Met behulp van de GELFREE 8100 Fractionering System for Molecular Weight-Based Fractionering met Liquid Phase Recovery
3 december 2009
De bijhorende video beschrijft het gebruik van de GELFREE 8100 Fractionation System, welke partities complex eiwit monsters op basis van moleculair gewicht en herstelt de fracties in de vloeibare fase. De video beschrijft hoe de technologie werkt, hoe het wordt gebruikt, en biedt resulterende data, met polyacrylamidegelelektroforese analyse van gefractioneerde runderen leverhomogenaat.
Hoi, mijn naam is Jay Harkins. Ik ben onderzoekswetenschapper bij Protein Discovery. Vandaag zal ik demonstreren hoe eenvoudig het is om het nieuwe gel free 8, 100 Fractionatiesysteem te gebruiken om molecuulgewicht-gebaseerde fractionering met een hoog herstel te bereiken.
Met GelFree kunt u tot één milligram totaal eiwit per kanaal laden en tot acht monsters reproduceerbaar fractioneren in ongeveer 90 minuten. Het systeem bevat een instrument, een wegwerpcartridge en alle buffers die nodig zijn om het experiment uit te voeren. Laten we beginnen.
Begin deze procedure door maximaal acht 500 µL buisjes voor te bereiden en te labelen. Voeg tot 1 mg van het eiwitmonster toe in een volume van maximaal 112 µL. De hoeveelheid eiwit in het monster hangt af van de complexiteit van het monster.
Voor complexere monsters, zoals het weefselhomogenaat dat voor deze demonstratie wordt gebruikt, leveren 150 tot 200 µg per kanaal de beste resultaten. Voeg vervolgens 30 µL toe van de vijf x monsterbuffer, die is inbegrepen in de gel-vrije cartridgekit. Voeg aan elk eiwitmonster acht µL van één molar DTT toe.
Vul vervolgens elk monster aan met water tot een eindvolume van 150 µL. Verhit de vials daarna vijf minuten bij 95 °C om het monster te denatureren. Laat de verhitte monsters afkoelen tot kamertemperatuur terwijl ze afkoelen.
Verwijder de gel free 8, 100 cartridge uit de folieverpakking. Verwijder de plaatafdichting en gooi deze weg. Verwijder de bewaarbuffer uit de compartimenten van de cartridge met een pipet.
Indien alle acht kamers van de cartridge worden gebruikt, wordt de cartridge omgekeerd om de bewaarbuffer uit de compartimenten te laten weglopen. Vervolgens worden acht milliliters gel-vrije loopbuffer toegevoegd aan elk van de anodebufferreservoirs. Zes milliliters wordt toegevoegd aan elk van de kathodebufferreservoirs, en 100 microliters wordt gepipetteerd in elk van de opvangkamers.
Verwijder met een achtkanalige pipet van 100 tot 200 µL alle buffer die vanuit het kathodebufferreservoir in de monsterlaadkamer is gestroomd en breng direct daarna de monsters in de laadkamers aan. Plaats de cartridge, zodra de monsters zijn geladen, in het GelFree 8-100 fractionatiestation. Laat vervolgens de elektrodearrays zakken en sluit het deksel; gebruik hiervoor de eenvoudig te programmeren grafische gebruikersinterface op het touchscreen van het instrument en ga naar de lijst met beschikbare voorgeprogrammeerde methoden.
Selecteer de juiste methode door op de methodeknop te drukken. Druk op de ophaalknop en voer het nummer van de gewenste voorgeprogrammeerde methode in. Druk met het schermtoetsenbord op oké. Druk vervolgens op de toepassingsknop.
De toegepaste methode verschijnt onderaan het hoofdscherm. Elke voorgeprogrammeerde methode bestaat uit ingestelde voltages en tijdsgebaseerde pauzes die bedoeld zijn om eiwitten binnen een specifiek bereik van molecuulgewichten te scheiden. Zodra de juiste methode is geselecteerd, drukt u op de kanaalknop op het hoofdscherm.
Select vervolgens de kanalen die tijdens de run gebruikt zullen worden. Om alle acht kanalen te selecteren, drukt u op 'selecteer alles'. Druk daarna op 'klaar'.
Om terug te keren naar het hoofdscherm, zorg ervoor dat het veiligheidsdeksel gesloten is en datHet indicatielampje onderaan het scherm groen is. Druk nu op start om het experiment te beginnen; terwijl het systeem draait, geven de cirkels in het vak aan de linkerkant van het scherm de status van elk kanaal weer. Een groene cirkel geeft aan dat het kanaal actief is.
De aangelegde voltages en stromen worden rechts van de statuscirkels van het kanaal weergegeven. De gel free 8, 100 zal automatisch pauzeren voor fractiecollectie volgens het in de methode opgegeven interval. Wanneer het instrument is gepauzeerd om fracties te verzamelen, verschijnt er een tekstvak waarin wordt gemeld dat er een pauze is opgetreden en de statuscirkels worden geel.
Binnen de cartridge wordt een constante spanning aangelegd tussen de anode- en kathodereservoirs. Onder dit potentiaal wordt het eiwitmengsel elektroforetisch vanuit de laadkamer in de speciaal ontworpen precisiegietvorm gedreven. Eiwitten stapelen zich eerst op in een scherpe band in de stapelgel en worden vervolgens gescheiden op basis van hun respectievelijke molecuulgewichten in de scheidingsgel.
Terwijl eiwitten uit de gel elueren, worden ze opgevangen en geconcentreerd in de vloeistoffase in de opvangkamer, vrij van gel. Het instrument wordt vervolgens gepauzeerd.
Op basis van vooraf geselecteerde tijdsintervallen worden fracties verzameld met behulp van een pipet. Vervolgens wordt het potentiaal opnieuw aangelegd om de tweede molecuulgewichtsfractie van belang in te sluiten. Dit proces wordt herhaald totdat alle gewenste fracties zijn verzameld.
Elke cartridge bevat acht onafhankelijke elektroforetische kanalen, zodat de gebruiker zoveel kanalen kan gebruiken als nodig is en de ongebruikte kanalen kan bewaren voor later gebruik. Om de fracties te verwijderen, opent u het instrumentdeksel en gebruikt u de ingebouwde kanaalpipet. Draag de 150 microliters vloeistof in elke opvangkamer over naar opvangbuisjes of een multi-well plaat.
Zodra de fracties zijn verwijderd, wordt de opvangkamer tweemaal gewassen met gelvrije loopbuffer door 100 µL per kanaal toe te voegen en tweemaal op en neer te pipetteren. Voeg na het wassen 100 µL gelvrije loopbuffer opnieuw toe aan de opvangkamers. Sluit het deksel en druk op de hervatknop.
De gel free 8, 100 zal doorlopen tot het volgende tijdsinterval. De totale resterende tijd van het experiment wordt aan de rechterkant van het scherm weergegeven. Druk op de knop boven het vak met de tijd om te schakelen tussen de resterende tijd, de verstreken tijd en de pauzeknop.
Zodra alle fracties zijn verzameld, kunnen ze onmiddellijk worden gebruikt voor verdere downstream-preparatie, zoals isoelektrische focusering of gelelektroforese, of voor analyse met vloeistofchromatografie, massaspectrometrie of immuno-affiniteit. In deze demonstratie werden acht eiwitmonsters van elk 200 micrograms verdeeld over elk 12 fracties, wat een totaal van 96 fracties opleverde. Om de resultaten van de fractionering te visualiseren, werd een aliquot van elk van de 12 fracties uit het runderleverhomogenaatmonster vervolgens op een standaard 1D-gel geladen en zilvergekleurd.
Zoals in deze figuur wordt getoond, is het eiwitmonster gefractioneerd in 12 afzonderlijke fracties over het molecuulgewichtsbereik van 3,5 kilodalton tot 150 kilodalton. De hier getoonde gel benadrukt het vermogen van het gel-vrije 8, 100-systeem om een grote hoeveelheid eiwit te fractioneren in afzonderlijke molecuulgewichtsfracties. Dit is een ongelooflijk krachtig instrument voor top-down en bottom-up proteomics met behulp van massaspectrometrie, evenals voor immunoaffiniteitsexperimenten waarbij een enkele gezuiverde intacte eiwitmolecuulgewichtsfractie vereist is.
Het was een genoegen om u te laten zien hoe eenvoudig het is om het GelFree-8- en GelFree-100-fractioneringsysteem te gebruiken om uw monster reproduceerbaar te verdelen in discrete fracties op basis van molecuulgewicht en een hoge herstelgraad van de vloeibare fase te bereiken. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.
Overzicht
Deze video demonstreert het GELFREE 8100 Fractionatiesysteem, dat complexe eiwitmonsters efficiënt scheidt op basis van molecuulgewicht. Het proces maakt een hoge terugwinning van fracties in vloeibare fase mogelijk, wat verdere analyse vergemakkelijkt.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Eiwitfractionering
- Elektroforese
- Biochemische analyse
Achtergrond
- Het GELFREE 8100-systeem is ontworpen voor high-throughput eiwitanalyse.
- Het maakt de scheiding van eiwitten mogelijk zonder gebruik van gels.
- Deze methode is bijzonder nuttig voor complexe monsters, zoals weefselhomogenaten.
- Efficiënte fractionering kan downstream-applicaties verbeteren.
Doel van de studie
- Om de functionaliteit van het GELFREE 8100 fractioneringssysteem te presenteren.
- Om het gebruiksgemak en de efficiëntie van het systeem aan te tonen.
- Om inzicht te verschaffen in het fractioneringsproces en de resulterende gegevens.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van eiwitmonsters met specifieke buffers.
- Gebruik van een wegwerpcartridge voor fractionering.
- Elektroforetische scheiding op basis van molecuulgewicht.
- Opvang van fracties voor verdere analyse.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle partitionering van eiwitmonsters in meerdere fracties.
- Aantoonbare reproduceerbaarheid en efficiëntie bij de fractieopvang.
- Visuele resultaten van polyacrylamidegelelektroforese-analyse.
- Potentieel voor directe downstream-toepassingen in de analyse.
Conclusies
- Het GELFREE 8100-systeem biedt een betrouwbare methode voor eiwitfractionering.
- Het vereenvoudigt de workflow voor onderzoekers in eiwitanalyse.
- De technologie verbetert het vermogen om complexe eiwitmengsels te analyseren.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Het GELFREE 8100 Fractionatiesysteem maakt eiwitseparatie op basis van molecuulgewicht met een hoge recovery in vloeibare fase mogelijk, waardoor gel-afhankelijke stappen worden geëlimineerd en de reproduceerbaarheid wordt verbeterd. Deze functionaliteit ondersteunt workflows voor vroege ontdekking door gezuiverde fracties te genereren voor downstream proteomische analyse, wat de technische variabiliteit bij targetvalidatie en assayontwikkeling vermindert. Het gemultiplexte, cartridge-gebaseerde ontwerp maakt parallelle verwerking van maximaal acht monsters mogelijk, wat de doorvoer bij leadidentificatie en inspanningen voor mechanistische de-risking verhoogt.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door intacte proteïnefracties over een breed molecuulgewichtbereik te isoleren.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door reproduceerbare fractionering van complexe monsters, zoals weefselhomogenaten.
- Voorspellende waarde: Genereert gezuiverde fracties die het vertrouwen in target engagement en pathway-analyse vergroten.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert vloeibare fracties op die compatibel zijn met downstream-assays zoals massaspectrometrie en immunoaffiniteitsvastlegging.
- Operationele waarde: Elimineert stappen voor gel-excisie, waardoor de standaardisatie toeneemt en de handmatige tijd wordt verminderd.
- Schaalbaarheid: Maakt de preparatie van gestandaardiseerde fractiebibliotheken mogelijk voor screeningscampagnes.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: De fractie-outputs behouden hun fysisch-chemische eigenschappen, wat de uitlijning van biomarkers in preklinische modellen ondersteunt.
- Mechanistische risicoreductie: Faciliteert de correlatie van fracties met een specifiek molecuulgewicht met functionele activiteit in ziekte-relevante systemen.
- Portfolio-triage: Maakt risico-gecorrigeerde voortgang mogelijk door proteoformen te isoleren voor functionele validatie.
Integratie van Pipeline & Workflow
Het systeem past binnen het ontdekkingscontinuüm van hypothesetoetsing tot lead-identificatie en levert fractioneringsoutputs die dienen als input voor analytische en functionele validatieworkflows.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetesten door complexe mengsels op te splitsen in discrete fracties op basis van molecuulgewicht.
- Screening: Genereert assay-klare fracties met een hoog herstel en een goede reproduceerbaarheid voor het screenen van verbindingen.
- Analytica: Levert kwantitatieve outputs in vloeibare fase die geschikt zijn voor LC-MS en western blot-analyse.
- Translationeel onderzoek: Verbindt fundamentele ontdekkingen met preklinisch werk door de proteinintegriteit voor functionele assays te behouden.
- Bedrijfsvoering en hergebruik: Het ontwerp op basis van cartridges maakt het mogelijk om ongebruikte kanalen op te slaan voor toekomstige runs, wat de efficiëntie van middelen bevordert.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid door hoogwaardige scheiding van molecuulgewichten en verminderd monsterverlies.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en eliminatie van variabiliteit door gelering.
- Strategische waarde: Verbeterde go/no-go-beslissingen via betrouwbare fractioneringsgegevens en lagere technische faalpercentages.
- Impact op portfolio: Maakt prioritering van targets mogelijk op basis van fractiespecifieke functionele gegevens.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de preparatie van eiwitmonsters en de principes van elektroforetische scheiding.
- Afhankelijk van toegang tot het GELFREE 8100-instrument en de bijbehorende gepatenteerde cartridges en buffers.
- Vereist gestandaardiseerde protocollen voor het laden van monsters, het aanleggen van voltage en de timing van de fractieopvang.
- Overwegingen voor aanpassing aan verschillende monstertypes (bijv. serum, cellysaten, weefselhomogenaten).
- Praktische beperking: De fractieresolutie wordt beperkt door vooraf gedefinieerde tijdsgebaseerde pauzes in de methode, waardoor methode-optimalisatie noodzakelijk is voor nieuwe massabereiken.
