Activiteiten

Dit artikel beschrijft een methode voor het onderzoeken van de dynamica van neurotransmittervesicles in neuroblastoomcellen, met behulp van een synaptobrevin2-pHluorine construct en Total Internal Reflection Fluorescence Microscopie. De strategie die ontwikkeld is voor beeldverwerking en gegevensanalyse wordt ook gerapporteerd.

TIRFM en pH-gevoelige GFP-sondes naar Neurotransmitter Vesicle Dynamics Evalueer in SH-SY5Y Neuroblastoom Cellen: cell imaging en data-analyse

Hier laten we zien hoe het aantal en de ruimtelijke verdeling van synaptische actieve zones in Drosophila melanogaster fotoreceptoren te kwantificeren, gemarkeerd met een genetisch gecodeerde moleculaire marker, en hun modulatie na langdurige blootstelling aan licht.

Het analyseren van Synaptic Modulatie van<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Fotoreceptoren na blootstelling aan Langdurige Light

Synaptic Vesikel (SV) fietsen is het mechanisme van de kern van de intercellulaire communicatie in neuronale synapsen. FM kleurstof opname- en release zijn het belangrijkste middel van kwantitatief onderzoek SV endo- en exocytose. Hier, vergelijken wij alle stimulatie methoden om te rijden FM1-43 fietsen in de Drosophila motorische eindplaat (NMJ) model synaps.

FM kleurstof fietsen in de synaps: vergelijken van hoge kalium depolarisatie, elektrische en Channelrhodopsin stimulatie

We beschrijven een optische assay voor synaptic Vesikel (SV) recycling in gekweekte neuronen. Dit protocol combineert met dubbele transfectie uitspreken een presynaptische marker en proteïne van belang stelt ons in staat te vinden presynaptische sites, hun synaptic vesikel recycling capaciteit bepalen van de rol van de proteïne van belang.

Een optische Assay voor Synaptic vesikel Recycling in gekweekte neuronen Overexpressing presynaptische eiwitten

Twee gerelateerde methoden worden beschreven om subcellulaire gebeurtenissen te visualiseren die nodig zijn voor synaptische transmissie. Deze protocollen maken de real-time monitoring van de dynamiek van presynaptische calciuminstroom en synaptische vesikelmembraanfusie mogelijk met behulp van live-cell imaging van in vitro gekweekte neuronen.

Real-time fluorescerende meting van synaptische functies in modellen van amyotrofische laterale sclerose

Leer fotoconversie van FM-kleurstoffen om synaptische blaasjes in Drosophila melanogaster te bestuderen. Deze methode maakt visualisatie van vesikelpopulaties mogelijk voor neurowetenschappelijk onderzoek.

Studeren Synaptic Blaasjes zwembaden met behulp van Photoconversion van styrylkleurstoffen

Meer video's verkennen