Het beoordelen van twee-dimensionale Kristallisatie Trials van kleine membraaneiwitten voor Structurele Biologie Studies van Electron Kristallografie

Het algemene doel van deze procedure is om de meest optimale 2D-kristallisatieomstandigheden te identificeren voor de gestructureerde bepaling van membraaneiwitten door middel van elektronenkristallografie. Dit wordt bereikt door eerst een compatibel detergent te gebruiken tijdens de zuivering om het eiwit uit de native lipide dubbellaag te solubiliseren. De tweede stap van de procedure is het toevoegen van exogeen lipide en het verwijderen van detergent via dialyse van het eiwit-lipide-detergent mengsel, resulterend in 2D-kristallen onder zorgvuldig gecontroleerde omstandigheden.

De derde stap van de procedure is om de monsters in een glazen toestand te flashvriezen. De laatste stap van de procedure is om gegevens te verzamelen door cryo em. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de uiteindelijke structuur van het eiwit opleveren door middel van computationele beeldverwerking van de gegevens.

Hallo, ik kom uit het laboratorium. Ik studeer aan de School of Biology aan het Georgia Institute of Technology. Hallo, ik ben Tina Dreaded.

Ik kom van het Berry Lab in de school voor Chemie en Biochemie en het Schmidt Kray Lab in de school voor Biologie aan het Georgia Institute of Technology. En ik ben Matt Johnson van het laboratorium van Ingleborg Schmidt Cry in de school voor Biologie aan het Georgia Institute of Technology. Vandaag laten we u een procedure zien voor het beoordelen van 2D-koorde-atieproeven door em.

We gebruiken dit protocol in ons laboratorium om 2D-kristallisatieomstandigheden te identificeren en te optimaliseren. Dus laten we beginnen. Om deze procedure te starten, worden negatief gekleurde monsters op koolstof bekleed 400 mesh koper transmissie-elektronenmicroscopie of TEM-rasters bereid. Pipetteer twee microliter van het protea-liposoom monster onder een koolstof bedekt TEM-raster en incubeer gedurende 60 seconden.

Als het monster zich niet gelijkmatig verspreidt, veegt u het voorzichtig met de zijkant van de pipettepunt. Blokkeer vervolgens vanaf de rand met een gescheurd stuk watman Nummer vier filterpapier. Dit zorgt voor een optimale verwijdering van vloeistof zonder overmatige verwijdering van protea-liposomen, en helpt om de delicate koolstoffilm te behouden.

Direct na het blotten. Breng twee microliter van de 1% urinal-acetaatkleur na 30 seconden aan, blok vanaf de rand van het raster. Nogmaals, als het monster hoge concentraties van viskeus glycerol of sucrose bevat, typisch in het bereik van 10 tot 20%, kan meerdere cycli van wassen van het raster met een glycerol- of sucrosevrij buffer voorafgaand aan negatieve kleuring nuttig zijn om een goede kleuring met de urinal-taat oplossing mogelijk te maken.

Eenmaal de rasters zijn voorbereid, wordt elektronenmicroscopie gebruikt om het monster bij lage vergroting te visualiseren om de membraanvoorkomenverdeling en morfologie en algemene rasterkwaliteit te beoordelen. Vervolgens wordt hoge vergroting gebruikt om beelden te verkrijgen en RIA-transformaties van de beelden uit te voeren om 2D-kristallen te identificeren. Om te beginnen, plaats het raster laag in de elektromicroscoopmonsterhouder, om een eerste indruk te krijgen van de gemiddelde membraanverdeling, gebruik een tussenliggende vergroting van 2000 tot 10.000 x.

Noteer de mate van verdeling van membranen, hun morfologie en grootte in een laboratoriumnotitieboekje. Neem representatieve views op met een CCD-camera. Bekijk vervolgens, indien nodig, de monsters met lage vergroting in het bereik van ongeveer 400 tot 800 x om een overzicht van de rasters te krijgen.

Dit kan waardevolle informatie opleveren om de rastervoorbereiding te evalueren door problemen met monsterconcentratie, ongelijke protea-liposoomverdeling en gedeeltelijke breuk van koolstoffilm te onthullen. Identificeer een rastergebied van belang bij lage of tussenliggende vergroting. Gebruik vervolgens hoge vergroting om mogelijke orde in verschillende membranen te evalueren.

Dit is cruciaal in de vroege stadia van 2D-kristallisatieproeven. Om veelbelovende protea-liposomen met goed geordende gebieden te identificeren en om de reproduceerbaarheid tijdens latere experimenten te verifiëren, om de optimale hoge vergrotingsinstelling voor het screenen van 2D-kristallen te bepalen, begint u met een vergroting tussen 50.000 en 60.000 x. Afhankelijk van de 2D-kristaldimensies en eenheidscelgrootte, kan de hoge vergrotingsinstelling worden verlaagd tot zo laag als 30.000 of verhoogd tot 80.000.

Hier op een aangrenzende locatie naast het beeldgebied van belang, defocussen we met ongeveer min 400 nanometer of hoger als er onzekerheid is of het gebied van belang inderdaad een membraan is. Inspecteer het monster op stukken koolstoffilm MICA of andere artefacten die zouden kunnen worden aangezien voor protea-liposomen. Observeer ook de randen om typische membraanvouwing en morfologie te onderscheiden.

Inspecteer vervolgens het gebied van belang met een CCD-camera. Door een CCD-beeld te verzamelen bij de optimale hoge vergrotingsinstelling, kan het rooster van een kleiner en/of meestal hydrofoob membraaneiwit niet waarneembaar zijn door visuele beoordeling van het CCD-beeld zelf. In dit geval wordt het hele beeld gebruikt voor een online foertransformatie of ft.

Echter, als het geordende array klein is, zal deze FT een significante hoeveelheid ruis bevatten om de signaal-ruisverhouding te verbeteren, verkleine de beeldgrootte van de doos, verplaats de verkleinede doos over het beeld en voer een live ft uit, pas de gammafunctie van de live FT aan voor optimale identificatie van geordende arrays. Een te hoge gammawaarde kan vlekken verdoezelen vanwege ruisbijdragen, terwijl een te lage waarde zwakkere vlekken kan voorkomen. Verwacht de resolutie van de negatief gekleurde 2D-kristallen om ongeveer 15 angstrom te zijn bij een DFO van min 400 nanometer.

Verwacht één tot drie ordes van vlekken te identificeren. Noteer de scherpte van de vlekken en eventuele mozaïek. 2D-kristallen van een klein 18 kilodalton membraaneiwit zijn tot enkele micrometer groot.

Vlekken op de FTS scherp en gemakkelijk geïdentificeerd. Beweging van de live FT-box toont aan dat het rooster continu is zonder mozaïek. Het rooster van een groter