Borstklieren Epitheliale Transplant Procedure

Deze video demonstreert procedures om mamma-epitheel te oogsten, het mammavetkussen te legen en exogeen epitheel te transplanteren om de ontwikkeling van de mamma te bestuderen in muizen van drie weken oud, waarbij de groei van de mamma-epitheliale boom beperkt is tot de nabijheid van de tepel en het vetkussen grotendeels verstoken is van mamma-epitheel. Naarmate de muis volwassen wordt, groeit de epitheliale boom door het vetkussen heen.

Tegen de leeftijd van zeven weken strekt de epitheliale ductale boom zich uit over het gehele vetkussen. Als het kleine deel van het vetkussen dat epitheel bevat op drie weken leeftijd wordt verwijderd, zal het endogene epitheel het geheugenvetkussen nooit meer bevolken; het vetkussen wordt dan als geklaard beschreven en blijft dat tot aan de volwassenheid. Getransplanteerd donorgeheugen, epitheel of epitheliale cellen hebben echter het potentieel om geheugenductale bomen uit te breiden door de geklaarde gastheer.

Vetkussentje. Histologie kan vervolgens worden gebruikt om de voortgang van de geheugenontwikkeling in getransplanteerde weefsels van transgene of testdieren te monitoren. Hallo, mijn naam is Joseph Jerry en ik ben verbonden aan de afdeling Veterinary and Animal Sciences aan de University of Massachusetts.

Hoi, mijn naam is Karen Dunphy. Ik werk in het Jerry Lab. Vandaag gaan we een transplantatie van mammaire epitheelcellen uitvoeren.

We gebruiken deze procedure om de moleculaire en cellulaire basis voor de genese van mammaire tumoren en een model voor borstkanker te bestuderen. Laten we beginnen. De eerste stap van de transplantatieprocedure is het oogsten van mammair epitheelweefsel van de donormuis.

Begin met het wassen van een recent geëuthanaseerde vrouwelijke muis met 70% ethanol zonder de membranen van de SRU's in de ventrale lichaamsholte te doorboren. Maak een mid-sagittale incisie door de huid, uitstrekkend van het schaambeen tot het borstbeen. Maak vervolgens een schuine snede vanaf de initiële incisie bij het schaambeen in de richting van elk achterbeen.

Pak de membranen van de SRU vast met gebogen pincetten. Pak vervolgens met rechte gekartelde pincetten de gesneden rand van de huid vast en pel de lichaamswand voorzichtig weg van de S cs-membranen.

Om de vierde inguinale memory-klier aan de onderzijde van de lichaamswand bloot te leggen, moet de lymfeklier binnen de memory-klier worden gelokaliseerd; deze bevindt zich op het kruispunt van drie prominente bloedvaten in de memory-klier en is voelbaar als een dichte knop in het vetkussen. Knip met de punt van een oogschaartje het vetweefsel rondom de lymfeklier weg. Zet vervolgens met de wijsvinger druk op de epidermale zijde van de huid om de klier uit het vetkussen omhoog te duwen en knijp deze vervolgens los.

Verwijder de lymfeklier met een gebogen pincet. Houd nu de randen van de huid vast. Pak het vetkussen van de melkklier vast met de gebogen zijde van een gebogen pincet en pel het vetkussen geleidelijk los van de lichaamswand. Verwijder de volledige melkklier in één stuk door de richting van het vetkussen naar het dorsale oppervlak van de muis te volgen.

Plaats de geheugenklier op een steriel plastic snijblok met een kleine hoeveelheid medium, ongeveer 200 microliters op het oppervlak van de klier om deze vochtig te houden. Hak de klier vervolgens met een nieuw scheermesje in stukjes van één millimeter. Verdeel de fijngehakte klier in vier porties.

Verdeel de cellen vervolgens met een pincet over vier cryovials met invriesmedium. Plaats de cryovials in een Nalgene celvrieshouder met 250 milliliters isopropylalcohol in het buitenste compartiment. Plaats de celvrieshouder vervolgens gedurende 24 uur bij minus 70 degrees Celsius.

Breng na 24 uur de ingevroren vials met geheugenfragmenten over naar vloeibare stikstof tot ze nodig zijn voor transplantatie. Elk cryovial bevat voldoende fragmenten van de geheugenklier om te transplanteren in de vrijgemaakte vetkussens van vier tot acht gastmuizen. Nadat de diepte van de anesthesie van een drie weken oude gastmuis is geverifieerd door middel van een teenknijptest, wordt de muis stevig vastgezet op een chirurgische tafel met de ventrale zijde naar boven en de ledematen uitgestrekt, zodat de buikwand gespannen is.

Een preoperatief analgeticum, bupivacaïne of buprenorfine, dient subcutaan te worden toegediend. Desinfecteer het operatiegebied met alcohol en een scrub op basis van jodium met behulp van een pincet. Pak de huid enkele millimeters boven het bekken vast en til deze op van de buikwand.

Knip de huid voorzichtig in, waarbij u erop let dat de initiële incisie niet te dicht bij de urethra ligt, omdat de plaatsing van wondclips het vermogen van de muis om te urineren kan belemmeren. Maak vervolgens een midsagittale snede door de huid, uitstrekkend van het schaambeen tot het borstbeen, terwijl u er zorg voor draagt de membranen van de SRU's niet te doorboren.

Maak nu vanaf de initiële incisie schuine sneden door de huid vanaf de middellijn over het bekken in de richting van elk achterbeen. Grijp met gebogen pincetten voorzichtig de S ceros membranen van de ventrale lichaamswand vast. Gebruik vervolgens weefselpincetten om de gesnedene rand van de huid vast te pakken en trek de lichaamswand weg van de ceros membranen.

Om de vierde inguinale geheugenkliertje bloot te leggen, identificeert u het vierde geheugenkliertje. Identificeer het vijfde geheugenkliertje, cauteriseer de tepelknooppunt en de twee arteriën die naar de knoop leiden. Scheid het vierde en vijfde kliertje, en cauteriseer vervolgens de rand van het vijfde kliertje.

Knip vervolgens met een schaar door het vetkussentje net ventraal van de lymfeklier om het vetkussentje van de vierde geheugenkliert te scheiden. Pak het ventrale gedeelte van het vetkussentje stevig vast met gebogen pincetten en trek het weg van de lichaamswand. Het is raadzaam om het uitgesneden weefsel in één stuk tussen twee gelabelde objectglazen te persen en te fixeren in Carnoy-fixatief.

Vervolgens kan het weefsel worden gekleurd, gemonteerd en beoordeeld op heldere marges. Verwijder met een pincet alle resten van de geheugenklier rond het gebied van het verwijderde deel van het vetkussen. Het dier is nu klaar voor weefsel- of celtransplantatie.

Vers of flash-frozen donor-epitheelweefsel kan worden getransplanteerd in het geklaarde vetkussen. Alternatief kunnen geïmmortaliseerde epitheliale cellijnen, tumorcellijnen of primaire cellen worden getransplanteerd. Voor details over de celpreparatie zie het bijbehorende geschreven protocol voor de transplantatie van de epitheelfragmenten. Voorbereid.

Deze video begint met het ontdooien van een cryovial met epitheel en het overbrengen van de fragmenten naar een Petrischaal met vers medium. Om de DMSO te verdunnen, maakt u met een schaar een pocket in het vrijgemaakte vetkussenepitheel van de recipientmuis. Plaats vervolgens met een pincet een stukje donor-epitheel van één millimeter in de pocket.

Indien nodig, houd de pocket gesloten met weefselpincetten en trek de naaldpincet terug zodat het weefsel op zijn plaats blijft. Pak de tegenoverliggende huidranden vast. Houd deze samen met een pincet.

Til ze op van de ceros-membranen van de ventrale lichaamsholte en sluit deze met wondklemmen. Gebruik twee klemmen om de midsagittale incisie te sluiten en één klem voor elke schuine incisie. Vermijd indien nodig obstructie van de urethra.

Sluit de openingen in de huid op het kruispunt van de midsagittale en oblique incisies met een hechting. Plaats de muis terug in haar kooi en houd de kooi onder een warmtelamp tot de muis volledig is bijgekomen. De wondclips dienen na twee weken te worden verwijderd.

De volgende dia's tonen representatieve beelden van wat men kan verwachten in de geheugenklier van de gastheer na het verwijderen van het gevoede vetkussen en het transplanteren van het epitheel; deze afbeelding toont het endogene geheugenepitheel dat is verwijderd uit een drie weken oude muis. Let bij de procedure voor het vrijmaken van de klier op de heldere marges bij de snijrand. Na elke procedure dient een whole-mount preparaat zoals dit te worden gemaakt om de vrijgemaakte marges te beoordelen.

Deze afbeelding toont het geklaarde vetkussen van de muis zeven weken na de klaringsprocedure. Let op dat het gehele vetkussen vrij is van memory-epitheel, hematine en asine. Kleuring van een geklaard vetkussen zeven weken na de klaringsprocedure laat eveneens zien dat de klier vrij is van memory-epitheel.

Een representatieve whole mount van een geklaarde vetlap die is getransplanteerd met donor-geheugenepitheel van een 10 weken oude muis wordt getoond. Let op dat het getransplanteerde epitheel normale epitheliale ductale bomen, hematine en asin produceerde. Kleuring van een geklaarde vetlap en geheugen.

Een epitheliale transplantatie op dezelfde leeftijd onthult de normale productie van epitheliale ducten vanuit het exogene epitheel. Hier toont hematoxyline- en eosinekleuring van een geklaard vetkussentje een epitheliale transplantatie die is uitgegroeid tot een mammaire tumor. We hebben u zojuist laten zien hoe u mammair epitheel kunt oogsten en hoe u een mammaire epitheliale transplantatie uitvoert.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden de verbindingen tussen de vierde en vijfde klier door te snijden om de knoop en de tepel te cauteriseren, en om alle sporen van endogeen epitheel te verwijderen. U moet ervoor zorgen dat er geen mogelijkheid bestaat dat endogeen epitheel kan uitgroeien in het vrijgemaakte vetkussen. Daarnaast is het raadzaam om het volledige verwijderde gedeelte van de melkklier te bewaren om de vrijgemaakte marges te controleren.

Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.