Name: Implantatie van Ferumoxides Gelabelde humane mesenchymale stamcellen in kraakbeenletsels (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 39 s
Description: Leer een reproduceerbare methode voor matrix-geassocieerde stamcelimplantaten in kraakbeenletsels met Ferumoxides-labeling en 7T-MR-visualisatie. Deze techniek ondersteunt niet-invasieve tracking van humane mesenchymale stamcellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een subsidie ​​van het Nationaal Instituut van artritis en spier Skin Diseases, NIH RO1AR054458.

1. Etikettering van hMSCs met Endorem <ol><li> Cellen zijn gegroeid tot 80% confluentie ten minste 18 uur voor etikettering. </li><li> Gedurende deze tijd, is het labelen van media bereid door toevoeging van Endorem om het monster op een dosis van 100 ug Fe / ml serum-vrije media. </li><li> Na de cellen worden gekweekt tot confluentie, is cultuur media opgezogen en cellen worden gewassen 1x met PBS of serum-vrije media. </li><li> Vervolgens wordt de spoeling oplossing opgezogen en de vooraf bereide etikettering media is toegevoegd. De cellen worden vervolgens geïncubeerd bij 37 ° C, 5% CO 2 voor 4 uur. </li><li> Na 4 uur incubatie, is het labelen van media opgezogen en cellen worden gespoeld met PBS en getrypsiniseerd zoals gewoonlijk. </li><li> Eenmaal getrypsiniseerd, worden de cellen gewassen met PBS 3x en gecentrifugeerd bij 400rcf gedurende 5 minuten. </li><li> Na deze wasstap, worden de cellen geresuspendeerd, geteld, beoordeeld op levensvatbaarheid, en worden gebruikt als nodig is voor experimenten. </li></ol> 2. Voorbereiden Agarose <ol><li> Nadat de cellen zijn gelabeld is het tijd om de voorbereiding van de agarose-oplossing. </li><li> Op een mooie schaal, zijn 80 mg agarose poeder afgewogen en toegevoegd aan 2 ml PBS. </li><li> Deze oplossing wordt dan zachtjes geschud en geautoclaveerd. </li><li> Na ongeveer 40 min, kan de vloeistof agarose oplossing worden genomen van de autoclaaf. Het volume moet worden gemeten en dienovereenkomstig te worden aangepast met voorverwarmde PBS. </li><li> Dan is de oplossing afgekoeld tot 42 ° C </li></ol> 3. Het creëren van MASI <ol><li> Wanneer de agarose-oplossing heeft de gewenste temperatuur bereikt, worden de cellen geteld en gecentrifugeerd voor de laatste keer in een 1,5 ml Eppendorf buis. </li><li> Na het centrifugeren, is het supernatant verwijderd en de cellen worden gemengd met de DMEM tot een concentratie van 30 x 10 6 cellen / ml te bereiken. </li><li> Nu de cellen worden gemengd met de 42 ° C warm agarose. </li><li> Een koude pipetpunt kan agarose te stollen in de tip, daarom is het aangeraden om Verwarm de tip door pipetteren hete steriele PBS op en neer </li><li> Nu, hetzelfde volume van agarose als media wordt in beslag genomen en grondig gemengd met de cell-media-vering, zodat een homogene suspensie is gemaakt. </li><li> Houd de eppendorfbuisje in een voorverwarmde waterbad tijdens het mengen, zodat de agarose niet afkoelen genoeg om te stollen. </li><li> Dat de opschorting homogeen is, zijn de cellen geïmplanteerd in het defect. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1793/1793fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Coronale T2-gewogen SE beelden (TR 4000 ms / TE 18,27 ms) van een patella exemplaar met geïmplanteerde hMSCs in kraakbeen defecten.

<ol><li>Mauck, R. L., Yuan, X., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrogenic+differentiation+and+functional+maturation+of+bovine+mesenchymal+stem+cells+in+long-term+agarose+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Chondrogenic differentiation and functional maturation of bovine mesenchymal stem cells in long-term agarose culture.</a> Osteoarthritis Cartilage. 14, 179-189 (2006).</li>
<li>Pittenger, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+potential+of+adult+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.</a> Science. 284, 143-147 (1999).</li>
<li>Rahfoth, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+allograft+chondrocytes+embedded+in+agarose+gel+into+cartilage+defects+of+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Transplantation of allograft chondrocytes embedded in agarose gel into cartilage defects of rabbits.</a> Osteoarthritis Cartilage. 6, 50-65 (1998).</li>
<li>Henning, T. D., Boddington, S., Daldrup-Link, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+hESCs+and+hMSCs+with+iron+oxide+nanoparticles+for+non-invasive+in+vivo+tracking+with+MR+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Labeling hESCs and hMSCs with iron oxide nanoparticles for non-invasive in vivo tracking with MR imaging.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
</ol>

De beschreven protocol voorziet in een reproduceerbare manier om MSC label met ijzeroxide nanodeeltjes en implantaat deze gelabelde MSC&#39;s in het kraakbeen defecten. Deze techniek maakt niet-invasieve weergave van stamceltransplantaties in letsels aan het kraakbeen met MR beeldvorming, die een vroegtijdige detectie van MASI mislukking toestaat. Een dislocatie of efflux van de gelabelde cellen kan worden gediagnosticeerd op basis van een verdwijning van het label van de transplantatie site op MR-beelden. Een vroege di...

<table><tbody><tr><td>D-MEM High Glucose</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>PBS (Ca&lt;sup&gt;++&lt;/sup&gt;, Mg&lt;sup&gt;++&lt;/sup&gt; vrij)</td><td></td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA 0.05%</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>25399-120</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td></td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine</td><td></td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Ferumoxiden (Endorem)</td><td></td><td>Guerbet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose Typ VII</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9045</td><td>Verdun Agarose in PBS tot een uiteindelijke concentratie van 4%</td></tr></tbody></table>

implantatie van ferumoxides gelabelde humane mesenchymale stamcellen in kraakbeenletsels

Implantation of Ferumoxides Labeled Human Mesenchymal Stem Cells in Cartilage Defects

Op het gebied van tissue engineering integreert de principes van de engineering, celbiologie en geneeskunde aan de regeneratie van specifieke cellen en functionele weefsel. Matrix geassocieerd stamcelimplantaten (MASI) hebben tot doel kraakbeen defecten als gevolg van artritis of traumatische letsel aan gewrichten te regenereren. Volwassen mesenchymale stamcellen (MSC&#39;s) hebben de mogelijkheid om te differentiëren tot cellen van de chondrogenische afstamming en veelbelovende resultaten laten zien voor cel-gebaseerde kraakbeen te herstellen technologieën. Autologe MSC&#39;s kunnen worden geïsoleerd uit een verscheidenheid van weefsels, kan worden uitgebreid in celculturen zonder verlies van hun differentiatie potentieel, en hebben aangetoond chondrogene differentiatie in vitro en in vivo 1, 2. Om lokale behoud en de levensvatbaarheid van de getransplanteerde MSC&#39;s in kraakbeendefecten bieden, is een steiger nodig, die ook de daaropvolgende differentiatie en proliferatie ondersteunt. De architectuur van de steiger gidsen weefsel vorming en laat de extracellulaire matrix, geproduceerd door de stamcellen, uit te breiden. Eerdere onderzoeken hebben aangetoond dat een 2% agarose steiger kan de ontwikkeling van stabiele hyalien kraakbeen te ondersteunen en veroorzaakt geen immuunreacties 3. Op lange termijn behoud van getransplanteerde stamcellen in MASI is cruciaal voor het herstel van kraakbeen. Etikettering van MSC&#39;s met ijzeroxide nanodeeltjes maakt voor de lange termijn in vivo tracking met niet-invasieve MRI technieken 4. Deze presentatie zal aantonen technieken voor het labelen van MSC&#39;s met ijzeroxide nanodeeltjes, de generatie van cel-agarose constructen en de implantatie van deze constructen in de gebreken van het kraakbeen. De gelabelde constructen kunnen non-invasief worden gevolgd met MR-Imaging.

Doel van de presentatie is om aan te tonen een zeer reproduceerbare methode om matrix geassocieerd stamcelimplantaten genereren in kraakbeen defecten, die kunnen worden gevisualiseerd met MRI. Stamcellen zijn gelabeld met de FDA-goedgekeurde Ferumoxides, vermengd met agarose, geïmplanteerd in letsels aan het kraakbeen en afgebeeld met een 7T MR-scanner.

Implantatie van Ferumoxides Gelabelde humane mesenchymale stamcellen in kraakbeenletsels

Het vakgebied van de weefseltechnologie integreert principes uit de engineering, de celbiologie en de geneeskunde met als doel de regeneratie van specifieke cellen en ...

Het doel van de presentatie is om een eenvoudige en reproduceerbare methode voor de productie van MASI te demonstreren met para-oxiden gelabelde HME's voor het volgen van stamceltherapie. Bij MR-beeldvormingslabeling wordt het medium bereid, toegevoegd aan een T 75-fles en vier uur geïncubeerd. Vervolgens worden de cellen getrypsineerd en gewassen.Na drie keer wassen worden de cellen geresuspendeerd en wordt agros gel aan de buis toegevoegd. De cellen zijn nu klaar voor implantatie in kraakbeendefecten. Hallo, ik ben Alex.Ik ben re peel van het laboratorium van High Delta Blink, het Contrastmiddelenlaboratorium van de afdeling Radiologie aan de University of California San Francisco. Ik ben Lydia Men, eveneens van het Contrastmiddelenlab.Vandaag laten we u een procedure zien voor het labelen van mesenchymale stamcellen met ijzeroxide-nanodeeltjes, het genereren van cel-agro-constructen en het implanteren van deze constructen in kraakbeendefecten. Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om mesenchymale stamcellen niet-invasief te volgen met magnetic resonance imaging. Laten we beginnen.Om te beginnen worden de cellen ten minste 18 uur voor de labeling gegroeid tot een confluentie van 80%. Bereid tijdens deze tijd het labelingsmedium voor, zodat dit klaar is voor gebruik zodra de cellen confluent zijn. Voeg hiervoor end durum toe aan het monster in een dosis van 100 µg ijzer per mL serumvrij medium.Nadat de cellen tot confluentie zijn gegroeid, wordt het cultuurmedium afgezogen en worden de cellen gewassen met PBS of serumvrij medium. Zuig vervolgens de spoeloplossing af en voeg het bereide labelingsmedium toe. Incubeer de cellen vier uur lang bij 37 °C en 5% koolstofdioxide.Zuig na de incubatie van vier uur het labelingsmedium af. Spoel de cellen met PBS en voeg vervolgens trypsine toe. Zodra de cellen zijn losgekomen, was je de cellen drie keer met PBS en centrifugeer je ze vijf minuten lang bij 400 RCF.Na deze wasstap worden de cellen geresuspendeerd, geteld en gecontroleerd op viabiliteit, om ze vervolgens naar behoefte te gebruiken voor experimenten. Laten we nu bekijken hoe matrix-geassocieerde stamcelimplantaten worden gemaakt. Begin met het bereiden van een verse agar-oplossing.Zodra de agaroos is afgekoeld tot 42 °C, telt u de cellen en centrifugeert u deze in een 1,5 ml Eppendorf-buis. Verwijder na centrifugatie het supernatant en meng de cellen met DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) om een concentratie van 30 × 10⁶ cellen per ml te bereiken. Voordat u de cellen met de warme agaroos mengt, warmt u de pipetpunt voor door warme, steriele PBS op en neer te pipetteren. Dit voorkomt dat de agaroos in de punt stolt.Neem vervolgens hetzelfde volume agarose als medium en meng dit grondig met de celsuspensie in medium, waarbij u erop let dat er geen bellen ontstaan. Houd de Eppendorf-buis tijdens het mengen in een voorverwarmd waterbad, zodat de agarose niet voldoende afkoelt om te stollen wanneer de suspensie homogeen is. De cellen worden in het defect geïmplanteerd en zijn nu klaar voor MR-beeldvorming.Nu tonen we u enkele representatieve resultaten, eerst van onze labelingstechniek en daarna van onze implantatietechniek. Na de labeling hebben de cellen in de flessen nog steeds hetzelfde uiterlijk als de niet-gelabelde cellen. Zoals verwacht is de levensvatbaarheid van de gelabelde cellen ongewijzigd, zoals aangetoond door de Caspase drie-test.De combinatie van gelabelde cellen met agros leidt tot een signaalverlies in de implantaten, zoals te zien is in T2-gewogen MR-beelden; niet-gelabelde cellen vertonen geen signaal. Doorsneden van de cel-agros-constructen zijn gekleurd met Pruisisch blauw. Bevestig de intracellulaire ijzeraccumulatie.We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u mesenchymale stamcellen kunt labelen met ijzeroxide-nanodeeltjes, hoe u hydrogelconstructen met de gelabelde cellen kunt maken en hoe u deze in kraakbeendefecten kunt implanteren. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat u de pipetpunt vooraf moet voorverwarmen voordat u warme hydrogel aan de celsuspensie toevoegt.Het is daarnaast cruciaal voor Mr.Imaging om de vorming van luchtbellen te vermijden. Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

implantation-ferumoxides-labeled-human-mesenchymal-stem-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Voor de evaluatie van nieuwe stamcellen therapieën is het belangrijk om niet-invasief spoor de geïnjecteerde cellen in vivo. Deze video toont u hoe de menselijke mesenchymale en embryonale stamcellen met ijzeroxide gebaseerde contrastmiddelen label in vivo voor latere MR imaging in vivo.

Etikettering hESC &#39;s en hMSCs met ijzeroxide nanodeeltjes voor niet-invasieve in vivo Tracking met MR Imaging

Menselijke perivasculaire stamcellen (PSC's) zijn een nieuwe stamcel klasse voor het skelet weefselregeneratie vergelijkbaar met mesenchymale stamcellen (MSC's). PSC's kunnen worden geïsoleerd door FACS (fluorescentie geactiveerde cel sortering) uit vetweefsel verkregen tijdens standaard liposuctie procedures, dan gecombineerd met een osteoinductief steiger om botvorming te...

Gebruik van de Mens Perivasculaire stamcellen voor botregeneratie

We beschrijven een techniek voor etikettering en het bijhouden van stamcellen met FDA-goedgekeurde, superparamagnetische ijzeroxide (SPIO), ferumoxytol (Feraheme). Deze cellulaire beeldvorming techniek die magnetische resonantie (MR) beeldvorming maakt gebruik van voor visualisatie, is gemakkelijk toegankelijk voor de lange termijn monitoring en diagnose van succesvolle of mislukte stamcellen engraftments bij patiënten.

Labeling stamcellen met Ferumoxytol, een FDA-goedgekeurd ijzeroxide Nanodeeltje

Een experimentele techniek voor de behandeling van chondrale defecten in het konijn kniegewricht beschreven. De implantatie van autologe chondrocyten geënt op een matrix is ​​een algemeen aanvaarde methode voor het verbouwen en herstel van gewrichtskraakbeen letsels leveren bevredigende resultaten op lange termijn. Matrix-bijgestaan ​​autologe chondrocyten transplantatie (MACT) biedt een gestandaardiseerd en klinisch vastgestelde implantatie methode.

Matrix-bijgestaan ​​autologe chondrocyten transplantatie voor Renovatie en de reparatie van chondrale Gebreken in een konijn model

Een experimentele techniek voor de behandeling van osteochondrale defecten in het konijn kniegewricht beschreven. De implantatie van allogene mesenchymale stamcellen in osteochondrale defecten heeft een veelbelovende ontwikkeling op het gebied van weefsel engineering. De voorbereiding van...

Behandeling van Osteochondrale Defecten in de Rabbit&#39;s kniegewricht door Implantatie van Allogeneic mesenchymale stamcellen in fibrinestolsels

Het kweken van menselijke mesenchymale stromale cellen (hMSCs) met autologe serum, vermindert het risico op afwijzing door xenogene materiaal en andere negatieve effecten. Het staat ook voor het herstel van een subset van mesodermale voorlopercellen, die een frisse hMSCs kan leveren. Inbedding hMSCs in een autoloog fibrinestolsel maakt een eenvoudige bediening en effectieve chirurgische implantatie.

Mesenchymale stromale Cell Cultuur en Levering in autologe Voorwaarden: een slimme aanpak voor orthopedische toepassingen

Chondrogenese uit stamcellen vereist fine tuning van de kweekomstandigheden. Hier presenteren we een magnetische aanpak voor het condenseren van cellen, een essentiële stap om chondrogenese te initiëren. Bovendien tonen wij aan dat dynamische rijping in een bioreactor zijn mechanische stimulatie van de cellulaire constructen en verbetert kraakbeenachtige extracellulaire matrix productie.

3D Magnetic Stem Cell Samenvoeging en Bioreactor rijping voor het herstel van kraakbeen

Dit protocol beschrijft een efficiënte manier om te controleren de cel persistentie en ook menselijke adipeus afkomstige mesenchymale stamcellen (haMSCs) door far-red fluorescentie labeling in een rat knie artrose (KOA) model via intra-articulaire (IA) injectie.

In Vivo Bijhouden van menselijke adipeus afkomstige mesenchymale stamcellen in een Rat knie artrose Model met fluorescerende lipofiele membraan kleurstof

Gepresenteerd hier is een protocol voor niet-invasieve mesenchymale stamcel (MSC) levering en tracking in een muismodel van traumatisch hersenletsel. Superparamagnetische ijzeroxide nanodeeltjes worden gebruikt als een magnetische resonantie imaging (MRI) sonde voor MSC labeling en niet-invasieve in vivo tracking na intranasale levering met behulp van real-time MRI.

Het volgen van superparamagnetische ijzer oxide-gelabelde mesenchymale stamcellen met behulp van MRI na intranasale levering in een traumatisch hersenletsel Murine model

Bottherapie via endochondrale ossificatie door het implanteren van kunstmatig kraakbeenweefsel geproduceerd uit mesenchymale stamcellen heeft het potentieel om de nadelen van conventionele therapieën te omzeilen. Hyaluronzuurhydrogels zijn effectief bij het opschalen van uniform gedifferentieerde kraakbeentransplantaten en bij het creëren van geïntegreerd bot met vascularisatie tussen gefuseerde transplantaten in vivo.

Geïntegreerde botvorming door in vivo endochondrale ossificatie met behulp van mesenchymale stamcellen

Hier presenteren we een geïntegreerd protocol voor het genereren van gecontroleerde osteochondrale laesies in schapenknieën om een experimenteel model op te zetten dat geschikt is voor studies naar bot- en kraakbeenweefselregeneratie. Het protocol beschrijft een methode om een osteochondrale defect van volledige dikte in de femorale condyl te induceren, met technieken die de impact op het dierenwelzijn en variabiliteit in resultaten minimaliseren.

Opstel en evaluatie van een schapenmodel van een volledig dikte osteochondrale defect

Leer een reproduceerbare methode voor matrix-geassocieerde stamcelimplantaten in kraakbeenletsels met Ferumoxides-labeling en 7T-MR-visualisatie. Deze techniek ondersteunt niet-invasieve tracking van humane mesenchymale stamcellen.

Implantatie van Ferumoxides Gelabelde humane mesenchymale stamcellen in kraakbeenletsels

Meer video's verkennen